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胰腺
原始研究
溶酶体脂质开关tslp营养不足和mTOR针对胰腺癌
  1. 玛丽亚奇亚拉德桑蒂斯1,
  2. 卢卡Gozzelino1,
  3. 吉恩·皮耶罗Margaria1,
  4. 安德里亚Costamagna1,
  5. Edoardo Ratto1,
  6. 费德里科•Gulluni1,
  7. 全国迪格雷戈里奥1,
  8. 艾丽卡米娜1,
  9. Nicla Lorito2,
  10. 玛丽娜Bacci2,
  11. Rossano Lattanzio3,
  12. 蒋禄卡萨拉3,
  13. Paola Cappello1,
  14. 弗朗西斯科·Novelli1,
  15. Elisa Giovannetti4,5,
  16. Caterina Vicentini制作6,
  17. 西尔维亚Andreani7,
  18. 皮特参与7,
  19. Vincenzo Corbo6,7,
  20. 阿尔多斯卡帕6,7,
  21. 保罗埃托雷Porporato1,
  22. 安德里亚·莫兰迪2,
  23. 埃米利奥•赫希1,
  24. 米利暗马提尼1
  1. 1分子生物技术和健康科学部门,都灵大学,都灵、意大利
  2. 2生物医学、实验和临床科学,佛罗伦萨大学,佛罗伦萨、意大利
  3. 3部门创新技术在医学和牙科,先进的研究和技术中心(CAST),“g . d’annunzio大学基,意大利,基、意大利
  4. 4医学肿瘤学部门,癌症中心阿姆斯特丹,阿姆斯特丹大学医学中心,VU大学德Boelelaan 1117年,1081年,高压,阿姆斯特丹、荷兰
  5. 5癌症药理学实验室,基金会Pisana / la Scienza,比萨、意大利
  6. 6ARC-Net研究中心,维罗纳大学,维罗纳、意大利
  7. 7诊断和公共卫生部门,维罗纳大学,维罗纳、意大利
  1. 对应到米里亚姆博士马提尼、分子生物技术和健康科学部门,都灵大学都灵,意大利;miriam.martini在{}unito.it

文摘

客观的胰腺导管腺癌(PDAC)是一个激进的疾病与有限的治疗选项。然而,代谢适应严酷的PDAC环境可以暴露负债用于治疗。针对关键代谢调节剂复杂机械的雷帕霉素的目标1 (mTORC1)及其下游通路显示效果只有在病人基因修饰符子集最大化反应仍有待确定。

设计三个独立的群PDAC患者与疾病关联PI3K-C2γ蛋白质丰度研究结果。机制被研究在老鼠PDAC (KPC老鼠)和细胞模型,存在与否的PI3K-C2γ(WT或KO)。PI3K-C2γ-dependent代谢重新布线及其对mTORC1监管影响评估的条件限制了谷氨酰胺的可用性。最后,针对mTORC1联合治疗的效果和谷氨酰胺代谢进行了研究在WT KO PDAC细胞和临床前模型。

结果PI3K-C2γ表达减少PDAC约30%的情况下,与积极的表型相关。同样,亏损PI3K-C2γKPC增强小鼠肿瘤发展和进展。增加侵略性肿瘤缺乏PI3K-C2γ与hyperactivation mTORC1途径和支持脂质合成谷氨酰胺代谢重新布线。PI3K-C2γ-KO肿瘤未能适应代谢压力谷氨酰胺引起的损耗,导致细胞死亡。

结论失去PI3K-C2γ防止mTOR失活和触发器肿瘤容易RAD001 (mTOR抑制剂)和双极性晶体管/ cb - 839(谷氨酰胺酶抑制剂)。因此,这些结果可能打开方式个性化治疗与PI3K-C2γPDAC损失。

  • 信号转导
  • 胰腺癌
  • 脂质代谢
  • 细胞生物学
  • 氨基酸

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl - 2021 - 325117

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    已经知道这个问题是什么?

    • 胰腺导管腺癌(PDAC)是一个积极的和致命的疾病的特点是可怜的响应电流疗法。

    有什么新发现吗?

    • 在这项工作中,我们表明,失去PI3K-C2γ二类PI3K,促进PDAC生长,防止机械的雷帕霉素靶(mTOR)信号失活,触发细胞对谷氨酰胺。研究转基因小鼠,我们发现肿瘤的增殖优势PI3K-C2γ损失与hyperactivation mTOR的途径和谷氨酰胺代谢重新布线。从力学上看,PI3K-C2γ新兵Asap1到溶酶体压制mTORC1激活谷氨酰胺反应减少。重要的是,亏损PI3K-C2γPDAC触发癌症脆弱性mTOR和谷氨酰胺酶抑制剂的结合。

    它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?

    • 谷氨酰胺类似饥饿、失去PI3K-C2γ对谷氨酰胺酶抑制剂的敏感性增加,cb - 839和双极性晶体管,尤其是当结合everolimus。我们的研究结果揭示有助于谷氨酰胺依赖的信号转导通路,代表一个可利用的漏洞为PDAC有效的治疗策略的发展。

    介绍

    胰腺导管腺癌(PDAC)是在路径成为2030年癌症死亡的第二大原因。1抵抗化疗对于胰腺癌患者代表了一个关键的挑战,因此,迫切需要PDAC的新治疗方法。现象导致治疗抵抗和惨淡的PDAC的预后是一个独特的特征称为粘连形成,导致氧气和营养物质的减少可用性癌症。生存在这样一个恶劣的微环境中,胰腺癌细胞采用独特的代谢过程,以满足能源需求,包括重塑了葡萄糖和谷氨酰胺代谢。2 3以前的证据表明,谷氨酰胺是胰腺癌的关键营养,4个5碳和氮的主要来源为生物合成反应和氧化还原内稳态。6 7

    代谢适应养分有效性的关键调节器是mTOR(机械的雷帕霉素靶)通路,使代谢重编程支持生物合成的需求和最佳的细胞生长。PDAC mTOR信号往往是特异表达,从而代表一个有吸引力的治疗目标的反应在临床前模型。8然而,临床试验结果使用mTOR更鼓舞人心,显示只在少数的PDAC患者临床益处。9日10因此,分层患者的遗传标记修改容易抑制mTOR预计将提供一个更好的治疗反应。11

    而众所周知,mTOR轴是我PI3K激活类,12二类PI3K起到相反的效果及其脂质产品π(3,4)P2可以作为负调节mTOR的信号。13 - 15二类pi3k包括三个亚型,PI3K-C2αPI3K-C2βPI3K-C2γ,显示冗余移动角色和独特的生物功能。16有独特的表达模式,PI3K-C2γ对碘氧基苯甲醚中出现肝、肾和胰腺外分泌。17尽管存在PI3K-C2γ胰腺可能在PDAC暗示作用,这种脂质激酶是否会影响癌症启动和/或进展仍不清楚。

    在这项研究中,我们发现损失PI3K-C2γ加速PDAC hyperactivation mTOR的路径发展。我们的研究结果表明,PI3K-C2γ抑制mTORC1通过特定的机制,不同于PI3K-C2β13日14和涉及π(3、4)P2 / Asap1 / Arf1通路。这个负面反馈是由低谷氨酰胺及其损失PDAC驱动器谷氨酰胺上瘾。因此,缺乏PI3K-C2γtslp PDAC细胞结合mTOR和谷氨酰胺酶的协同效应(GLS1)抑制体外和体内。因此我们的研究结果支持了这样的观点,即丧失PI3K-C2γPDAC可能让病人更准确的分层需要改善的治疗反应。

    材料和方法

    组织病理学分析

    PI3K-C2γ蛋白表达在三个独立评估群PDAC样本。部分是与特定的抗体染色:PIK3C2G (ThermoFisher pa5 - 15239), phospho-S6 Ser235/236(# 4858,细胞信号),PCNA 6 d645 (sc - 71858)和phospho-4E-BP1 Thr37/46(# 2855,细胞信号)。鼠标分析,PanIN前面定义的PDAC指南发表在转基因小鼠模型。18 19

    老鼠菌株生成和分析

    B6 C57 /Pik3c2g- / -老鼠以前生成的。17喀斯特LSL-G12D;Trp53LSL-R172H(KP)18和Pdx-Cre老鼠请由弗朗哥Novelli教授和教授Paola Cappello提供。Pik3c2g+ / +(WT)和Pik3c2g- / -(KO)老鼠穿过KP和Pdx-Cre老鼠生成所有实验军团。ν/νCD1+老鼠从查尔斯河实验室购买。所有的动物实验被意大利卫生部授权(33/2019-PR)。在7.1 t MRI扫描是一个力量皇冠Neo 300光谱仪配备微2.5缩微成像探针。对于原位注射,KPC细胞(106细胞)注入8周大Pik3c2g+ / +老鼠。双极性晶体管(12.5毫克/公斤/老鼠,每周两次)和/或everolimus(1.5毫克/公斤/老鼠,日报)治疗,KPC (2×106细胞/老鼠)和Panc1 (4×106细胞/老鼠)细胞在ν/νCD1皮下注射+老鼠。

    细胞培养

    人类的PC细胞系Capan1 (hbt - 79), MiaPaca2 (crl - 1420), Panc1 (crl - 1469)和Cos7 (crl - 1651)细胞系是从美国购买的组织细胞培养(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)和维护文化与DMEM (Gibco)高葡萄糖包含2毫米谷氨酰胺(表达载体),5000 U /毫升Penicillin-Streptomycin (Gibco)和10% heat-inactivated透析胎牛血清(表达载体)。药物治疗,Everolimus(11597年,开曼群岛化学),cb - 839(22038年,开曼群岛化学)或双极性晶体管(S7753 Aurogene)被添加在媒体文化播种后的第二天。在指定的时间点细胞数CellTiter-Fluor细胞生存能力分析(Promega)。人类细胞系验证是由基因组学基础代谢率。所有的细胞系都经常使用PCR检测支原体污染。

    代谢试验

    媒体被化验为葡萄糖和乳酸水平通过Biosen C-Line分析仪根据制造商的指示。KPC WT KO细胞受到海马XF细胞水压力测试。分析的统一(U)放射性标记的14C-glutamine成蛋白质和脂质,培养基与0.05µCi /毫升补充14C-glutamine(珀金埃尔默)。

    统计分析

    棱镜软件(GraphPad)是用于统计分析。CompuSyn软件用于分数组合指数的组合治疗。意义计算学生的学习任务和单向或双向方差分析测试Bonferroni紧随其后的事后分析或曼特尔考克斯生存率较合适的地方。

    结果

    减少在胰腺PDAC PI3K-C2γ表达式

    评估的相关性PI3K-C2γ表达式在癌症,我们审问PDAC转录组可以在cBioPortal癌症基因组学。20 21TCGA队列(n = 148)的数据显示,浅删除(杂合的损失),但很少突变,PIK3C2G是一种常见的PDAC约15%的患者的畸变。20 21此外,基因表达分析中执行四个综合PDAC数据集显示PIK3C2G主要表达在肿瘤上皮细胞(在线补充图S1A),表示的表达式PIK3C2G观察,TCGA和ICGC数据集是由于肿瘤但不是基质细胞表达下降。22日至25日此外,我们观察到显著负相关(枪兵:−0.51;p = 2.22 e-13)之间PIK3C2G甲基化和mRNA表达,一致的表达减少PDAC病人。20 21

    PI3K-C2γ loss decreases KPC mice survival and accelerates PDAC cells growth. (A, B) Immunohistochemical (IHC) assessment (A) and quantification (B) of the level of PI3K-C2γ expression in PDAC patients in cohort #1. Representative images of high (score ≥1) and low (score <1) PI3K-C2γ expressing tumours (n=73) (scale bar=100 µm). (C, D) Percentage of tumours expressing high (score ≥1) or low (score <1) levels of PI3K-C2γ in cohort #2 (n=76), (C) and cohort #3 (n=45), (D). (E) Kaplan-Meier curve for survival of WT/KO KPC mice (n=40, Mantel-Cox log-rank test). (F) Histopathological analysis of WT/KO KPC mice pancreata. Representative H&E images, PAS-alcian blue and Masson trichrome stainings of 1.5 and 4 months old mice. Arrows indicate PanIN lesions, asterisks (*) indicate normal acini, hashtags (#) indicates PDAC (scale bar=100 µm). (G) Axial (top) and coronal (bottom) T2w MRI (B0=7.1 T) of WT (left) and KO (right) 6 weeks old KPC mice. White arrows indicate pancreatic tumour. (H, I) Growth assay of WT/KO KPC (H) and Panc1 (I) cells (n=5). Data are shown as mean±SEM, ANOVA followed by Bonferroni’s post hoc test, otherwise indicated. ANOVA, analysis of variance; KPC, LSL-KrasG12D/+;LSL-Trp53R172H/+;Pdx-1-Cre; PAS, Periodic acid–Schiff; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    PI3K-C2γ损失减少KPC老鼠生存和加速PDAC细胞增长。(A, B)免疫组织化学(包含IHC)评估(A)和(B)量化PDAC PI3K-C2γ表达水平的病人组# 1。代表图像的高(分数≥1)和低(得分< 1)PI3K-C2γ表达肿瘤(n = 73)(比例尺= 100µm)。(C, D)的肿瘤表达比例高(分数≥1)或低(得分< 1)PI3K-C2γ水平组# 2 (n = 76), (C)和组# 3 (n = 45), (D)。(E) kaplan meier WT / KO KPC小鼠的生存曲线(n = 40, Mantel-Cox生存率较)。(F)的组织病理学分析WT / KO pancreata KPC老鼠。代表)图像,马森PAS-alcian蓝三色的染色1.5和4个月大的老鼠。箭头表示PanIN病变,星号(*)表示正常的腺泡,标签(#)表明PDAC(比例尺= 100µm)。(G)轴向(顶部)和日冕(底部)T2 w核磁共振(B0= 7.1 T)的WT(左)和KO(右)6周大KPC老鼠。白色箭头指示胰腺肿瘤。(H I)增长分析WT / KO KPC (H)和Panc1 (I)细胞(n = 5)。数据显示为±SEM,方差分析后跟Bonferroni事后测试,否则表示。方差分析,方差分析;KPC LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / + Pdx-1-Cre;不定期acid-Schiff;PDAC,胰腺导管腺癌。

    接下来,我们的表达进行了探讨PIK3C2GPDAC两分子亚型的上下文中,使用莫菲特的PDAC分类。26我们发现PIK3C2G激进的官腔亚型的表达显著低于在古典PDAC,27 28在TCGA (n = 148, p = 0.035)和ICGC组(n = 95, p = 0.013) (在线补充图印地)。我们也调查的表达之间的相关性PIK3C2G和经典的代理生物标志物PDAC细胞,GATA6,证实PI3K-C2γ低明示的浓缩GATA6低两组肿瘤(在线补充图就是S1C)。

    确认PDAC显示了减少PI3K-C2γ表达式的一个子集,我们使用验证抗体染色由包含IHC 194例从三个独立的群体。抗体的特异性PI3K-C2γ从PI3K-C2γ-deficient验证在胰腺组织Pik3c2g- / -老鼠17(在线补充图S1D)。在第一组(组# 1,n = 73),低水平的PI3K-C2γ被发现在38%(28/73)的患者(包含IHC得分< 1),而62%的人归类为正面(包含IHC分数≥1)(图1 a和B)。此外,减少PI3K-C2γ表达式在35.6%(16/45)的中度分化PDACs和42.9%(12/28)的低分化PDACs (在线补充图S1E)。在第二个独立队列(队列# 2 n = 76),低水平的PI3K-C2γ被发现在22.4%(17/76)的患者中,46.9%(23/49)的得分低分化PDAC (图1 c)。在第三组(组# 3,n = 45),低水平的蛋白质中发现33.3%(15/45)的PDAC患者(图1 d),40.0%(4/10)的得分为低分化PDAC (在线补充表S1)。PI3K-C2γ表现出显著的低表达患者临床总生存期较短(但不是无进展生存)比高PI3K-C2γ水平(p = 0.035,在线补充图S1F, G)。

    老鼠PI3K-C2γ促进胰腺癌的损失

    调查PI3K-C2γ胰腺癌发展的角色,我们交叉Pik3c2g- / -老鼠17与LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / + Pdx-1-Cre (KPC WT)18和生成KPC KO小鼠。尽管KPC WT老鼠死于死亡平均30周,从KPC KO组动物死在11周的平均年龄(p < 0.0001,图1 e),从而表明PI3K-C2γ降低总体生存时间的损失。然而,老鼠缺乏PI3K-C2γWT背景的表达17肿瘤发展并不容易,没有显示代谢改变(ie、胰腺、肝脏和肾脏功能)(在线补充图S1H和在线补充表S2)。

    PanIN病变的分析表明,失去PI3K-C2γ促进PanIN发展的每个阶段的外观(PanIN1 2和3)(图1 f和在线补充图S1I, J)。这种疾病加速并不是与代谢改变有关,如未发现血糖的变化在两个基因型8周(在线补充图S1K)。进一步同意加速杀伤力在PI3K-C2γ缺席的情况下,T2 w核磁共振分析,表明KPC KO肿瘤比KPC弥漫在整个腹部WT控件(图1 g)。符合这一发现,KPC KO小鼠有显著提高肺和肝转移的数量(在线补充图S2A)。

    PI3K-C2γ loss induces mTORC1 hyperactivation on glutamine deprivation. (A) IHC assessment of the level of PCNA (top) and pS6 (bottom) in tumours taken from WT/KO KPC mice. Arrows indicate PanIN lesions, asterisks (*) indicate normal acini, hashtags (#) indicates PDAC (scale bar=100 µm). (B) IHC assessment (left) and quantification (right) of the level of pS6 expression (focal positive reactivity) in PDAC patients (scale bar=100 µm) expressing high (score ≥1) or low (score <1) of PI3K-C2γ levels (n=45 patients, p=0.04, χ2 test). (C) WB analysis of mTORC1 activity in WT/KO Panc1 cells that were starved of glutamine (Gln), then stimulated with Gln at the indicated concentrations. Representative Western blot images of whole-cell lysates probed with indicated antibodies (top) and quantification of pS6K/S6K ratio in the indicated conditions (n=9, bottom). (D) WB analysis of pS6K in WT Panc1, KO Panc1 or KO Panc1 cells re-expressing WT or the kinase dead (KD) versions of tGFP-PI3K-C2γ after glutamine depletion for 2 hours. Representative Western blot images of whole-cell lysates probed with indicated antibodies (left) and quantification of pS6K/S6K ratio in the indicated conditions (n=4, right). (E) Quantification of PI(3,4)P2 concentration in WT/KO Panc1 cells that were starved of glutamine (Gln), then stimulated with Gln at the indicated concentrations (n=5). Data are shown as mean±SEM, ANOVA followed by Bonferroni’s post hoc test, otherwise indicated. ANOVA, analysis of variance; IHC, immunohistochemical; mTORC1, mechanistic target of rapamycin complex 1; KPC, LSL-KrasG12D/+;LSL-Trp53R172H/+;Pdx-1-Cre; PCNA, proliferating cell nuclear antigen; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma. **P<0.01; ***p<0.001.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    PI3K-C2γ损失诱发mTORC1 hyperactivation谷氨酰胺剥夺。(A)包含IHC增殖细胞核抗原(上)的评估水平和魔法石第六章(下)在肿瘤来自WT / KO KPC老鼠。箭头表示PanIN病变,星号(*)表示正常的腺泡,标签(#)表明PDAC(比例尺= 100µm)。(左)和(B)包含IHC评估量化(右)水平的魔法石第六章表达式(焦积极反应)PDAC病人(比例尺= 100µm)表达高(分数≥1)或低(得分< 1)PI3K-C2γ水平(n = 45岁患者,p = 0.04,χ2测试)。(C)世行分析mTORC1活动WT / KO Panc1细胞缺乏谷氨酰胺(Gln),然后刺激与Gln浓度表示。代表全细胞溶解产物的免疫印迹图像探测显示抗体(上)和量化表示pS6K / S6K比率的条件(n = 9,底部)。(D)世行分析WT Panc1 pS6K的KO Panc1或KO Panc1细胞re-expressing WT或激酶死(KD)版本的tGFP-PI3K-C2γ谷氨酰胺消耗后2小时。代表全细胞溶解产物的免疫印迹图像探测和显示抗体(左)和量化表示pS6K / S6K比率的条件(n = 4,对吧)。π(E)量化(3,4)P2浓度WT / KO Panc1细胞缺乏谷氨酰胺(Gln),然后刺激与Gln表示浓度(n = 5)。数据显示为±SEM,方差分析后跟Bonferroni事后测试,否则表示。方差分析,方差分析;包含IHC,免疫组织化学;mTORC1,复杂机械的雷帕霉素靶1; KPC, LSL-KrasG12D/+;LSL-Trp53R172H/+;Pdx-1-Cre; PCNA, proliferating cell nuclear antigen; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma. **P<0.01; ***p<0.001.

    此外,再植术原发性肿瘤细胞来源于WT和KO肿瘤(在线补充图开通)同基因的老鼠表示,KPC KO肿瘤生长速度显著增加和发展比WT控件(转移在线补充图S2C, D)。因此,KPC KO细胞显示增加了细胞生长和侵袭性能力比WT细胞,因此缺乏PI3K-C2γ提供支持细胞自动增长优势(图1 h和在线补充图S2E)。

    评估人类PDAC PI3K-C2γ细胞功能的影响,我们使用CRISPR淘汰PIK3C2G基因/ Cas9三PDAC细胞系(Panc1 Capan1和MiaPaca2)。至于老鼠,内生PI3K-C2γ无法检测到免疫印迹但淘汰赛的性质是经rt - pcr (在线补充图S2F-H)以及免疫组织化学(在线补充图S2I)。PI3K-C2γ-deficient Panc1, Capan1和MiaPaca2细胞显示细胞数显著高于WT控件(图1我和在线补充图S2J, K)。另外,我们观察到的ERK信号增加(在线补充图S2L, M)PI3K-C2γ-deleted细胞符合其增强的细胞数量。最后,在人类和小鼠KO细胞增殖增加确认PCNA-stained部分从KPC肿瘤(图2一个)或异种移植模型(在线补充图S3A)。

    建议这些发现在PI3K-C2γ-deficient PDAC细胞信号通路控制细胞生长的内在缺陷,在支持这一假说,磷酸化mTORC1通路效应器,S6K和4 epb1,被发现在小鼠KPC KO高于WT控件(在线补充图S3B)。还在进一步的协议,人类KO细胞显示异常升高mTORC1途径激活,随着每增加4 ebp1 S6K磷酸化(在线补充图S3C, D)。

    PI3K-C2γ激酶活性对mTORC1镇压在谷氨酰胺剥夺至关重要

    我们下一个评估的磷酸化mTORC1下游效应器4 ebp1和S6的免疫组织化学PDAC样本。在肿瘤PI3K-C2γ得分< 1,PDAC 4/12例(33.3%)phospho-4EBP1积极在肿瘤PI3K-C2γ分数≥1,PDAC 6/25例(24.0%)phospho-4E-BP1正面的(在线补充图S3E)。我们观察到的趋势增加p4E-BP1和减少PI3K-C2γ表达式或增加魔法石第六章但相关性不显著。更强的证明mTORC1通路激活在魔法石第六章的染色证明,魔法石第六章之间显著负相关,PI3K-C2γ通过χ(n = 45, p = 0.042测试)被发现在PDAC患者分层PI3K-C2γ表达式(图2 b和在线补充图S3F)。同样,魔法石第六章更明显出现在部分比WT控件(KPC KO小鼠肿瘤图2一个),从而表明,PI3K-C2γ损失,mTORC1 hyperactivation发生在人类和小鼠PDAC样本。

    因此,我们测试了PI3K-C2γ的损失如何影响在PDAC mTORC1信号通过分析在不同生长条件下上游调节器和下游效应器。首先,我们测试是否激活的血清PI3K-dependent mTORC1活化剂Akt1 Akt2是不同的在KO WT KO细胞以及细胞重组与WT或激酶(KD) PI3K-C2γ死了。PI3K-C2γ的损失或其表达,并不影响Akt1/2磷酸化在所有测试条件(在线补充图S4A-D),因此建议一个更直接的行动,有可能兼容PI3K-C2γ产品π(3,4)直接抑制mTORC1 P2。13日14接下来,磷酸化的S6K血清反应不足进行了分析,发现有说服力地减少基因型(在线补充图S3C, D)。然而,pS6K仍略高于快速增长KO细胞独立存在与否的血清(在线补充图S3C, D)。活动mTORC1复杂也可以由氨基酸29日WT细胞,减少谷氨酰胺浓度导致剂量依赖性降低serum-induced S6K磷酸化(图2 c,在线S3B-D补充数据和S4E(输入))。相反,当KO细胞生长在血清的存在,但在限制数量的谷氨酰胺,pS6K居高不下不管谷氨酰胺水平(图2 c,在线S3B-D补充数据和S4E(输入),从而表明损失PI3K-C2γ删除一个抑制行动mTORC1信号以响应谷氨酰胺不足。符合这一假说,mTORC1复杂的催化活性,在一个激酶试验评估没有谷氨酰胺,在WT控件(KO细胞高于在线S4E补充数据,F)。在同一谷氨酰胺的条件不足,再添加的WT但不是KD PI3K-C2γ恢复pS6K的水平(图2 d)。此外,当谷氨酰胺是退出WT细胞最大的生产π(3、4)P2 (图2 e),一个PI3K-C2γ产品17能够抑制mTORC1活动,13发生一起强烈减少S6K磷酸化(图2 c)。相反,失去PI3K-C2γ大大削弱了这种磷酸肌醇的合成,以应对低谷氨酰胺,pS6K持续高企,因此需要证明PI3K-C2γ生产mTORC1 -调节器π(3,4)P2没有谷氨酰胺在小鼠和人类PDAC细胞(图2 c和E和在线补充图S4G)。,这些观察结果支持模型,谷氨酰胺不足导致的累积PI3K-C2γ-generated池π(3、4)P2,进而降低mTORC1活动,可能微调蛋白质合成氨基酸的可用性。

    PI3K-C2γ脂质产品新兵ASAP1溶酶体在谷氨酰胺消耗

    符合S6K磷酸化的增加谷氨酰胺撤军,PI3K-C2γ损失增强mTOR本地化溶酶体(在线补充图S4H-I),mTORC1激活优先发生。30.接下来,PI3K-C2γWT Panc1或Cos7细胞亚细胞本地化测试cotransfected tGFP-PI3K-C2γ和miRFP-Lamp1。PI3K-C2γ-Lamp1积极结构的数量显著增加谷氨酰胺撤军(图3 a和B和在线补充图S5A, B),从而表明PI3K-C2γ丰富谷氨酰胺溶酶体的不足。接下来,验证PI3K-C2γ脂质激酶活动发生在溶酶体,tGFP-PI3K-C2γ−miRFP-Lamp1细胞与荧光传感器cotransfected NES-mCherry-cPHX3专门检测π(3,4)P2。Colocalisation的三个信号在活细胞成像,观察表明,在缺乏谷氨酰胺,PI3K-C2γ发挥其催化活性抑制mTORC1激活溶酶体(图3 c, D和在线补充图S5C-F)。

    PI3K-C2γ-derived PI(3,4)P2 inhibits Arf1 activity. (A, B) Localisation of PI3K-C2γ on Lamp1-positive lysosomes. Representative confocal images of tGFP-labelled PI3K-C2γ and miRFP-labelled LAMP1 in normal culture conditions (NC), (A) or on glutamine withdrawal (0 mM Gln), (B) for 2 hours in Panc1 cells. Dashed white line defines cell limits. White arrows indicate colocalisation of the indicated proteins (scale bar=10 µm). (C, D) Localisation of PI3K-C2γ and PI(3,4)P2 on Lamp1-positive lysosomes. Representative confocal images of tGFP-labelled PI3K-C2γ, mCherry-labelled PHX3 (probe for the detection of PI(3,4)P2) and miRFP-labelled LAMP1 in normal culture conditions (NC), (C) or on glutamine withdrawal (0 mM Gln), (D) in Panc1 cells. Dashed white line defines cell limits. White arrows indicate colocalisation of the indicated proteins (scale bar=10 µm). (E, F) PD of endogenous active ARF1 in WT/KO Panc1 cells on glutamine withdrawal. Quantification of active ARF1 pulled-down by GST (F, n=5). (G, H) PD of endogenous active ARF1 in WT, KO Panc1 or KO Panc1 cells re-expressing either tGFP-PI3K-C2γ WT or tGFP-PI3K-C2γ kD (kinase dead) on glutamine withdrawal for 2 hours. Representative Western blot images of active ARF1 PD assay probed with indicated antibodies (G). Quantification of active ARF1 pulled-down by GST (H, n=5). Data are shown as mean±SEM, ANOVA followed by Student’s t-test (F) or Bonferroni’s post hoc test (H). ANOVA, analysis of variance; PD, pull down; Tl, total lysate. **P<0.01.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    PI3K-C2γ-derivedπ(3、4)P2抑制Arf1活动。(A, B)本地化PI3K-C2γLamp1-positive溶酶体。代表共焦图像tGFP-labelled PI3K-C2γ和miRFP-labelled LAMP1在正常培养条件(数控),(A)或谷氨酰胺(Gln 0毫米),撤军在Panc1细胞(B) 2小时。白色虚线定义单元的限制。白色箭头表示colocalisation的蛋白质(比例尺= 10µm)表示。(C, D)本地化PI3K-C2γ和π(3,4)P2 Lamp1-positive溶酶体。代表共焦图像tGFP-labelled PI3K-C2γ,mCherry-labelled PHX3(检测探头的π(3、4)P2)和miRFP-labelled LAMP1在正常培养条件(NC)、(C)和谷氨酰胺(Gln 0毫米),撤军在Panc1细胞(D)。白色虚线定义单元的限制。白色箭头表示colocalisation的蛋白质(比例尺= 10µm)表示。(E, F) PD的内源性活性ARF1 WT / KO Panc1细胞谷氨酰胺撤军。 Quantification of active ARF1 pulled-down by GST (F, n=5). (G, H) PD of endogenous active ARF1 in WT, KO Panc1 or KO Panc1 cells re-expressing either tGFP-PI3K-C2γ WT or tGFP-PI3K-C2γ kD (kinase dead) on glutamine withdrawal for 2 hours. Representative Western blot images of active ARF1 PD assay probed with indicated antibodies (G). Quantification of active ARF1 pulled-down by GST (H, n=5). Data are shown as mean±SEM, ANOVA followed by Student’s t-test (F) or Bonferroni’s post hoc test (H). ANOVA, analysis of variance; PD, pull down; Tl, total lysate. **P<0.01.

    鉴于glutamine-mediated mTORC1激活取决于核苷酸骑车的小GTPase ADP核糖基化因子- 1 (Arf1),31日32我们测试是否需要PI3K-C2γArf1的过渡到不活跃的状态。下拉Arf1 GTP-bound活性形式的实验证明PI3K-C2γ与高架Arf1活动有关的损失在细胞模型(图3中情况和在线补充图S5G)和在肿瘤来源于异种移植实验中(在线补充图S5H,我)。进一步验证所产生的脂质产品PI3K-C2γ需要调节Arf1活动,我们重新KD PI3K-C2γKO模型。虽然WT PI3K-C2γ足够的外源表达,禁用Arf1 (图3 g和H)和限制mTOR (图2 d),表达式的KD突变不能改变Arf1活动(图3 g和H)。

    我们下一个假定的π(3,4)Asap1 P2可以构成对接网站(一个rfGAP与年代H3域,一个NK重复和PH domain-containing蛋白质),Arf1抑制所需蛋白质。33 34使用共焦成像,我们发现Asap1和PI3K-C2γcolocalised Lamp1积极谷氨酰胺消耗囊泡(图4 a, B)。相反,Asap1未能本土化的溶酶体cotransfected PI3K-C2γKD突变时应对饥饿谷氨酰胺(图4 c, D)。一致,PI3K-C2γ损失减少的colocalisation Asap1 Lamp1 (在线补充图S6A)。此外,我们发现Asap1 colocalises与π(3,4)P2 (NES-mCherry-cPHX3探头检测到的)Lamp1正泡在实时成像实验(图4 e, F)。

    PI3K-C2γ-derived PI(3,4)P2 recruits Asap1 that inhibits Arf1 activity. (A, B) Localisation of PI3K-C2γ and Asap1 on Lamp1-positive lysosomes. Representative confocal images of tGFP-labelled PI3K-C2γ, mCherry-labelled ASAP1 and miRFP-labelled LAMP1 in normal culture conditions (NC, (A) or on glutamine withdrawal (0 mM Gln, (B) in Cos7 cells. Dashed white line defines cell limits. White arrows indicate colocalisation of the indicated proteins (scale bar=10 µm). (C, D) Localisation of PI3K-C2γ KD (kinase dead) and Asap1 on Lamp1-positive lysosomes. Representative confocal images of tGFP-labelled PI3K-C2γ KD, mCherry-labelled Asap1 and miRFP-labelled Lamp1 in normal culture conditions (NC, (C) or on glutamine withdrawal (0 mM Gln, (D) in Cos7 cells (scale bar=10 µm). (E, F) Localisation of PI(3,4)P2 and Asap1 on Lamp1-positive lysosomes. Representative confocal images of GFP-labelled PHX3, mCherry-labelled Asap1 and miRFP-labelled Lamp1 in normal culture conditions (NC), (E) or on glutamine withdrawal (0 mM Gln), (F) in Cos7 cells. Dashed white line defines cell limits. White arrows indicate colocalisation of the indicated proteins (scale bar=10 µm). (G) PD of endogenous active Arf1 and western blot analysis of mTORC1 activity probed with indicated antibodies in WT, Asap1 KO overexpressing tGFP or tGFP-PI3K-C2γ on glutamine withdrawal in Panc1 cells. mTORC1, mechanistic target of rapamycin complex 1; PD, pull down, TL, total lysate.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    PI3K-C2γ-derivedπ(3、4)P2新兵Asap1抑制Arf1活动。(A, B)本地化PI3K-C2γ和Asap1 Lamp1-positive溶酶体。代表共焦图像tGFP-labelled PI3K-C2γ,mCherry-labelled ASAP1和miRFP-labelled LAMP1在正常培养条件(数控、(A)或谷氨酰胺(Gln 0毫米,撤军在Cos7细胞(B)。白色虚线定义单元的限制。白色箭头表示colocalisation的蛋白质(比例尺= 10µm)表示。(C, D)本地化PI3K-C2γKD(激酶死亡)和Asap1 Lamp1-positive溶酶体。代表共焦图像tGFP-labelled PI3K-C2γKD, mCherry-labelled Asap1和miRFP-labelled Lamp1在正常培养条件(NC (C),或谷氨酰胺(Gln 0毫米,撤军(D)在Cos7细胞(比例尺= 10µm)。(E, F)本地化的π(3,4)P2和Asap1 Lamp1-positive溶酶体。代表共焦图像GFP-labelled PHX3, mCherry-labelled Asap1和miRFP-labelled Lamp1在正常培养条件(NC)、(E)和谷氨酰胺(Gln 0毫米),撤军在Cos7细胞(F)。白色虚线定义单元的限制。 White arrows indicate colocalisation of the indicated proteins (scale bar=10 µm). (G) PD of endogenous active Arf1 and western blot analysis of mTORC1 activity probed with indicated antibodies in WT, Asap1 KO overexpressing tGFP or tGFP-PI3K-C2γ on glutamine withdrawal in Panc1 cells. mTORC1, mechanistic target of rapamycin complex 1; PD, pull down, TL, total lysate.

    证明PI3K-C2γ-derivedπ(3、4)P2负责Asap1-Arf1轴的规定,我们表明,Asap1可以将不仅与π(4、5)P2,先前报道,34但也与π(3、4)P2 (在线补充图S6B, C)。正如所料,没有Asap1高架活动Arf1(的水平图4 g),但表达PI3K-C2γ没有救援活动Arf1水平,表明PI3K-C2γ上位Asap1 (图4 g)。符合Arf1激活,pS6K水平高Asap1 KO细胞与WT控件(图4 g)。进一步验证脂质产品之间的交互π(3,4)P2和Asap1调节Arf1活动,需要我们mutagenised PH Asap1域(R345L)干扰的能力与πP2 (3、4),35但不是π(4、5)P2 (在线补充图S6B, C)。我们发现表达Asap1 R345L Asap1 KO细胞无法禁用Arf1 (在线补充图S6D),这表明所产生的π(3,4)P2 PI3K-C2γ在溶酶体需要Asap1-mediated Arf1抑制谷氨酰胺消耗。

    失去PI3K-C2γ促进谷氨酰胺代谢重新布线

    接下来,我们专注于PI3K-C2γ-dependent调节细胞代谢。我们监控WT KO细胞使用的分解代谢的依赖海马XF96水压力测试来衡量在实时条件下耗氧率。分析表明,基底和最大呼吸比WT控件(KO细胞显著降低图5 a - c和在线补充图S7A-C)。谷氨酰胺提款24小时显著下降WT细胞的呼吸能力而KO细胞(轻微影响图5 a - c),这表明在KO细胞中谷氨酰胺的分解代谢的贡献可以忽略不计。更高的备用KO细胞的呼吸能力(图5 d和在线补充图S7D)与增强糖酵解代谢有关,由葡萄糖消耗和乳酸释放增加(如图所示图5 e, F和在线补充图S7E, F)。因此,我们假设,glutamine-auxotrophy PI3K-C2γKO细胞可能是由于潜在的non-energetic谷氨酰胺的作用。接下来,我们测量放射性并入细胞中的脂质,使用均匀(U)放射性标记的培养14C-glutamine。使用谷氨酰胺碳单位KO细胞的脂质和蛋白质合成是高于WT控件(图5 g, H),从而表明谷氨酰胺碳骨架消费支持合成代谢途径。

    PI3K-C2γ loss induces metabolic rewiring towards the anabolic use of glutamine (A–D) seahorse XFe96 MITO stress test analysis and Oxygen Consumption Rate (OCR) was measured in real time in normal culture condition (2 mM Gln) or on 24 hours of glutamine withdrawal (0 mM Gln 24 hours) (n=3). Basal (B), maximal (C) and spare (D) OCR were measured and normalised on protein levels (n=3). Gln=glutamine, oligo=oligomycin, FCCP=carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone, Rot/AntA=rotenone/antimycin. (E) Quantification of glucose consumption in normal culture conditions (2 mM Gln) of WT/KO Panc1 cells (n=5). (F) Quantification of lactate production in normal culture conditions (2 mM Gln) of WT/KO Panc1 cells (n=5). (G, H) WT/KO KPC cells were cultured for 24 hours in a medium containing radioactive 14C-glutamine. Lipids and proteins were extracted in parallel and radioactive signal was measured to monitor the amount of glutamine that is incorporated into lipids (G) and proteins (H). Each value was normalised on protein content (n=3). (I) Cell viability assay on WT/KO Panc1 cells at indicated glutamine concentrations after 24 hours (n=5). (J) Growth assay of WT/KO Panc1 cells in normal culture conditions (2 mM Gln) or on glutamine withdrawal (0 mM Gln) (n=5). #: KO 2 mM Gln vs KO 0 mM Gln); *: WT 0 mM Gln vs KO 0 mM Gln. Data are shown as mean±SEM, ANOVA followed by Bonferroni’s post hoc test (B–D, I, J) or Student’s t-test (E–H). ANOVA, analysis of variance. *P<0.05; **P<0.01; ***p<0.001; ***#<0.001.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    PI3K-C2γ损失引发代谢重新布线对谷氨酰胺的合成使用(模拟)海马XFe96水压力测试分析和耗氧速率(OCR)实时测量正常文化条件(2 mM Gln)或24小时内谷氨酰胺撤军(0毫米Gln 24小时)(n = 3)。基底(B),最大(C)和备用(D)测量OCR和蛋白质水平正常化(n = 3)。Gln =谷氨酰胺,益生元=寡霉素,FCCP =羰基cyanide-4 (trifluoromethoxy)苯腙,腐烂/安踏=鱼藤酮/抗霉素。(E)量化的葡萄糖消耗在正常培养条件(2 mM Gln) WT / KO Panc1细胞(n = 5)。(F)量化乳酸生产在正常培养条件(2 mM Gln) WT / KO Panc1细胞(n = 5)。(G, H) WT / KO KPC细胞培养24小时中含有放射性14C-glutamine。脂质和蛋白质提取并行和放射性信号测量监控的谷氨酰胺量纳入脂质(G)和蛋白质(H)。每个值是正常蛋白质含量(n = 3)。(我)在WT / KO Panc1细胞细胞生存能力分析表明谷氨酰胺浓度后24小时(n = 5)。(J)增长分析WT / KO Panc1细胞在正常培养条件(2 mM Gln)或谷氨酰胺撤军(0毫米Gln) (n = 5)。#:KO 2毫米Gln vs KO 0毫米Gln);*:Gln WT 0毫米Gln vs KO 0毫米。数据显示为±SEM,方差分析后跟Bonferroni事后测试(罪犯,I, J)或学生的学习任务(情况)。方差分析,方差分析。* P < 0.05;* * P < 0.01; ***p<0.001; ***#<0.001.

    谷氨酰胺限制废除PI3K-C2γ-deficient细胞的生长

    随后,我们探索PI3K-C2γ-deficient的谷氨酰胺和葡萄糖依赖性肿瘤。当葡萄糖所需PDAC增长WT和KO细胞(在线补充图S7G, H),大多数KO细胞没有增殖谷氨酰胺撤军(图5我和在线补充图S7I)。验证谷氨酰胺对细胞生长的影响,WT和KO细胞培养谷氨酰胺的存在与否。在正常生长条件,KO细胞表现出细胞数显著高于WT控制但谷氨酰胺撤军显著阻碍了这种增长,确认KO细胞glutamine-addicted (图5 j和在线补充图S7J)。接下来,我们测试如果不同glutaminemetabolising通路可以挽救的增长赤字KO细胞谷氨酰胺不足。补充的BSA-conjugated棕榈酸酯,特别是获救的生存WT控件(KO细胞而没有影响在线补充图S7K)。相反,单独添加BSA没有提高细胞存活率在KO或WT细胞,因此只表明外源性脂肪酸供应前体可以绕过谷氨酰胺不足。

    失去PI3K-C2γtslp胰腺癌细胞mTOR和GLS1抑制剂

    从药理学上复制的敏化作用谷氨酰胺消耗在PI3K-C2γ的缺席,我们测试了双极性晶体管的影响(Bis-2 - (5-phenylacetamido-1 3 4-thiadiazol-2-yl)乙基硫醚)和cb - 839 (Telaglenastat),两个强有力的谷氨酰胺酶的抑制剂1 (GLS1)活动。36像谷氨酰胺饥饿、双极性晶体管管理局(在线补充图S8A, B)以及cb - 839 (图6和在线补充图S8C, DKO)剂量依赖性抑制增长的细胞,证实PI3K-C2γ-deficient细胞对谷氨酰胺代谢,药理抑制glutaminolysis可以拟表型谷氨酰胺限制的影响(图5我和在线补充图S7I)。GLS1抑制剂治疗增加了KO细胞的凋亡水平,就是明证caspase-3/7活动水平(在线补充图S8E)而不影响上游S6K的磷酸化状态37(在线补充图S8F, G)。不同于WT, KO细胞表现出持续AMPK磷酸化反应cb - 839管理局(在线补充图S8H),表明干扰谷氨酰胺代谢强烈激活代谢压力信号。Everolimus管理(RAD001),雷帕霉素抑制mTORC1模拟,更有效地降低扩散KO细胞比WT控制,确认的关键作用mTORC1 hyperactivation PI3K-C2γKO细胞(图6和在线补充图S8D)。同样,要么Everolimus治疗的低谷氨酰胺(0.1毫米,在线补充图S8I与cb - 839)或组合管理Everolimus显著阻碍PI3K-C2γKO比WT控制细胞生长,细胞和出现比单一疗法更有效(图6,在线补充图S8D和表S3)。

    PI3K-C2γ loss sensitises to glutaminase inhibitors in xenograft models. (A) Cell viability assay on WT/KO Panc1 cells after 48 hours of treatment with CB 839 (5 μM), everolimus (2.5 µM) or combination of the two drugs (Combo, n=6). (B) quantification of xenograft tumour growth arising from subcutaneously injected WT/KO Panc1 cells. Mice were treated for 2.5 weeks (w) with intraperitoneal injections of vehicle (NT), BPTES, everolimus (EVR) or combination (COMBO) of the two drugs (n=6). Schematic representation of drugs administration (bottom panels). (C) IHC assessment of the level of PCNA (top) and pS6 (bottom) in tumours taken from mice injected with WT/KO Panc1 cells treated with vehicle (NT), BPTES, everolimus (EVR) or combination (COMBO) of the two drugs for 2.5 weeks. (D) quantification of xenograft tumour growth arising from subcutaneously injected WT/KO KPC cells. Mice were treated for 2.5 weeks (w) with intraperitoneal injections of vehicle (NT), BPTES, everolimus (EVR) or combination (COMBO) of the two drugs (n=6). Schematic representation of drugs administration (bottom panels). Data are shown as mean±SEM, ANOVA followed by Bonferroni’s post hoc test. ANOVA, analysis of variance. *P<0.05; **P<0.01; ***p<0.001.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    PI3K-C2γ损失tslp谷氨酰胺酶抑制剂在异种移植模型。(A)细胞生存能力分析WT / KO Panc1细胞治疗48小时后与CB 839(5μM), everolimus(2.5µM)或组合的两种药物(组合,n = 6)。(B)量化的异种移植肿瘤生长起源于皮下注射WT / KO Panc1细胞。小鼠治疗2.5周(w)与腹腔内注射的车辆(NT)、双极性晶体管,everolimus(应答)或组合(组合)的两种药物(n = 6)。的示意图表示药物管理局(底部面板)。(C)包含IHC增殖细胞核抗原(上)的评估水平和魔法石第六章(下)在肿瘤取自小鼠注射WT / KO Panc1细胞处理车辆(NT)、双极性晶体管,everolimus(应答)或两种药物的组合(组合)为2.5周。(D)量化的异种移植肿瘤生长起源于皮下注射WT / KO KPC细胞。小鼠治疗2.5周(w)与腹腔内注射的车辆(NT)、双极性晶体管,everolimus(应答)或组合(组合)的两种药物(n = 6)。的示意图表示药物管理局(底部面板)。数据显示为±SEM,方差分析Bonferroni事后测试紧随其后。 ANOVA, analysis of variance. *P<0.05; **P<0.01; ***p<0.001.

    探讨抗肿瘤联合治疗体内的潜力,我们首先分析了usingPanc1细胞异种移植肿瘤模型。everolimus管理/双极性晶体管单独或结合产生耐受性良好,没有明显的发病率或死亡率在老鼠身上。体内Everolimus并不影响增长管理WT Panc1异种移植,但在2.5周的治疗,这种药物似乎有效地抑制增长PI3K-C2γ-deficient肿瘤(p < 0.001;图6 b)。同样,双极性晶体管更强烈地抑制肿瘤生长在KO WT Panc1异种移植(p < 0.05;图6 b)。此外,Everolimus和双极性晶体管的组合导致更强的抗癌的回应,这是再一次KO的更明显比WT异种移植(p < 0.001;图6 b)。一致,PI3K-C2γ删除肿瘤治疗的联合治疗表现出降低水平与WT相比PCNA染色和未经处理的KO控件(图6 c)。符合体外数据,Everolimus但不是双极性晶体管治疗减少S6磷酸化在肿瘤样本(图6 c)。在第二个小鼠模型也得到了相似的结果,KPC小鼠细胞同源的小鼠皮下注射(图6 d和S9A)。最后,功效everolimus /双极性晶体管的组合测试KPC小鼠模型(在线补充图S9B-D)。T2 wMRI显示腹水和胰腺肿瘤的存在,出现在所有异构hyperintense结节组(在线补充图S9B)。组合治疗延迟发展,改善肿瘤边缘的定义,和减少腹部传播(在线补充图S9B)。因此,组合治疗显著增加KO小鼠的生存(100% vs 80%生存在8周的组合和vehicle-treated KO小鼠,分别;n = 5 /组,p = 0.01 log-rank Mantel-Cox测试,在线补充图S9C)。与以前的结果一致,PCNA在KPC KO没那么强烈的肿瘤治疗与治疗的组合比KO控件(WT肿瘤或未经处理的样品在线补充图S9D)。总的来说,这些结果表明,PI3K-C2γKO联合治疗更有效的遗传背景,证明损失PI3K-C2γtslp胰腺癌细胞和肿瘤mTOR GLS1抑制剂(在线补充图S10)。

    讨论

    胰腺癌是最恶性肿瘤之一,目前只有最小有效治疗这种疾病。胰腺癌的新陈代谢是适应支持肿瘤生长不肥沃的环境。2

    细胞生长和养分有效性的核心积分器mTOR通路,使代谢重编程支持癌症细胞的生物合成的需要。38虽然mTOR激活我PI3K类,我们的研究结果表明,二类PI3K-C2γ充当消极的mTOR信号调节器,与以前的结果。13这一事实二类PI3K工作不同于类我巩固和酶,而类我PI3K致癌基因的作用是建立,二类PI3K正在成为肿瘤抑制控制细胞分裂39以及其他细胞功能与细胞生长有关。12 16 40在这项研究中,我们表明,老鼠PI3K-C2γ带来的损失胰腺癌细胞的生长优势,关联的hyperactivation mTORC1信号和代谢转向谷氨酰胺依赖。在协议,增加S6的磷酸化与减少表达式PI3K-C2γ的患者群。虽然只能证明这一趋势mTORC1效应,像4 ebp1,这种潜在的不一致性可能不仅归功于相对较少的样本分析(n = 37)还要4 ebp1的能力受mTORC1以外的多种途径。41进一步支持我们的假设,减少PI3K-C2γ与不良预后相关的表达和表型更具侵略性,不仅表明PDAC PI3K-C2γ作为一个肿瘤抑制基因的功能,但也表明这种蛋白质的作用作为一个潜在的预后的生物标志物。

    在分子水平上,我们的研究结果表明,PI3K-C2γ抑制mTORC1活动在溶酶体通过π的生产限制池(3,4)P2对谷氨酰胺撤军。各种感受器传递抑制信号抑制mTORC1活动,11 30包括二类PI3K-C2β同种型。13然而,虽然PI3K-C2β作用于生长因子不足,13日14我们的研究结果表明,PI3K-C2γ选择性响应谷氨酰胺饥饿。特别是,谷氨酰胺剥夺夫妇PI3K-C2γ活动mTORC1信号,导致的累积PI3K-C2γ-generated池π(3、4)P2,进而减少S6K磷酸化。如何PI3K-C2γ易位溶酶体是由谷氨酰胺可用性是在这个阶段不清楚,未来的研究的重点。然而,我们的研究结果与磷脂中扮演重要角色的控制通过对接PH-domain含有蛋白质的代谢反应。15 42

    同意的既定角色mTORC1在促进合成代谢反应,30.我们的研究结果表明,失去PI3K-C2γ就让谷氨酰胺代谢支持脂质和蛋白质的生物合成,维持KO细胞的高增长率。然而,PI3K-C2γ-deficient肿瘤未能限制mTORC1信号和合成代谢过程导致谷氨酰胺成瘾可以把有害当谷氨酰胺水平下降。我们的研究结果表明,细胞缺乏PI3K-C2γ成为谷氨酰胺营养缺陷型的,一个条件,正是几个glutamine-dependent肿瘤。7在PI3K-C2γ-deficient肿瘤,谷氨酰胺消费从而超过其生物合成,导致合成PI3K-C2γ和谷氨酰胺饥饿的损失之间的杀伤力。因此,PI3K-C2γKO肿瘤无法抑制细胞生长在营养限制条件导致代谢灾难,一种合成高需求的代谢状态对比,能源生产不足。43基于这些研究结果,针对PI3K-C2γ-deficient代谢表型的肿瘤可以进一步利用特定在胰腺癌的治疗策略。

    这个关键的角色谷氨酰胺在胰腺癌中了谷氨酰胺利用率药理的发展战略目标。4谷氨酰胺代谢的一个至关重要的一步,支持肿瘤生长是其转换酶谷氨酰胺酶的谷氨酸(GLS1)。GLS1抑制剂,如cb - 839,显示PDAC患者的临床益处44(NCT03263429)。此外,联合治疗与Everolimus cb - 839是目前先进的固体肿瘤患者进行临床试验(NCT02071862),这表明该药物组合是耐受性良好。45然而,生物标志物需要识别不同的病人可以得到最高的群体受益谷氨酰胺酶抑制剂。

    我们的发现提供了一个理由针对谷氨酰胺代谢结合mTOR在肿瘤PI3K-C2γ和活跃mTOR信号的表达式。此外,我们的研究表明,针对PI3K-C2γ或其下游效应器可能推出代谢可以进一步利用的漏洞为胰腺癌的治疗,如果cotreated mTOR。

    数据可用性声明

    数据在公共、开放访问存储库。合理的请求数据。所有数据都包含在相关研究文章或上传在线补充信息。不适用。

    伦理语句

    病人同意出版

    伦理批准

    伦理批准1885号综合大学医院的信任(AOUI)伦理委员会(Comitato Etico Azienda Ospedaliera大学联盟Integrata)批准于2010年11月17日的会议和记录的伦理委员会2010年11月22日52070 / CE和正式的卫生主任AOUI的总经理与协议52 2010年11月23日438年。研究协议是经当地大学医院伦理委员会批准的比萨,意大利(Comitato di Bioetica Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana,协议编号:3909年7月第三,2013)。

    确认

    我们感谢教授安德里亚·Graziani塞Menga博士关于柯西莫坎卡洛博士教授Vincenzo Calautti,里卡多Taulli教授和教授奇亚拉Ambrogio批判性阅读手稿和有用的讨论。我们承认开放实验室先进的显微镜(OLMA)在分子生物技术中心(MBC)支持和Euro-BioImaging (www.eurobioimaging.eu)提供成像技术和服务节点通过多通道分子成像意大利(意大利都灵)。PanCuRx队列用于本研究的数据生成安大略癌症研究所的支持下通过安大略省政府提供的资金。

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    补充材料

    • 补充数据

      仅这个web文件已经由英国医学杂志出版集团从一个电子文件提供的作者(年代)和没有对内容进行编辑。

    脚注

    • 推特@SilviaAndreani7

    • 嗯,MM同样起到了推波助澜的作用。

    • 贡献者范本:价格上调,呃,MM;方法:背景、LG、AC、摩根大通FG, EDG, RL, GS, SA, PD,简历,如VC、PEP,,呃,MM;数据管理:PD,简历和VCValidation:价格上调,呃,MM;正式分析:文章、LG、AC,呃,摩根大通,FG, EM,问,MB, RL, GS, SA, PD,简历,如VC,和MM。调查:价格上调,LG, AC,呃,摩根大通,FG, EM,问,MB, RL, GS, SA, PD,简历,如VC,和MM。资源:PDAC, FN,简历,如VC,如;原创作品草稿准备,匆忙,嗯,MM;可视化:价格上调,呃,MM;监督:VC, PEP,,呃,MM;项目管理:价格上调,呃,MM;资金收购:呃,MM;担保人:价格上调,呃,毫米。

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    • 相互竞争的利益嗯是朋友生物科技的创始人,公司参与PI3K抑制剂的发展。作者声明没有潜在的利益冲突。

    • 病人和公众参与病人和/或公众没有参与设计,或行为,或报告,或传播本研究计划。

    • 出处和同行评议不是委托;外部同行评议。

    • 补充材料此内容已由作者(年代)。尚未审查由BMJ出版集团有限公司(BMJ)和可能没有被同行评议。任何意见或建议讨论仅代表作者(年代)和不了BMJ的支持。和责任起源于BMJ概不负责任何依赖的内容。内容包括任何翻译材料,BMJ并不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南,术语,药物名称和药物剂量),和不负责任何错误或遗漏引起的翻译和改编或否则。