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摘要
客观的需要一种预防性疫苗来控制HCV流行，全球80%的感染是由1-3基因型引起的。疫苗开发受到HCV异质性、病毒逃逸(包括保守中和抗原表位的保护)和HCV细胞培养系统的次优疗效的阻碍。我们开发了基于细胞培养的1-3基因型HCV灭活疫苗候选，以呈现天然折叠包膜蛋白来诱导中和抗体。
设计通过在Huh7.5细胞中连续传代TNcc、J6cc和DBN3acc，并通过下一代测序检测获得性突变，获得1a、2a和3a型HCV的高产基因型。使用人单克隆抗体AR3A和AR4A以及多克隆抗体C211在基于细胞的中和试验中确定中和表位暴露。使用许可佐剂MF-59的同源物AddaVax对BALB/c小鼠进行处理和灭活基因型1a、2a或3a病毒免疫。测定纯化小鼠和患者血清中IgG的中和能力;小鼠IgG和免疫血清检测E1/E2结合。
结果与原始病毒相比，高产病毒的传染性滴度(峰值滴度:6-7 log10聚焦形成单位(FFU)/mL)增加了约1000倍，保守中和抗原表位暴露增加了约2470倍。广谱中和基因型1-6型HCV IgG (EC50: 30-193 μ g/mL;平均71 μ g/mL)，明显优于慢性感染患者IgG，结合基因型为1-3 E1/E2;免疫血清终点滴度达32 000。
结论高产量基因型1-3型HCV可以作为在小鼠中诱导广泛中和抗体的灭活疫苗候选的基础，支持进一步的临床前开发。
- 丙肝病毒
- 丙型肝炎
- 慢性病毒性肝炎
- 分子生物学
- 免疫反应
数据可用性声明
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这是一篇根据创作共用署名非商业性(CC BY-NC 4.0)许可发布的开放获取文章，该许可允许其他人以非商业的方式发布、重新制作、改编、构建本作品，并以不同的条款授权他们的衍生作品，前提是正确引用了原始作品，给出了适当的荣誉，表明了所做的任何更改，并且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．
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关于这个话题已经知道了什么
需要一种预防性疫苗来控制正在流行的丙肝病毒。
HCV具有较大的遗传异质性，基因型1、2和3导致全球80%的感染。
中和抗体是疫苗保护的关键免疫相关因素，可以预防慢性丙肝病毒感染。
这种保护与广泛中和不同HCV基因型和靶向保守中和表位的抗体有关。
对于HCV来说，全病毒灭活疫苗策略具有吸引力，因为它能够呈现HCV包膜糖蛋白复合物的自然构象，并诱导中和抗体。
目前可用的细胞培养系统中HCV产量低，阻碍了此类疫苗的开发。
这项研究补充了什么
基于之前开发的细胞培养感染HCV重组体，我们开发了在细胞培养中高滴度生长的高产量基因型1、2和3 HCV重组体。
与原始病毒相比，高产病毒显示出更多的暴露保守抗原表位，这些抗原表位是通过中和抗体来对抗HCV感染的。
分别基于灭活基因型1、2或3 HCV的候选疫苗，以及与许可的MF-59佐剂类似的佐剂，具有诱导广泛中和所有主要基因型HCV的抗体的能力，具有公认的流行病学重要性。
这项研究将如何影响研究、实践或政策
这项研究是HCV候选灭活疫苗临床前开发的一个里程碑。
在完成临床前开发(包括优化疫苗生产条件)后，已确定的候选疫苗可进入临床开发。
预防丙型肝炎疫苗是预防每年约150万例新感染和29万例死亡的重要工具。
简介
丙型肝炎病毒(HCV)是一种高度流行的血源性包膜阳性感觉单链RNA病毒黄家庭。1与非结构蛋白(p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)相比，结构蛋白、衣壳蛋白核心和包膜糖蛋白E1、E2构成了病毒颗粒。E1/E2异质二聚体是中和抗体(nAb)的主要靶点。2在8种基因型中，基因型1、2和3在全球范围内引起的感染占80%。基因型4、5和6分别在中东/非洲、南非和东南亚表现出更有限的地理位置，而基因型7和基因型8在少数个体中报道。1亚型(a、b、c等)的序列差异约为20%。
每年大约有150万例新感染病例发生。其中，约80%发展为慢性感染，造成约5800万慢性感染者，增加肝硬化和肝细胞癌的风险，每年造成约29万人死亡。3.迄今为止，抗病毒治疗对这一流行病没有重大影响，主要原因是在许多国家，在严重肝损伤之前没有症状，缺乏筛查方案和高昂的治疗费用。1 3需要一种预防性疫苗，以实现世卫组织消除肝炎这一重大公共卫生威胁的目标。
在自然感染期间，T细胞和B细胞似乎有助于保护性免疫。使用病毒载体方法的T细胞疫苗不能预防黑猩猩和人类的慢性感染。4个5相比之下，一种基于E1/E2糖蛋白异二聚体的B细胞疫苗在黑猩猩中显示出保护作用，并在非人类灵长类动物、黑猩猩和人类中诱导了nAb，尽管只有不到50%的人类疫苗接种者诱导了nAb，而对不同HCV基因型的中和能力有限。6 - 10nAb的诱导与其他病毒疫苗的疗效相关。11日12此外，在自然HCV感染诱导广泛的nAb介导的保护。13 - 15保护性nAb靶向E2和E1/E2中的保守构象中和表位，定位于抗原区域3和4 (AR3和AR4)2 14 - 16也是明确的人类单克隆抗体(mAb)的靶点。17 18为了对不同的HCV基因型有效，未来的疫苗应该针对这些表位，然而，似乎被封闭的包膜蛋白构象状态(E1/E2状态)所隐藏。19日20另一种方法可能是基于不同病毒变异的多价疫苗。
对于HCV，小鼠全病毒疫苗诱导nAb的能力高于蛋白疫苗，21可能是由于更高的密度和更多的自然构象的包膜蛋白。事实上，许多已获许可的病毒疫苗是基于全病毒或病毒样颗粒。12日22然而，由于用于生产HCV的细胞培养系统中病毒产量相对较低，这一技术在HCV疫苗开发中的应用受到了阻碍。2005年，第一个系统是基于单一基因型2a分离物(JFH1)开发的，23日24其次是基于jfh1表达基因型特异性蛋白的系统25全长系统不依赖于JFH1。代谢途径这些系统通常产生10个3.-10年5每毫升感染病毒，被认为是疫苗开发的次优。然而，以jfh1为基础的基因2a重组体在小鼠和非人灵长类动物中获得了免疫原性的概念证明。21日29日然而，有效的nAb只会被未授权用于人类的佐剂诱导。
本研究的目的是:(1)开发用于生产基因型1a、2a和3a HCV的高产培养系统，(2)对高产HCV的中和表位暴露进行表征，重点研究与保护性相关的保守表位;(3)使用一种适用于人类的佐剂在小鼠中获得每种高产HCV免疫原性概念的证明，重点是检测广泛中和基因型1-6 HCV的抗体。
材料和方法
大多数章节将在在线补充材料．
丙肝病毒重组
之前已经开发了原始的TNcc、J6cc和DBN3acc重组体。代谢途径利用来自细胞培养的逆转录PCR (RT-PCR)扩增子亚克隆和In-Fusion技术构建高产量的hi -重组体。具有1a(TN)、1b(J4)、2a(J6)、2b(J8)、3a(S52)、3a(DBN)、4a(ED43)、5a(SA13)和6a(HK6a)基因型的重组体24岁25 30JFH1基因型2a分离物的特异性核心ns2和剩余序列用于体外HCV中和试验。
细胞
用人肝癌Huh7.5细胞培养HCV。用人胚胎肾HEK293细胞制备HCV E1/E2复合物。
在Huh7.5细胞中转染HCV体外RNA转录本
使用T7 RNA聚合酶(Promega)合成转录本;使用Lipofectamine2000 (Invitrogen)进行转染。25
HCV感染Huh7.5细胞
在感染高峰期接种转染实验获得的上清。25
HCV在Huh7.5细胞中连续传代
在感染高峰期用前一代培养上清接种细胞。31
在Huh7.5细胞中生成病毒砧木
感染高峰时取培养上清接种细胞。将感染高峰前后采集的上清液汇集。对于用于中和试验的病毒原液，HCV包膜蛋白序列通过Sanger测序得到确认。对于用于疫苗病毒生产的病毒种子库，采用下一代测序(NGS)分析了完整的HCV开放阅读框(ORF)。
HCV抗原在细胞培养中的免疫染色
使用一抗HCV单克隆抗HCV核心抗体C7-50 (EnzoLifeSciences, Farmingdale, New York, New York, USA)稀释1:5000的抗体和单克隆抗HCV NS5A抗体9E10通过免疫染色来监测HCV感染细胞的百分比241:5000稀释，二抗Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG (H+L) (Invitrogen) 1:5000稀释。25
HCV感染滴度的测定
用96孔板滴定法测定培养上清中的HCV感染滴度，以聚焦形成单位(FFU)/mL为单位，随后使用一抗抗HCV核心抗体C7-50 (EnzoLifeSciences)稀释1:10，抗HCV NS5A抗体9E10稀释1:300，二抗ECL羊抗兔IgG稀释1:500进行免疫染色，然后显示和自动计数FFU。32
细胞培养来源的HCV测序
从培养上清液中提取HCV RNA，用RT-PCR方法扩增完整的ORF(连续传代实验、第一次传代动力学实验和病毒种子砧木)或E1/E2(用于中和试验的病毒砧木)。在线补充表1和2)后进行NGS (ORF扩增子)或Sanger测序(E1/E2扩增子)。32 33
Subclonal分析
选择的RT-PCR ORF扩增子使用TOPO-XL克隆试剂盒(Invitrogen)进行亚克隆，然后进行Sanger测序。
生产丙型肝炎疫苗
HCV是在无血清培养基中在10层细胞工厂中产生的。34 35
用于疫苗生产的HCV加工
HCV用5 μ m和0.65 μ m过滤器澄清，用切向流动过滤(TFF)浓缩，分子量截止(MWCO)为500 kDa。36随后，使用Optiprep密度梯度介质(Sigma)进行两个超离心步骤，分别形成三个密度缓冲垫和一个连续梯度，由中间的TFF步骤(MWCO 500 kDa)分离。使用Sephadex G-100 (Sigma Aldrich)进行尺寸排除色谱，HCV用uug -54手持UV灯(240 nm UV, 6瓦)(Analytik Jena)紫外线照射。35
免疫接种的老鼠
6-8周龄的BALB/c小鼠(Taconic Farms，丹麦)每3周皮下接种4次HCV或以50%/50% (v/v)佐剂AddaVax配制的卵白蛋白(OVA)。
患者样本
在2011年5月至2021年8月期间，我们收集了慢性丙型肝炎(CHC)患者的血清或血浆，这些血清或血浆与丹麦乙肝和丙型肝炎数据库以及哥本哈根大学医院传染病科HCV串联队列相关联。患者年龄≥18岁，既往无CHC治疗史，未合并感染人类免疫缺陷病毒(HIV)或乙肝病毒，近期无静脉注射药物使用。
IgG的纯化、浓缩和定量
使用Amicon Pro亲和浓缩试剂盒Protein G从小鼠血清或患者血清或血浆中纯化IgG，该试剂盒使用50 kDa Amicon Ultra-0.5装置(Merck Millipore)，并使用Vivaspin 500, 30 000 MWCO (GE Lifescience)试剂盒浓缩。小鼠和患者分别用IgG (TOTAL)小鼠未包被ELISA Kit (ThermoFisher)和Cedex Bio Analyzer (Roche)定量。
体外中和试验
用单抗AR3A和AR4A中和HCV17 18多克隆抗体C21119100 μ L，接种于96孔板上的Huh7.5细胞，进行HCV抗原免疫染色和自动FFU计数。31日34用纯化的小鼠或患者IgG进行HCV中和，体积为10 μ L。37计算中和百分率为100-[100×(实验孔中FFU计数)/(纯病毒孔中FFU平均计数)]。
HCV E1/E2复合物ELISA试剂盒
用E1/E2表达质粒转染HEK293细胞裂解液获得E1/E2复合物。采用二抗ECL羊抗鼠IgG辣根过氧化物酶连锁全抗体(GE Healthcare) 1:1000稀释，ELISA法测定小鼠IgG或免疫血清与E1/E2复合物的结合。阳性对照为单抗AP3338和H77.39。39阴性对照仅为二抗。
病人和公众参与声明
患者或公众没有参与我们研究的设计、实施、报告或传播计划。
结果
高产基因型1a、2a和3a多克隆HCV一代
为了开发高产培养体系，我们对TNcc(基因型1a)全长进行了连续传代，26J6cc 2(基因型)27和DBN3acc(基因型3a)28HCV重组体在Huh7.5肝癌细胞中的感染滴度在~6 log10 FFU/mL处出现平台(图1)．另一个终止传代的标准是在80%的病毒群体中检测推定的细胞培养适应性替换，这是由NGS确定的。对于一个TNcc传代系，NGS显示病毒准种群体的突变率<80%，刺激一个后期传代系，共41次传代。J6cc和DBN3acc分别传代43和22次。与初代相比，晚期代HCV感染滴度TNcc增加2.6 log10, J6cc增加1.7 log10, DBN3acc增加1.3 log10。
体外连续传代获得了高产量的多克隆基因型1a、2a和3a HCV。免疫染色结果显示，在感染高峰时，用含前代培养特定病毒的细胞培养上清接种Huh7.5细胞。每隔2-3天分离传代培养，分别用免疫染色法和感染滴定法测定HCV抗原阳性细胞%和HCV感染滴度。特定传代上清HCV感染滴度的峰值为3次重复的平均值，标准差(SD)。TNcc用第一代传代10代病毒接种后代传代株系。蓝色框架，通道受NGS。绿色框架，传代用于生产基因型2a种子砧木。红框，经NGS传代，用于生产基因型1a种砧木。3a基因型种子砧木是基于后来开发的DBNcc-HI重组。洁净,focus-forming单位; NGS, next-generation sequencing.
高产量多克隆基因型1a、2a和3a HCV获得的遗传变化
为了鉴定高产表型的遗传相关，我们对PP病毒的整个ORF进行了NGS分析。对于最初传代系第10代和第18代的TNcc-PP-10和TNcc-PP-18, NGS提示一个病毒准种种群，其大部分编码核苷酸变化存在于<80%的病毒基因组(在线补充表3)．相比之下，来自后期传代系的TNcc-PP-38.1，以及J6cc-PP-35和DBNcc-PP-16，发现了一个更均匀的病毒群体，大多数编码核苷酸的变化存在于≥80%的病毒基因组(图2而且在线补充表4-6)．TNcc-PP-38.1、J6cc-PP-35和DBNcc-PP-16在≥80%的病毒基因组中分别有17、17和7个编码改变，其中4个、3个和1个定位于包膜蛋白。值得注意的是，与该重组基于的HCV序列相比，DBN3acc已经在包膜蛋白中包含了5个编码变化，而TNcc和J6cc没有包膜蛋白的编码变化。代谢途径这些pp病毒的亚克隆分析和TNcc-PP亚克隆的系统发育分析反映了NGS结果(在线补充结果，在线补充图1，在线补充表7-9)．
HCV 1a、2a和3a基因型高产重组体的构建
基于高产pp病毒的遗传分析，我们设计了高产(HI)重组体:TNcc-HI-18A和TNcc-HI-18B，反映了初始传代线中的两个主要群体(在线补充图1而且在线补充表3)．经亚克隆分析证实，TNcc-HI反映后期传代株系TNcc-PP-38.1, J6cc-HI反映J6cc-PP-35, DBNcc-HI反映DBNcc-PP-16的组合在NGS中出现>频率为80%的编码核苷酸变化;例外情况是，TNcc-HI也有48%的频率发现G32S(除非另有说明，所有氨基酸位置号与H77参考多蛋白，Genbank登录号相关AF009606) (图2而且在线补充表4-9)．
与原始的重组体相比，所有hi -重组体在转染和第一次传代感染动力学实验中表现出更高的适应度，传播动力学加速，通过感染细胞百分比和HCV感染滴度的测定和峰值感染滴度的增加进行监测。TNcc-HI-18A和TNcc-HI-18B的峰值感染滴度仅接近5 log10 FFU/mL，因此未能达到6 log10 FFU/mL的目标(在线补充图2)．相比之下，在转染/感染实验中，TNcc-HI、J6cc-HI和DBNcc-HI的峰值感染滴度分别为5.8/6.0、6.1/6.8和6.4/7.0 log10 FFU/mL，而各自的原始重组分别为3.0/3.5、3.5/3.4和5.3/5.3 log10 FFU/mL (图3)．在感染实验中，hi病毒的感染滴度与pp病毒相当(图3 b)．hi -重组体在第一次病毒传代后基因稳定(除TNcc-HI获得L179P和S1930Y频率分别为15%和39%外，未获得>频率为10%的替换)。
经过工程改造的高产量基因型1a、2a和3a HCV重组体在细胞培养中具有更高的病毒适应度。(A)使用等量的HCV RNA体外转录本将特定的重组体转染到Huh7.5细胞中，在每张图中直接比较重组体。(B)在第一传代动力学实验中，用转染实验获得的上清液在0.002多重感染原病毒和hi病毒时，观察到峰值感染滴度;纳入多克隆传代病毒进行比较。(A、B)每隔2-3天分离传代培养，分别用免疫染色法和感染滴定法测定HCV抗原阳性细胞%和HCV感染滴度。HCV感染滴度为SD重复3次的平均值。洁净,focus-forming单位;MOI，多重感染。
高产基因型1a、2a和3a重组体显示出更多的中和表位暴露
与未经过细胞培养适应性替换的体内包膜蛋白序列重组体相比，24 30根据测定的EC50值，hi -重组体对人源性mAb AR3A中和的敏感性提高了12- 2472倍17AR4A,18分别针对E2和E1/E2中具有保护作用的保守构象表位，采用IgG C211多克隆技术19源自一名慢性感染基因型1a的病人(图4)．TNcc-HI对AR3A、AR4A和C211的中和敏感性分别提高了300倍、2400倍和110倍，而TN-PP-18衍生的基因型1a HCV种源的中和敏感性分别提高了3倍、15倍和3.2倍。J6cc-HI的中和敏感性分别提高了440倍、12倍和633倍。DBNcc-HI显示为1250倍、220倍和2472倍，而DBN3acc显示为167倍、22倍和88倍的中和敏感性。对于体内来源的TN、J6和DBN包膜蛋白序列的病毒，测定的一半最大有效浓度(EC50)与以前的结果一致。20 40 41因此，hi -病毒显示出与预防慢性HCV感染相关的保守构象中和表位暴露大大增加。
改造的高产量基因型1a、2a和3a HCV重组体显示出对人类来源的nAb的中和敏感性增加。具有体内衍生基因型(分离物)1a(TN)的重组体30.2(卫星)24和3 (DBN)30.core-NS2序列以及TNcc-HI、J6cc-HI、DBNcc-HI、基因型1a HCV种源和DBN3acc28体外传代过程中获得的包膜蛋白替换被人单抗AR3A和AR4A中和，17 18多克隆抗体C211。19数据点为SD重复3次的平均值;拟合曲线，计算EC50，公式为y=100/(1+10(log10EC50−X)×hillslope)使用GraphPad棱镜。将中和敏感性加倍计算为[(体内衍生包膜蛋白序列的1a(TN)、2a(J6)或3a(DBN)病毒的EC50)/(体外衍生包膜蛋白替换的各自病毒的EC50)]。通过Sanger测序确认病毒原液包膜蛋白序列。EC50，最大有效浓度的一半;gt,基因型;马伯,单克隆抗体;nAb,中和抗体。
基于灭活高产基因型1a、2a和3a重组体的候选疫苗的生成
为了生产用于疫苗实验的病毒，用Huh7.5细胞接种多克隆病毒制剂TNcc-PP-18、多克隆病毒制剂J6cc-PP-38或首次病毒传代的DBNcc-HI病毒制备HCV种源，用于疫苗研究的启动。序列确认基因型1a、2a和3a HCV种子砧木的感染滴度分别为4.8、6.2和6.4 log10 FFU/mL (在线补充表3、5、6)，接种Huh7.5细胞，在10层细胞工厂中生产HCV，每病毒可获得16 L含上清的HCV (在线补充图3)．上清液进行下游处理，包括最初的过滤器澄清，然后是两个TFF步骤，缓冲超离心，另一个TFF，梯度超离心，层析和紫外线照射灭活(补充结果在线补充文件1而且在线补充图4和图5)．
用灭活基因型1a、2a和3a HCV候选疫苗免疫小鼠，可获得广泛中和抗体和包膜蛋白结合抗体
处理过的灭活基因型1a、2a或3a HCVcc或对照抗原OVA与佐剂AddaVax配制，该佐剂是MF-59的类似物，已批准用于人用，用于BALB/c小鼠免疫。
从个体动物中和HCV的血清IgG，与各自疫苗使用的相同基因型的体内衍生包膜蛋白序列具有浓度依赖性，基因型1a、2a和3a的HCV疫苗平均EC50分别为47、124和101 μ g/mL (图5)．当IgG浓度最高为1000 g/mL时，达到接近完全中和的效果。OVA免疫小鼠未引起HCV nAb。
用灭活基因型1a、2a或3a的HCV免疫可诱导抗体中和细胞培养中相同基因型的感染HCV。每组3只小鼠分别接种基因型1a、2a和3a的灭活HCV或OVA，并加入AddaVax佐剂。纯化的小鼠血清IgG用于中和含有体内衍生基因型(隔离物)1a(TN)的重组体，30.2(卫星)24和3 (S52)25具体core-NS2。数据点为SD重复3次的平均值;拟合曲线，计算EC50，公式为y=100/(1+10(log10EC50−X)×hillslope)使用GraphPad棱镜。每条由独特符号指定的浓度-反应曲线代表一种动物的数据。通过Sanger测序确认病毒原液包膜蛋白序列。EC50，最大有效浓度的一半;nAb,中和抗体;卵,卵清蛋白。
此外，IgG池中和基因型1-5 HCV与体内获得的包膜序列和基因型6 HCV与两个重要的细胞培养适应性替换包膜蛋白，具有相似的效果，并以浓度依赖的方式。在中和病毒中，来自基因型1a、2a和3a接种动物的IgG平均EC50分别为67、68和77 μ g/mL，在1000 μ g/mL时接近完全中和(图6)．在疗效和广泛性方面，小鼠的IgG中和能力优于CHC患者的IgG (图7)．有趣的是，这些数据证实了5a(SA13)的中和敏感性相对较高，而2a(J6)和3a(S52)的中和敏感性相对较低。42此外，基因3a型患者的IgG中和能力低于基因1a、2a或2b型患者。
用灭活基因型1a、2a或3a HCV免疫可诱导广泛nAb。用基因型为1a、2a或3a的HCV免疫的各组小鼠的纯化IgG，使用相同数量的各组小鼠的IgG进行混合。IgG池用于中和含有体内衍生基因型(分离物)1a(TN)、1b(J4)、2a(J6)、2b(J8)、3a(S52)、4a(ED43)和5a(SA13)核心- ns2序列的重组体;6a(HK6a)包含E1和E2两个重要的细胞培养适应性替换。24岁25 30数据点为SD重复3次的平均值;拟合曲线，计算EC50，公式为y=100/(1+10(log10EC50−X)×hillslope)使用GraphPad棱镜。通过Sanger测序确认病毒原液包膜蛋白序列。EC50，最大有效浓度的一半;nAb,中和抗体。
![Engineered high-yield genotype 1a, 2a and 3a HCV recombinants showed increased sensitivity to neutralisation by human-derived nAb. Recombinants with in vivo derived genotype(isolate) 1a(TN),30 2a(J6)24 and 3a(DBN)30 core-NS2 sequences, as well as TNcc-HI, J6cc-HI, DBNcc-HI, the genotype 1a HCV seed stock and DBN3acc28 with envelope protein substitutions acquired during in vitro passage were subjected to neutralisation with human mAb AR3A and AR4A,17 18 and polyclonal antibody C211.19 Data points are means of three replicates with SD; curves were fitted, and EC50 were calculated with the formula y=100/(1+10(log10EC50−X)×hillslope) using GraphPad prism. Fold increase in neutralisation sensitivity was calculated as [(EC50 of 1a(TN), 2a(J6) or 3a(DBN) virus with in vivo derived envelope protein sequence)/(EC50 of respective virus with in vitro derived envelope protein substitutions)]. Virus stock envelope protein sequences were confirmed by Sanger sequencing. EC50, half maximal effective concentration; gt, genotype; mAb, monoclonal antibody; nAb, neutralising antibody.](http://www.marcconsult.com/content/gutjnl/early/2022/08/02/gutjnl-2021-326323/F4.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1){kind=link}
用灭活基因型1a、2a或3a HCV免疫可诱导抗体与HCV包膜蛋白结合。用ELISA法评估了用灭活基因型1a、2a或3a HCV或OVA免疫小鼠的(A)纯化血清IgG或(B和C)免疫血清与特定hi重组体E1/E2复合物的结合能力。值为在450 nm处减去8个阴性对照的平均OD值后的光密度(OD)读数。数据点是用SD进行两次重复的平均值。(A)阳性对照:使用特征良好的一抗AP33代替血清IgG38结合TNcc-HI和DBNcc-HI E1/E2和H77.3939用于与J6cc-HI E1/E2结合。阴性对照:不使用IgG或免疫血清，TNcc-HI、J6cc-HI和DBNcc-HI E1/E2仅用二抗孵育;阴性对照OD值~0.05。(A、B)在OVA图中，反映与J6cc-HI E1/E2和DBNcc-HI E1/E2结合的数据点在y方向分别轻推0.04和0.08个单位。(C)免疫血清终点滴度测定为阴性对照的最高血清稀释倍数，OD值>为平均OD值的2倍。卵,卵清蛋白。
最后，来自所有HCV免疫动物群体的IgG池以浓度依赖的方式有效结合TNcc-HI、J6cc-HI和DBNcc-HI E1/E2复合物(图8，在线补充图6)．在OVA免疫的动物中未观察到这种结合。免疫血清的终点滴度高达32 000 (图8，在线补充图7)．
讨论
在这项研究中，我们开发了高产量基因型1a、2a和3a型HCV细胞培养系统，以促进全病毒灭活疫苗候选的开发。与原始病毒相比，高产量病毒显示出更多的与保护慢性HCV感染相关的保守构象中和表位暴露，这与单抗AR3A和AR4A的中和敏感性增加有关。在小鼠免疫原性研究中，采用类似于人MF-59佐剂配制的高产量基因型1a、2a或3a病毒，每一种都能诱导有效的nAb，广泛中和所有主要基因型的HCV，具有公认的流行病学重要性。
为了高效生产全病毒灭活疫苗，需要高产出病毒。例如，用于疫苗生产的SARS-CoV-2感染滴度可达6.5-7 log10 TCID50/mL。43为了选择先前开发的最常见HCV基因型的全长重组的高产变种，代谢途径我们采用了连续传代的方法，该方法曾用于进一步改造基于jfh1的基因5a型病毒。31应用这种进化方法直到没有观察到病毒感染滴度的进一步增加，直到一个同质的病毒种群没有明显的证据来记录持续选择其他假定的适应性替代，预计将导致选择高度适合和遗传稳定的病毒种群。31因此，开发出的基因稳定、高产的HCV重组体未来可用于启动序列确认的早期病毒传代种源的病毒疫苗抗原生产。44 45基于本研究使用全长重组体的结果，以及之前使用基于jfh1的重组体的研究结果，31单层Huh7.5细胞培养中HCV感染滴度的上限在6 - 7 log10 FFU/mL之间，这可能是由于所需宿主细胞因子的可获得性有限。未来的研究应集中于研究获得性病毒替代对病毒生命周期的影响。有趣的是，本研究中选择的一些替换也在其他HCV重组体的细胞培养适应过程中选择，这表明HCV细胞培养适应的一般作用(在线补充表10)．
在未来的研究中，研究哪些选择的包膜取代会增加AR3A和AR4A靶向的保守构象表位的暴露将是特别有趣的。E2基因突变包括HVR1缺失(aa 384-410)、40n -糖基化的破坏，19 46HVR1 (aa 400-404)和E2前层(aa 414、431和453;前层:aa 411-461)20.被描述为增加中和敏感性，这与开放的E1/E2状态有关。19日20TN-PP-18和TN-PP-38.1在HVR1中获得N410K，而TN-PP-38.1在HVR1中获得F403L。J6cc-PP-35在E2前层获得H434N, DBNcc-PP-16在HVR1获得G395R, DBN3acc在E2前层获得S449A。28此外，定位于这些特定区域以外的E2之前与中和敏感性的变化有关，TN-PP-38.1获得了V719I和J6cc-PP-35获得了A573T，而DBN3acc拥有D474A, T528N和V629A。28
在之前的HCV研究中也观察到病毒适合度和中和表位暴露之间的正相关31和艾滋病毒。47对于HCV来说，体内保守的构象中和表位的保护可能与适应度成本有关，因为封闭的E1/E2状态可能会减少HCV主要入口受体CD81对其结合位点的访问，这与AR3重叠。2
对于HCV来说，缺失HVR1会导致最大限度打开E1/E2状态，这与高中和敏感性相关。19个40对于本研究中开发的全长基因型1-3 hi病毒和之前开发的基于jfh1的高产基因型5a HCV，31AR3A抗原表位与hvr1删除病毒一样容易获得，而AR4A抗原表位的暴露大约是hvr1删除病毒的10倍至100倍。35 40然而，hvr1缺失的病毒通常表现出相对较低的感染滴度，阻碍了疫苗的生产。48与原病毒相比，hi病毒的AR3A表位暴露量增加了~300 ~ 1250倍，AR4A表位暴露量增加了~12 ~ 2400倍;高产5a基因型HCV的AR3A和AR4A表位暴露仅比原来高度中和敏感的5a基因型HCV高10倍。35
因此，本研究开发了1a、2a和3a基因型hi病毒，以及以jfh1为基础的高产量5a基因型HCV31提出了有趣的疫苗抗原，因为它们可能有助于诱导针对HCV变异之间保守的表位的抗体，并在人类中介导保护作用。暴露这种保守表位的疫苗抗原具有诱导广泛nAb的能力，可能使多价疫苗的方法不必要。
的确，1-3基因型pp -病毒和hi -病毒以及高产量基因型5a HCV免疫31导致广谱nAb的诱导。疫苗诱导抗体的50%中和滴度和ELISA终点滴度与已获许可的抗病毒疫苗的报告值和E1/E2异源二聚体疫苗接种后免受HCV攻击的黑猩猩的报告值相当。6 10然而，与慢性感染患者的IgG相比，E1/E2异源二聚体疫苗产生的抗体8 - 10以及基于可溶性E2蛋白的不同候选疫苗，46 49-51nAb在本研究和之前的研究中诱导的35对不同HCV变异的中和能力增强。最后，当使用不适合人类使用的实验佐剂时，50%的中和滴度与基因2a型灭活疫苗候选疫苗在小鼠和非人灵长类动物中的结果相当。21日29日在非人灵长类动物的研究中，使用授权的佐剂氢氧化铝并没有导致有效的nAb诱导。29AddaVax/MF-59比氢氧化铝具有更强的免疫原性。35 52此外，对于其他病毒，增加中和表位暴露可能导致免疫原性增加。53 54在未来的研究中，保守中和抗原表位暴露的增加是否会增加免疫原性，以及不同HCV基因型/血清型的免疫原性是否不同，这将是一个有趣的研究。42 55然而，这将需要开发不通过E2取代介导表位暴露的高产病毒，这可能是不可能的，因为适应度的提高至少部分是由这种取代介导的。可溶性E2或E1/E2异源二聚体疫苗平台可能更适合这类研究;然而，它们可能不能反映整个病毒颗粒上的原生包膜蛋白构象。在这些研究中，有报道称删除三个可变的E2区域会导致免疫原性的一定增加，而删除HVR1和/或修改糖基化位点对免疫原性没有影响或影响较小。46 49-51 56对于已经高度中和敏感的高产基因5a型HCV，在随后的培养适应中删除HVR1并没有导致免疫原性的增加。35此外，未来的研究需要更大量的hi病毒疫苗诱导的nAb和最有可能衍生的mAb，可以研究这些抗体针对哪些表位。
进一步的临床前和临床开发需要优化疫苗生产和加工条件，以确保与疫苗生产的兼容性。36 44此外，进一步的研究应根据优化的生物过程的性能、所产生抗原的详细免疫原性研究以及剂量发现研究，确定最强大的候选疫苗。在最初的上游生物过程研究中使用可扩展的生物反应器44 57以及基因型2a和3a hi病毒以及高产量基因型5a HCV转染后从早期病毒传代产生的病毒种子砧木35产生了比1a基因型hi病毒高得多的传染性滴度，这表明这三个候选者在生产过程中具有优势。目前尚无具有免疫功能的HCV体内攻毒模型。而未来的研究可能会使用专门的小动物模型，如人类肝脏嵌合uPA-SCID小鼠模型，来研究疫苗诱导保护的某些方面48以及更大的动物来证实疫苗的安全性和免疫原性，9有希望的候选疫苗可能需要进行涉及受控人类感染模型的临床试验58来评估它们真正的保护潜力。最后，在寻找丙型肝炎疫苗的过程中，重要的是通过应用标准化的分析方法促进候选疫苗的交叉比较。42 55
综上所述，我们开发了1a、2a和3a基因型HCV的高产型，为进一步的临床前和临床开发提供了候选灭活疫苗基础。
数据可用性声明
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伦理语句
发表患者同意书
伦理批准
HCV串联队列获得了区域伦理委员会(H-21004361)和丹麦数据保护局(2012-58-0004)的批准。参与者在参与研究前给予知情同意。
参考文献
补充材料
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补充数据
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脚注
贡献者研究设计:GPA, AFP, JB, JMG。采集数据:GPA、AFP、AO、CRDH、ZD、SF、UF。数据分析解读:GPA、AFP、AO、CRDH、UF、CS、NW、ML、JCP、JB、JMG。材料投稿:CS、NW、ML。起草稿件:GPA、JMG。研究监督:晋城无烟煤矿业集团。担保人:晋城无烟煤矿业集团。所有作者都审阅了原稿。
资金这项工作得到了Candys基金会和哥本哈根大学(AFP、AO、JB和JMG)、中国国家留学基金局(ZD和JMG)、诺和诺德基金会(NW、JB和JMG)、丹麦癌症协会(JB和JMG)、丹麦独立研究基金(DFF) -医学科学(JB和JMG)、丹麦创新基金(JB和JMG)、伦德贝克基金会(JP和JB)、地区H基金会(AFP、CS、JB和JMG)、丰田基金会(AO和JMG)， Læge Sofus Carl Emil Friis og Hustru Olga Doris Friis基金会(JMG)和Mauritzen La Fontaine基金会(JB)。ML的部分资金由NIH资助AI123861和AI144232。
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