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摘要
客观的尽管肠道菌群失调越来越被认为是代谢综合征(MetS)的病理生理组成部分，但特定肠道微生物在代谢健康中的作用和作用模式仍不明确。在此之前，我们已经确定了共生的丁原菌Anaerobutyricum soehngenii与改善MetS受试者的胰岛素敏感性相关。在这个概念验证研究中，我们调查了潜在的治疗效果答:soehngeniiL2-7对MetS患者全身代谢反应和十二指肠转录组谱的影响。
设计在这项随机双盲安慰剂对照交叉研究中，12名患有MetS的男性受试者接受十二指肠输注答:soehngenii并接受十二指肠活检、混合餐试验(输注后6小时)和24小时持续血糖监测。
结果答:soehngenii治疗引起了餐后嗜胰岛素激素胰高血糖素样肽1 (GLP-1)的显著升高和血浆二级胆汁酸的升高，这与GLP-1水平呈正相关。此外,答:soehngenii对73个基因的十二指肠表达进行了强有力的塑造，其中再生胰岛蛋白1B (REG1B)编码基因。引人注目的是,十二指肠REG1B表达与GLP-1水平呈正相关，与周围血糖变异性呈负相关，且在24小时后显著降低答:soehngenii的摄入量。从机制上讲，Reg1B的表达是由感知丁酸或细菌肽聚糖诱导的。重要的是,答:soehngenii十二指肠给药安全且耐受性良好。
结论一剂答:soehngenii24小时内改善外周血糖控制;它会特别刺激肠道GLP-1的产生REG1B表达式。需要进一步的研究来阐明REG1B诱导的具体途径和在胰岛素敏感性中的作用。
试验注册号码NTR-NL6630。
- 糖尿病
- 肠道细菌
- 十二指肠粘膜
- 肠道激素
- 基因表达
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本研究的意义
关于这个问题，我们已经知道了什么?
肠道菌群影响宿主代谢适应度，肠道菌群失调与代谢紊乱相关。
肠Anaerobutyricum soehngenii代谢综合征(MetS)受试者胰岛素敏感性增强的水平。
口服答:soehngenii补充L2-7改善糖尿病肥胖db/db小鼠的胰岛素抵抗。
本研究的意义
新的发现是什么?
单剂量十二指肠输注含有答:soehngeniiL2-7足以改善人类MetS的外周糖代谢。
答:soehngeniiL2-7刺激肠促胰岛素激素GLP-1的分泌，据报道，GLP-1对胰岛素分泌和敏感性都有作用。
治疗答:soehngenii特异性上调十二指肠再生胰岛蛋白的表达(注册）1 a / B．
十二指肠REG1B表达与改善血糖控制和GLP-1水平相关。
交付答:soehngenii进入小肠，第一次显示，是安全的和良好的耐受性。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
该研究为肠道微生物如何通过十二指肠信号影响宿主代谢提供了新的见解。
十二指肠多处植入答:soehngenii给药可能是治疗肥胖和2型糖尿病患者胰岛素抵抗的新方法。
简介
与生活方式、饮食和内脏肥胖一样，肠道菌群也是代谢健康的重要调节剂。1越来越多的证据表明，肠道微生物-饮食-宿主相互作用影响宿主代谢稳态2 - 4；特别是，不平衡的肠道微生物群越来越被认为是代谢紊乱的重要风险因素，如肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病(T2D)。3 - 5在对日益增加的心脏代谢疾病负担寻求新的治疗见解的过程中，使用高通量测序的培养独立方法的发展极大地提高了我们对肥胖和T2D微生物特征的认识。6致肥菌群的一般特征包括粪便微生物群落多样性的下降、物种丰富度的收缩和产生短链脂肪酸(SCFA)的微生物的匮乏。7 8尽管如此，具体的细菌菌株调节代谢功能和影响人类代谢障碍的病理生理学的确切机制仍然知之甚少。
为了从关联性转向因果关系，我们之前在人类中进行了重复粪便微生物群移植(fmt)，以深入了解微生物对葡萄糖和脂质代谢的影响。我们证明，从瘦人供体转移健康菌群到代谢综合征(MetS)患者改善了他们的外周胰岛素敏感性3 4并发现后者与增加的相对丰度有关Anaerobutyricumspp,包括Anaerobutyricum soehngenii，在小肠(SI)以下的瘦供体FMTs。3.
答:soehngenii(原分类真细菌hallii) L2-7菌株是一种厌氧革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性细菌，属于厚壁菌门螺杆菌科。9这种菌株能够将糖、乳酸和醋酸盐转化为SCFA丁酸盐，10它被证明对肥胖老鼠和瘦人的葡萄糖代谢有有益的影响，11日12因此强调了肠道的潜在治疗益处答:soehngenii．我们先前描述了口服的功效答:soehngenii补充L2-7改善糖尿病和肥胖db/db小鼠的胰岛素抵抗和能量消耗。13此外，在I/II期安全性和剂量寻找试验中，我们表明每日口服答:soehngeniiL2-7治疗4周是安全的，耐受性良好，并与粪便呈正相关答:soehngeniiL2-7丰度和全身葡萄糖率的处理。14然而，口服菌株的一个主要缺点是由于接触氧气和胃酸而失去活力。因此，在本研究中，选择十二指肠管输注来绕过这个问题，因此，通过将活菌直接输送到SI，最大限度地发挥治疗潜力，SI是在血糖传感、调节外周胰岛素敏感性/分泌和葡萄糖稳态中起核心作用的第一个解剖部位。15
在这方面，在肠道环境中，SI肠内分泌细胞作为饮食来源和微生物来源的代谢物的“化学传感器”，如丁酸盐，并可以通过分泌多种激素，如胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)，调节宿主的葡萄糖代谢，这反过来提高胰岛素的分泌和敏感性。15 - 17日然而，单一菌株对人类肠道内分泌系统的影响仍然难以捉摸。
因此，我们进行了一项随机双盲安慰剂对照交叉试验，以确定单次十二指肠输注的局部和全身效应答:soehngenii患有MetS的男性受试者L2-7。我们的主要目标是描述由答:soehngeniiSI的L2-7转录组谱(输注后6小时)。次要目标是调查的影响答:soehngeniil -7对循环(餐后)肠促素、粪便SCFA率和肠道菌群组成的影响。
结果
基线特性和安全参数
我们包括了15名患有肿瘤的白人treatment-naïve。在试验过程中，3名受试者被排除在外(2名受试者因个人原因筛查后未参与，1名受试者因使用抗生素被排除)，剩下12名受试者进行主要终点分析。基线特征见表1．参与者被随机分配接受10%甘油输注(安慰剂，n=6)或1011细胞的答:soehngeniil -7在10%甘油中(治疗，n=6)作为第一次干预，4周后切换到治疗/安慰剂(图1)．两种输注均耐受性良好，在整个研究过程中均无(严重)不良事件发生。安全实验室参数(炎症、肾脏和肝脏参数)在研究期间都是稳定的。在之后的一周内，能量和大量营养素摄入量没有变化答:soehngeniiL2-7或安慰剂(在线补充表S1)．我们还观察到，在体重、血压、葡萄糖、胰岛素、胰岛素抵抗的稳态模型评估(HOMA-IR)或胆固醇水平方面，安慰剂组和安慰剂组之间没有差异答:soehngeniiL2-7治疗(在线补充表S1)．
研究概述。研究设计示意图，显示了干预和生物采样的时间点:所有12名受试者接受安慰剂(10%甘油在PBS中)或治疗(Anaerobutyricum soehngeniiL2-7)在第0周或第4周(干预交叉时间)。FSL，自由式自由系统;短链脂肪酸。
单剂的答:soehngeniiL2-7对菌群丰富度/多样性和粪便SCFA均无影响
辨别…的影响答:soehngeniiL2-7输注对肠道微生物群落的影响，使用从基线、干预后1天、1周和2周收集的粪便样本中提取的粪便DNA进行16S rRNA基因扩增子测序。一次注入答:soehngenii在干预后的短期(24小时)或长期(2周)，L2-7均未影响肠道菌群组成或α -多样性(Shannon指数)(图2 a, B)．同样，丰富的答:soehngenii通过qPCR评估，粪便样本中的L2-7并没有随着时间的推移发生持久的变化(在线补充图S1)．值得注意的是，这些数据排除了交叉时(第一次干预后4周)微生物群介导的遗留效应。十二指肠答:soehngeniiL2-7水平低于最小检出率，表明给药答:soehngeniiL2-7不在SI上定植，而是通过肠道。
粪便中SCFA的菌群组成。(A)未加权UniFrac距离上的主坐标分析图，显示16S rRNA序列簇。(B)在基线、1天、安慰剂/治疗干预后1周和2周收集的粪便样本中粪便菌群组成的Alpha多样性(Shannon指数)。(C)干预后1天获得的粪便丁酸盐(p=0.06)、(D)乙酸盐和(E)丙酸盐浓度(nmol/mg干粪重)与基线相比的倍数变化。短链脂肪酸。
考虑到答:soehngenii为了生产丁酸盐(从糖和乳酸/醋酸盐中)和丙酸盐(从1,2-丙二醇中)，10 18 19在基线和十二指肠灌注后24小时采集的粪便样本中测定SCFAs(丁酸酯、乙酸酯和丙酸酯)。令人惊讶的是，甘油安慰剂干预显著降低了丁酸盐和醋酸盐的水平(p=0.02和p=0.01)，而粪便SCFA保持稳定答:soehngeniiL2-7交货(在线补充图S2A-C)，表明载剂甘油溶液抑制SCFA的产生。然而，当比较干预引起的前24小时内SCFA浓度的变化时，安慰剂组和治疗组之间没有发现显著差异(图2汉英)．然而，丁酸盐的折叠变化值趋于较高答:soehngeniiL2-7喂养(p = 0.06,图2 c)．
答:soehngeniiL2-7的摄入增加了餐后GLP-1反应，并降低了血糖变化的程度
建立立即的代谢作用答:soehngeniiL2-7摄入量，干预后6小时对所有参与者进行标准化混合餐试验(MMT)，并随访肠促素、葡萄糖、胰岛素和甘油三酯的变化超过120分钟。观察到餐后血浆GLP-1水平显著升高答:soehngeniiL2-7治疗(图3 a, B；p = 0.021)。与此相一致的是，在最初24小时内，用FreeStyle Libre技术连续测量血糖的中位绝对偏差(MADs)确定的葡萄糖漂移在术后显著减少答:soehngeniiL2-7摄入量与安慰剂输注比较(图3 c, p = 0.045)。相比之下，两种干预措施的餐后循环胃抑制多肽(GIP)、葡萄糖、胰岛素和甘油三酯水平具有可比性(在线补充图S3A-D)．鉴于24小时后粪便中丁酸盐含量较高答:soehngenii我们评估了MMT结束时血浆SCFA的浓度;然而，在安慰剂组和治疗干预组之间没有观察到丁酸盐、乙酸盐或丙酸盐水平的显著差异(在线补充图S4A-C)．
GLP-1，葡萄糖和BA代谢。(A) MMT过程中0、20、30和120分钟血浆GLP-1水平(pmol/L)。(B) MMT期间血浆GLP-1水平作为总AUC。(C)安慰剂/治疗干预后24小时内连续血糖测量的MAD。(D) MMT期间次级BA血浆总水平，表示为TOMCA、TUDCA、TDCA、TUDCA、TLCA、GHDCA、GDCA、GUDCA、GlcA、omcA、DCA、UDCA、LCA、HDCA、MuroCA和IsoUDCA的AUCs之和。(E)相关热图，显示斯皮尔曼r级相关系数和统计显著相关性。输注后6小时(6小时)或MMT (AUC)中BA与GLP-1水平的*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。MMT，混合粉试验;AUC，曲线下面积;MAD，中位数绝对偏差; BA, bile acid; GLP-1, glucagon-like peptide 1; GDCA, glycodeoxycholic acid; TDCA, taurodeoxycholic acid; TLCA, taurolithocholic acid; isoUDCA; iso-ursodeoxycholic acid.
因为人类的基因组答:soehngeniiL2-7菌株包含编码胆汁酸钠转运体(EHLA_2286)和胆汁酸水解酶(EHLA_1602和EHLA_2245)的基因，20 21我们调查了答:soehngeniiL2-7次BA。虽然有显著性差异(p=0.06)，答:soehngeniiL2-7输注增加了次级BA的餐后偏移(图3 d)．值得注意的是，餐后次级BA牛磺脱氧胆酸(TDCA)、牛磺石胆酸(TLCA)和糖脱氧胆酸(GDCA)水平与GLP-1餐后漂移率呈正相关，而异熊脱氧胆酸(isoUDCA)率与注射后6小时GLP-1浓度相关(图3 e)．
鉴于…的积极影响答:soehngeniiL2-7对GLP-1和BA血浆浓度的影响，我们随后质疑观察到的系统结局是否与SI中丁酸和BA受体的差异表达有关。事实上，丁酸和BA都可能通过分别结合跨膜受体G蛋白偶联受体43 (GPR43)和武田G蛋白偶联受体5 (TGR5)在肠L细胞上作为GLP-1促分泌物，22日23日而激活核BA farnesoid X受体(FXR)则抑制GLP-1的分泌。24日25日基因表达的GPR43，TGR5，FXR和FXR靶基因OSTa而且FGF1926日27日对输注后6小时的十二指肠活检进行分析(图4 a e)．基因表达的GPR43，TGR5而且FGF19安慰剂和治疗之间具有可比性(中位数倍数变化分别为1.3、1.1和0.9)(图4 a, B, E)．相反,在答:soehngeniiL2-7摄入量，转录水平OSTa显著下降，而FXR表达倾向于较低(中位数倍数变化分别为0.8和0.86)(图4 c, D)，暗示FXR活动减少。
十二指肠基因表达。(A)十二指肠活检定量检测基因表达GPR43, (B)TGR5, (C)FXR, (D)OSTalpha和(E)FGF19．数据显示相对基因表达(安慰剂)使用2——∆∆Ct方法。
答:soehngeniiL2-7显著影响十二指肠基因表达，显著上调再生胰岛蛋白(注册）1 b表达式
为了获得安慰剂/治疗输注后肠道转录组的无偏性和深度快照，我们使用RNA测序(RNAseq)技术，使用从十二指肠活检中分离的RNA。RNAseq数据集分析表明，单剂量答:soehngeniiL2-7早在摄入后6小时就足以显著改变十二指肠黏膜的转录组谱。事实上，使用数字基因表达(DGE)分析管道Sleuth, EdgeR和DESeq2，我们发现分别有380,323和217个基因显著上调或下调答:soehngeniiL2-7摄入量(图5一个)．只有在所有三个统计包中p值有显著调整的基因被保留，结果在安慰剂和治疗组之间共有73个差异表达基因(图5 b)．在这些基因中,REG1B，LCN2而且SLC6A14，后出现两个log2以上的上调(折叠变化)答:soehngenii治疗,而DISP2是与安慰剂相比下调最多的基因(−1 log2(折叠变化))(图5C)。总的来说，最显著的效果是答:soehngenii全身的表达REG1B，它编码再生胰岛衍生的β蛋白(图5 c, D)．Reg家族成员1-4最初是在胰腺结石中发现的，是一种小的分泌蛋白，据报道可促进增殖、β细胞体积扩大并发挥抗糖尿病活性。28 - 30因此，我们进一步研究了安慰剂/治疗干预后SI活检中Reg1B的基因和蛋白表达。通过定量PCR (qPCR)对RNAseq的结果进行了验证REG1B表达与发现的表达密切相关REG1A基因也强烈上调响应答:soehngenii治疗(图5 e, F而且在线补充图S5A)，而REG3A，REG3G而且REG4没有显著上调答:soehngeniiL2-7注入(在线补充图S5B-D)．我们接下来的问题是，治疗介导的肠道改变是否与全身反应相关。令人惊讶的是，在十二指肠表达上调最多的基因之间发现了负相关REG1B，LCN2而且SLC6A14和系统性葡萄糖变异性(MAD)，在最初24小时内持续监测(图5克)．此外,十二指肠REG1B水平与表达率呈正相关LCN2而且SLC6A14，最重要的是血浆中GLP1的浓度，强调了这种单一菌株干预的全身有利效果(图5 g, H)．
RNAseq(十二指肠基因表达)。(A)通过Sleuth、EdgeR和DESeq2三种DGE技术分析的RNAseq数据集被识别出来。维恩图显示了在任意一条管道中显著上调或下调的基因数量。(B)由所有三种DGE技术识别的73个顶级DE基因在安慰剂和治疗之间的热图。(C) MA(比值强度)图可视化DE基因的基因表达比(治疗与安慰剂的倍数变化，Y轴)和平均表达强度(每个基因的平均RNAseq计数，X轴)。(D) RNAseq读取计数REG1B基因,十二指肠的表情。(E)在十二指肠活检中用qPCR检测基因表达REG1B和(F)REG1A，与安慰剂相比，变化为2倍−ΔΔCt数据分析。(G)相关热图，显示Spearman的r级相关系数和统计显著性相关。十二指肠基因表达间*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001REG1B，LCN2，SLC6A14安慰剂/治疗干预后24小时内连续血糖测量(MAD)的中位数绝对偏差。(H)注射后6小时血浆GLP-1浓度与十二指肠基因表达的Spearman相关性REG1B(通过定量PCR评估)。德,差异表达;DGE，数字基因表达;GLP-1，胰高血糖素样肽1;RNAseq RNA序列。
随后，我们通过western blotting和免疫组化(IHC)研究了Reg1B和Reg1A蛋白在小肠组织中的表达和定位。在蛋白水平上，Reg1B和Reg1A在十二指肠黏膜内的平均表达在治疗后趋于高表达，尽管与安慰剂相比不显著(图6 a - c而且在线补充图S5E-G)．这种与基因表达率的不一致可能是由于Reg蛋白是分泌分子的事实。Reg1B的免疫染色(用两种不同的抗体进行)显示，在隐窝基部(也有干细胞和Paneth细胞所在的地方)有很强的表达，在绒毛和空泡细胞分隔区域有较温和的染色(图6 d而且在线补充图S5H)．在相同的抗体浓度下，比较Reg1B和Reg1A的免疫组化染色，发现这两种蛋白都位于十二指肠隐窝基部，而Reg1B在隐窝和绒毛隔室表达更明显(在线补充图S5H)．由于Reg1A和Reg1B属于同一蛋白家族，且是高度相似且大小几乎相等的蛋白，因此我们在郑的western blotting试验中使用重组人Reg1B和Reg1A蛋白排除了抗Reg1A/B抗体的交叉反应性等．31针对Reg1B的抗体不能识别Reg1A，反之亦然(在线补充图ss5i、K)．
Reg1B在十二指肠的表达。(A)用抗Reg1B和β-actin抗体印迹的十二指肠裂解物的Western blot图像。(B)十二指肠活检中Reg1B表达水平的量化，Reg1B表达归一化为β-肌动蛋白(负荷对照)。(C) Reg1B蛋白表达在折叠改变治疗与安慰剂对比中显示。(D)十二指肠活检中Reg1B的免疫组化染色。(E)十二指肠活检中Reg1B(红色)、溶菌酶(黄色，Paneth细胞)和粘蛋白(深蓝色，Goblet细胞)的顺序免疫染色。图片显示在×10或×40放大，如所示。箭头表示Reg1B+溶菌酶共化点之一。(F) Caco-2细胞中Reg1B表达水平的量化，Reg1B表达归一化为β-actin(负荷控制);Reg1B表达显示为折叠变化治疗与安慰剂，但:丁酸1 mM; MDP: 1 µg/mL. (G) Western blot images of Caco-2 cell lysates blotted with antibodies against Reg1B and β-actin. MDP, muramyl dipeptide.
为了进一步揭示隐窝绒毛单元中表达REG1B的细胞类型的性质，我们进行了三染色，以可视化REG1B(红色)、溶菌酶(黄色，Paneth细胞标记物)和粘蛋白(阿利新蓝染料，Goblet细胞标记物)(图6 e)．与单次染色一样，Reg1B红色染色在隐窝基部明显可见，与溶菌酶免疫染色(棕色)共定位，并与蓝色染色的粘蛋白阳性细胞相邻。虽然还需要进一步的研究来了解这些转录变化的本质，但我们的研究结果表明，Reg1B在肠绒毛中表达，特别是在隐窝基部，并可能由Paneth细胞产生和分泌，以响应答:soehngeniiL2-7过境。在这方面，在十二指肠灌注后8小时(MMT结束时)评估血浆Reg1B的低浓度(在线补充图S5J)，表明Reg1B主要分泌到(小)肠腔，因此以旁分泌的方式作用于肠细胞。了解答:soehngeniiL2-7可能调节Reg1B的表达，我们进一步将cco -2细胞暴露于丁酸或壁氨酰基二肽(生物活性的细菌肽聚糖基序)6小时，发现Reg1B在两种刺激下显著上调(图6 f, G)．与此相符合的是，直接接触热灭活答:soehngeniiL2-7细菌上调Reg1B表达(在线补充图S5L)．
重要的是，在第0周到第4周之间，独立于干预顺序，没有观察到延续效应，如所示在线补充图S6基本的粪便水平答:soehngenii、粪丁酸、血浆GLP1漂移和葡萄糖MAD在输注后24小时(在线补充图S6A-D)．
讨论
在这个开创性的随机交叉II期试验中，我们证明了单次十二指肠输注答:soehngeniiL2-7的十二指肠转录组谱，此外，我们确定代谢参数受到单剂量活菌的影响(长达24小时)答:soehngeniitreatment-naïve患者的L2-7。事实上,管理答:soehngeniiL2-7(与安慰剂相比)导致小肠基因表达特征的改变，最显著的是，在REG1B．此外,答:soehngeniiL2-7输注后24小时内餐后血浆胆盐和GLP-1水平升高，血糖变异性(MAD)降低答:soehngeniiL2-7。虽然还需要进一步的调查，但这些数据，结合我们之前的研究，13日14表明,答:soehngeniiL2-7可能通过塑造BA代谢和增加肠道GLP-1的产生来改善人体MetS中的糖代谢。
我们之前的研究表明，在代谢综合征受试者中，口服A. soehngenii L2-7 4周会增加血浆初级胆汁酸，特别是次级胆汁酸，14这些细菌已知是由共生微生物形成的，例如属于瘤胃球菌科和螺旋菌科的微生物。32 33此外，在db/db小鼠，4周口服答:soehngenii治疗减轻了胰岛素抵抗，并改善了胆盐代谢，同时增加了SI中BA代谢/转运相关基因的表达，包括十二指肠抑制Fxr而且Ost-alpha表达式。13值得注意的是，我们在此披露单次十二指肠灌注答:soehngenii足以增加次级BA，其中TDCA、TLCA、GDCA和isoUDCA与GLP-1水平的升高有关。这些发现与之前的研究一致，表明共轭BA，包括TDCA、TLCA、GDCA和UDCA，促进肠L细胞释放GLP-1。品种马非常值得注意的是答:soehngenii含有一个钠转运基因(EHLA_2286)和两个胆汁盐水解酶(BSH)编码基因(位点标记EHLA_1602和EHLA_2245)。20.此外，转录组分析了一个简化的微生物群落(包含答:soehngenii结果表明，这两种BSH基因均在肠道中有功能表达。21这些发现加上我们观察到的继发性BA增加答:soehngenii喂养(这项研究中,14)指出该菌株在次生BA的形成中发挥积极作用，次生BA可能通过结合TGR5受体作为GLP-1促分泌物。23 39 40此外,答:soehngenii降低了fxr靶点的十二指肠表达OSTalpha，26与观察到的FXR信号失活相一致答:soehngenii -把db / db老鼠。13值得注意的是，FXR抑制了肠内分泌L细胞的GLP-1分泌，而它的抑制改善了代谢控制。24日25日41因此，根据Ducastel的研究，FXR激活的减弱可能也是GLP-1可用性增加的原因等L细胞对丁酸/GPR43信号的响应性更高。25的确，我们观察到一个显著的影响答:soehngenii而不是GIP，这表明这种菌株使L细胞分泌更多的GLP-1，可能是对它自己的代谢物，如丁酸和次生(疏水性)BA的反应。这一假设得到了动物研究的支持，研究表明肠道菌群对L细胞和GLP-1含量有快速而显著的影响，主要在小肠中，小肠内分泌细胞和黏膜菌群直接接触。15 42 43此外,答:soehngenii是已知的SCFA丁酸盐的生产者，10它通过结合L细胞上表达的受体GPR43刺激GLP-1的分泌。22总的来说,答:soehngenii -无论是通过丁酸/BA信号和/或FXR抑制，介导的血浆GLP-1的增加可能证明了细菌摄入后葡萄糖MAD的减少。这种血糖变异性的改善可能是丁酸盐和GLP-1的胰岛素敏化作用的结果。11，16，17此外，我们不能排除这一点答:soehngenii通过其他(不太明显的)机制改善血糖控制:例如，通过以蛋白质/多肽或气体的形式促进微生物群衍生的神经递质的生成，这些递质可以局部作用于肠道肌肉放松或肠内神经元激活，也可以远端作用于大脑，影响食欲、行为和外周葡萄糖稳态。44此外，最近的一项研究表明Akkermansia muciniphila在体内，肽酶S41A家族中刺激产热和GLP-1分泌的一种名为P9的细菌蛋白质。45奇怪的是,答:soehngenii具有表达肽酶S41家族的遗传能力，这强调了多种过程可能决定了观察到的代谢益处a . soehngenii超越BA/丁酸的生产(例如，通过生产生物活性分子或可能通过Reg1B诱导)。
虽然粪便丁酸盐率的折叠变化比较表明，丁酸盐在喂养后趋于升高答:soehngenii-治疗，因此，我们还发现安慰剂输注对丁酸盐和醋酸盐浓度有负面影响;如前所述，这种影响很可能是由于甘油对短链脂肪酸生产的副作用。46尽管如此，SCFA水平在之后保持稳定答:soehngeniiL2-7给药表明SCFA产量的增加答:soehngeniiL2-7可以平衡甘油输注引起的SCFA减少，因此可以更好地调节肠道GLP-1的产生。与粪便丁酸盐的变化相反，8小时后血浆丁酸盐水平基本未受影响答:soehngenii治疗。这可能是由于微生物产生的丁酸盐是结肠细胞和肝脂质和葡萄糖产生的主要能量来源1这样就更难检测到外周血浆水平的差异。尽管如此，我们不能排除循环SCFA浓度的变化在较晚的时间点变得明显(例如，24小时，粪便SCFA水平)。
十二指肠黏膜细胞处于肠道菌群的界面，在与肠道菌群相遇后发生了强烈的转录重编程答:soehngeniiL2-7。细菌给药后，表达差异最大的基因编码与代谢物运输、胆固醇代谢或细胞因子信号有关的蛋白质。然而，三个上调最多的基因REG1B，LCN2而且SLC6A14与葡萄糖MAD率呈负相关，提示其在血糖控制中具有保护功能。啮齿类动物研究表明，LCN2表达的增加促进葡萄糖耐量、胰岛素敏感性和控制食欲47，而LCN2缺乏加重胰岛素抵抗。48同样，高脂饮食喂养的小鼠缺乏SLC6A14会恶化肥胖和MetS。因此，SLC6A14基因中的肥胖连锁单核苷酸多态性(SNP)被证明可以降低SLC6A14的表达。49
的表达变化最为显著REG1B，这与REG1A,之后是否明显上调答:soehngeniiL2-7管理。它们都是REG基因家族的成员，该基因首次在胰腺中发现，主要由外分泌腺泡细胞表达，在细胞损伤时，在朗格汉斯岛中表达。50使用Reg敲除、过表达或给药重组Reg蛋白的动物研究表明，Reg蛋白可诱导β细胞产生有丝分裂作用，并可预防糖尿病。28日51 52然而，REG1B中的基因组snp与T2D无关53提示组织特异性表达更相关。与胰腺相似，肠道Reg蛋白表达与炎症和肿瘤条件下的增殖增强有关。54-56通过免疫染色，我们发现Reg1B和Reg1A位于小肠隐窝基部，与其在肠细胞中的表达(较低程度)相比，Reg1B在Paneth细胞中表达更明显;之前的一项研究证实了这一点REG1A，REG1B,REG3基因在Paneth细胞中的表达。56值得注意的是，Paneth细胞保护Lgr5+隐窝中的干细胞通过产生信号和杀菌分子。事实上，据报道Paneth细胞通过toll样受体参与直接感知原生微生物，从而分泌包括Reg3β和Reg3γ蛋白在内的抗菌产物，限制共生动物对黏膜的渗透。57与此同时，我们发现在肠细胞中，Reg1B的表达是由肽聚糖和丁酸盐触发的。虽然还需要进一步的研究，但我们可以认为，肠上皮细胞和Paneth细胞通过GPR和先天免疫受体感知给药细菌，导致诱导REG1表达式。Reg蛋白在胰腺细胞上的再生活性似乎以自分泌/旁分泌方式起作用50 52；因此，Reg1A/B可能是十二指肠分泌的局部作用，可能诱导祖细胞或l细胞增生。支持Reg1B对肠L细胞的“局部”作用，十二指肠REG1B与GLP-1浓度显著相关，Reg1B浓度在血浆样品中明显低于十二指肠组织。事实上，在摄入安慰剂8小时后，6名患者的血浆样本中未检测到Reg1B，在摄入安慰剂8小时后，2名患者的血浆样本中未检测到Reg1B答:soehngeniiL2-7输液。在蛋白质水平上，我们没有发现安慰剂和治疗干预之间十二指肠中Reg1B或Reg1A表达有统计学上的显著差异。因此，我们认为这可能是由于它们的分泌进入肠腔，从而在十二指肠粘膜内损失了Reg蛋白。58
正如预期的那样，对我们研究设计的跨界性很重要的是，单一十二指肠细菌输注没有在主要方式上影响粪便微生物群组成和香农微生物多样性，因此排除了治疗引起的遗留效应。因此，干预的顺序不影响粪便丁酸水平、餐后GLP-1反应和24小时葡萄糖变异性。还有，粪便没有波动答:soehngeniiL2-7的丰度随着时间的推移是可以预期的，因为单次剂量不太可能是1011细菌导致结肠定植。尽管如此，这些发现暗示在此报告的影响答:soehngenii在整个肠道的运输过程中就会被触发，而在SI/结肠的完全细菌植入中，它们会大大增强。
结论
据我们所知，这是第一个将单一株严格厌氧菌直接通过胃进入十二指肠以最大限度地保留生存能力的研究。单次十二指肠灌注答:soehngeniiL2-7对小肠基因表达的影响最为显著REG1B研究发现，它与GLP-1水平的升高和改善外周血糖控制有关，并在Paneth细胞内的肠隐窝基部强烈表达。此外，输液答:soehngeniiL2-7迅速引发代谢参数的有利变化:它显著增强餐后GLP-1反应(摄入6小时后)，并改善血糖变异性(MAD，前24小时)。虽然答:soehngenii-衍生的生物活性代谢物和肠促素系统可能驱动该菌株改善血糖控制和胰岛素敏化效应，有必要进一步研究阐明潜在的有益影响的机制答:soehngenii．
材料和方法
患者招募和参与
12名白人男性受试者(年龄21-69岁)，体重指数在30 - 43公斤/米之间2通过当地报纸广告招聘(招聘及随访时间:2017年12月- 2019年2月)。为了纳入试验，所有受试者必须为treatment-naïve，患有MetS，由以下5个标准中≥3个标准确定:空腹血糖≥5.6 mmol/L，甘油三酯≥1.7 mmol/L，腰围≥102 cm，高密度脂蛋白胆固醇≤1.04 mmol/L，血压≥130/85 mm Hg。61此外，HOMA-IR(>2.5)被列为胰岛素抵抗的额外筛查标记物。排除标准包括心血管事件史、胆囊切除术史、明显未治疗的胃肠疾病或异常排便习惯、肝酶>高于正常范围上限2.5倍、吸烟、酗酒和在过去3个月内使用质子泵抑制剂或抗生素。该研究只包括男性，以避免因(绝经后)女性女性激素浓度的变化而对胰岛素敏感性产生混淆效应。62研究参与者被要求在纳入研究后不要改变他们的体育锻炼和饮食模式。该研究在荷兰试验注册中心注册。
研究设计
这是一项随机双盲安慰剂对照交叉II期研究。所有受试者(n=12)均接受两种治疗(1011答:soehngeniiL2-7细胞，剂量基于我们之前的研究14)和安慰剂(10%甘油-磷酸盐缓冲盐水，PBS)，洗脱期为4周，如图1．给药顺序采用计算机随机化，以1:1的方式随机分配，双盲(对患者和负责的医生)。在一夜禁食后，使用电磁引导系统Cortrak放置十二指肠管。治疗组接受10 mL 10:90的甘油:PBS溶液答:soehngeniiL2-7 (NCBI分类法ID 105843)9浓度是1010细胞/mL(共10个11细胞)远端注入到Vater的乳头，而安慰剂组接受了相同的干预，只接受10毫升的载药溶液(10%甘油在PBS中)。6小时后，行胃十二指肠镜检查，并在十二指肠灌注的相同位置进行十二指肠活检，并将其保存在石蜡中进行组织学检查或在液氮中速冻，然后保存在−80°C。在胃十二指肠镜检查后，如前所述进行2小时MMT。4受试者接受前臂远端静脉静脉留置导管，在此基础上抽取血液样本;此后，受试者立即摄入液体餐液(Nutridrink;Nutricia高级医疗营养，阿姆斯特丹，荷兰)含有600千卡(35%的脂肪，49%的碳水化合物和16%的蛋白质)，并在随后的2小时内抽取血液样本，测定餐后血糖、胰岛素、甘油三酯、GIP和GLP-1(用标准临床诊断方法测量)。受试者接受连续24小时的血糖监测仪(CGM, FreeStyle Libre System, Abbott USA)。最后，受试者被要求保持在线营养日记，以监测干预后这些天的食物摄入量(https://mijn.voedingscentrum.nl/nl/eetmeter/)及在多个时间点收集粪便样本(见图1)．第一次就诊后四周，重复整个研究周期，为每个患者更换干预臂。
数据可用性声明
所有与研究相关的数据都包含在文章中或作为补充信息上传。
伦理语句
病人同意发表
伦理批准
该研究得到了荷兰阿姆斯特丹阿姆斯特丹大学医学中心当地机构审查委员会的批准，并根据《赫尔辛基宣言》进行。患者没有参与本研究的设计和实施，尽管他们在招募访问中被充分告知了研究的程序和目标。所有参与者都签署了一份书面知情同意书。
致谢
我们分别感谢S Shetty博士和H Heilig博士(荷兰瓦赫宁根大学微生物实验室)提出的有益建议和从活组织检查中提取的DNAAnaerobutyricum soehngeniiL2-7检测。
参考文献
补充材料
脚注
贡献者AK、AKG、ES、WMDV、MN、ER设计研究。AK、KW、JW、SM、HH、MW、SA、SH、HL、EMK、BH、JH、JJGHMB、MS、FB、ER、P-OB、JvS、MB、DMB、CMS和SLH进行了研究。AK、ER、AP、EL进行统计分析。AK、WMDV、AKG、MN和ER起草了论文。所有作者都严格审阅并批准了稿件。ER是本研究和出版的担保人。
资金MN由ZONMW VICI 2020赠款(编号09150182010020)支持。WMDV得到了SIAM引力基金(024.002.002)和荷兰科学研究组织2008年斯宾诺莎奖的支持。KW, MB, JvS, DMB和ER被任命为2018年CAMIT赠款(给MN和FB)。本文报道的研究还得到了Le Ducq财团17CVD01号拨款给SLH和MN (HJH和CMS在其中任职)的支持。MN和AGK得到了荷兰心脏基金会CVON IN CONTROL-2财团的资助。
相互竞争的利益MN是美国波士顿Kaleido Biosciences的科学董事会成员。WMDV是比利时A-mansia的创始人和董事会成员。FB是瑞典Metabogen AB的科学董事会成员。MN和WMDV是荷兰Caelus Pharmaceuticals的创始人和科学顾问委员会成员。SLH是宝洁公司的付费顾问，也是克利夫兰诊所持有的未决和已发布专利的共同发明人，并有资格获得克利夫兰心脏实验室、Quest diagnostics和宝洁公司心血管诊断或治疗相关的发明或发现的报酬。
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