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摘要
客观的对结直肠癌(CRC)逐步发展和进展的生物学见解，对于开发适合这种疾病的早期发现和最佳临床管理的方法是必要的。在本研究中，我们旨在分析CRC恶性转化伴随的转录和免疫改变，并通过pT1 CRC样本的空间分析来识别临床相关的生物标志物。
设计我们对8个pT1 CRCs使用数字空间分析(GeoMx)来研究不同组织学区域的上皮和间质段的基因表达，包括正常黏膜、低级别和高级别发育不良和癌症。连续的组织学切片通过成像大规模细胞术显示免疫环境。最后，对公开的单细胞rna测序数据进行分析，以确定相关转录本的细胞来源。
结果比较pT1 CRC样本中不同区域的基因表达，发现不同组织学中上皮细胞(n=1394个基因)和间质段(n=1145个基因)存在差异表达基因。途径分析确定了恶性转化过程中炎症反应的早期发生，典型表现为基因信号的上调，如先天免疫感应。我们检测到骨髓细胞浸润增加，巨噬细胞群从促炎HLA-DR转移+CD204−巨噬细胞生成HLA-DR−CD204+从正常组织到发育不良再到癌症的免疫抑制亚群，伴随着CD47/SIRPα“不要吃我信号”的上调。
结论空间剖析揭示了疾病早期CRC肿瘤发生的分子和免疫格局。我们发现了与疾病进展密切相关的生物标志物，以及可在临床环境中利用的可靶向免疫过程。
- 结直肠新生
- 免疫遗传学
- 基因表达
数据可用性声明
数据可以在一个公共的、开放访问的存储库中获得。GeoMx原始数据和规范化数据可通过FigShare获得https://doi.org/10.6084/m9.figshare.16818415。成像质量细胞仪文件(mcd文件)和相应的注释文件在BioImage Archive(登录号S-BIAD587，https://www.ebi.ac.uk/biostudies/bioimages/studies/S-BIAD587)．
这是一篇开放获取的文章，根据创作共用属性4.0 Unported (CC BY 4.0)许可证发布，该许可证允许其他人出于任何目的复制、重新分发、重新混合、转换和构建此作品，前提是原始作品被正确引用，提供到许可证的链接，并表明是否进行了更改。看到的:https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
数据来自Altmetric.com
关于这个话题我们已经知道了什么
结直肠癌(CRCs)的出现是上皮细胞(表观)遗传改变逐渐积累的结果，最终导致不受控制的增殖和恶性转化。
我们对结直肠癌发生和发展的生物学过程的理解仍然不足以对这种疾病进行最佳管理。
迄今为止，阐明肿瘤微环境中不同细胞在恶性转化过程中所起作用的研究仍然很少。
在保存组织背景的同时分析基因表达的技术允许对组织内特定位置的转录景观进行全面调查，以深入了解与恶性转化相关的生物学过程。
这项研究补充了什么
在CRC恶性转化早期，MUC4、IFITM1和CD81在上皮细胞中被特异性地去调控，而NOTCH3、PDGFRB、Thy1和Hsp47在间质中被发现去调控。
CRC发病伴随先天免疫反应和核酸感应的早期激活。
pT1 CRC组织中的免疫细胞组成逐渐从正常组织，经过发育不良区域，转变为癌症。
CRC肿瘤发生的逐步过程伴随着从促炎到免疫抑制巨噬细胞群的转变，特异性表达SIRPACD47(sirp α-配体)在肿瘤细胞上的表达。
这项研究如何影响研究、实践或政策
在这项工作中，我们鉴定了与结直肠癌发生相关的蛋白质，这些蛋白质是早期发现和适当分期结直肠癌的有希望的候选生物标志物。
我们的多区域转录组学方法阐明了CRC发生和发展的基础生物学过程，如先天免疫感应，可作为早期干预或预防的目标。
CD47-SIRPα轴可能是CRC的一个有吸引力的免疫治疗靶点。
简介
结直肠癌(CRC)发展中腺瘤-癌序列的范式通常以癌细胞为中心1；然而，现在很清楚的是，癌症的进展涉及转化细胞与其周围微环境之间的异源相互作用。2到目前为止，大多数研究依赖于CRC晚期的批量分析，以确定癌症驱动基因并定义与癌症相关的生物学过程。3 - 5大规模的基因组学和转录组学研究有助于连接结直肠癌基因组学，包括微卫星不稳定性、新抗原负载和其他免疫相关的基因组畸变与结直肠癌的免疫细胞浸润和预后。5 - 7
不同的策略被用于定义伴随肿瘤发生的转录组和表观遗传改变，8 - 10通过比较正常、腺瘤和癌组织8 10或对CRC病灶进行显微清扫。9最近，单细胞转录组学通过识别CRC中基质细胞、免疫细胞和恶性细胞的不同亚群以及多细胞相互作用网络，提供了肿瘤免疫微环境的更粒状视图。11最近的努力通过对癌前息肉的单细胞测序确定了癌前基因表达程序。12日13此外，在恶性转化过程中观察到肿瘤微环境的显著变化，包括成纤维细胞亚群的巨大变化，息肉中调节性T细胞的富集和B细胞的减少。13
批量和单细胞方法的一个常见限制是缺乏跨不同区域的空间背景和细胞组成的信息。空间基因表达谱允许在组织中伴随形态变化的生物过程的解决。14日15早期结直肠癌(如pT1结直肠癌)特别适合用空间方法进行分析，因为同一病变内存在不同的组织学，包括健康组织、不同程度的发育不良和癌症，从而代表恶性转化的早期过程。这是阐明支持CRC肿瘤发生的生物学过程的独特模型，因为这些组织学具有相同的(种系)遗传背景和相似的暴露于环境因素(如微生物组)的共同起源。
我们对pT1型CRC病变中匹配的正常黏膜、低级别和高级别发育不良以及癌症应用数字空间分析(DSP)，绘制了CRC发病期间发生的转录变化。对上皮细胞和间质部分的平行分析，可以对肿瘤细胞、间质细胞或肿瘤微环境的两个区室中发生的生物学变化进行解剖。确定了在结直肠癌进展过程中持续解除调控的基因和途径。此外，我们检测到CRC发病期间免疫微环境的组成和功能取向发生了显著变化，其中先天免疫系统起着突出作用。特别是，我们提供的证据表明，在从正常组织逐步发展到CRC的过程中，巨噬细胞种群发生了转移，同时伴随着CD47/SIRPα轴的上调。
材料与方法
人类的样本
在莱顿大学医学中心消化内科通过内镜下粘膜下剥离获得患者样本。患者在内镜手术前未接受任何治疗。组织用福尔马林固定，石蜡包埋(FFPE)。
病人参与
虽然早期发现和治疗对患者的预后至关重要，但诊断为早期癌症患者的临床管理可以进一步改善。目前的研究推进了我们对结直肠癌发病的生物学机制的理解，这是确定支持早期结直肠癌患者量身定制治疗的生物标志物的第一步，但也是至关重要的一步。我们计划通过社交媒体和与患者倡导团体共同组织的讲座来传播这项研究的结果。与Fight结直肠癌合作(https://fightcolorectalcancer.org/crc-research/advisory-committees/our-medical-experts/)，我们的目标是确保结直肠癌患者充分了解这方面的发展。
原位杂交和数字空间分析
为了制备DSP载玻片，对8名不同患者(n=8)的5微米厚FFPE切片进行脱蜡，在ER2溶液(徕卡)中在100℃下加热20分钟，并在37℃下用1µg/mL蛋白酶K处理15分钟。按所述进行一夜原位杂交，每个探针的最终探针浓度为4 nM。载玻片在37°C下用50%甲酰胺/2X SSC缓冲液清洗两次25分钟，以去除未绑定的探针。
制备的载玻片同时用免疫荧光抗体和GeoMx癌转录组图谱(CTA, V.2.0)分析试剂孵育。Pan-cytokeratin (PanCK;AE1+AE3, Novus Biologicals, cat# NBP2-33200AF488)用于上皮细胞鉴定，Vimentin (E-5克隆来自Santa Cruz, cat# sc-373717)用于基质细胞鉴定，CD45 (D9M8I来自CST, cat# 13917)用于基质细胞鉴定。用于所有造血细胞，DNA GeoMx核染色(Cat# 121303303)用于细胞核。染色的幻灯片被加载到GeoMx仪器上并进行扫描。
对于每个ESD，病理学家选择了9个具有不同组织学的感兴趣几何区域(roi)。我们使用几何形状，包括矩形和多边形，根据组织学具体选择区域，包括正常组织，过渡，低级别和高级别发育不良和癌症。所得的表面积和每个ROI的核数可以根据不同区域的各自大小和其中的细胞密度而变化(在线补充表S1)．每个ROI被紫外照射两次，一次用于PanCK片段，一次用于Vimentin片段。得到的照明面积(AOIs, n=144)的表面积在15 - 35 000 μ m之间2包括102到5054个原子核。
DSP数据处理与归一化
原始数据可在GeoMx DSP Analysis Suite中获得。我们按照NanoString的癌症转录组图谱规范化指南进行了部分和生物探针质量控制(QC)。在DSP Analysis Suite中进行AOI QC，使用以下设置标记低性能AOI:原始reads阈值<1000 reads，百分比对齐reads <80%，测序饱和度<50%，负探针几何计数<10，无模板PCR控制计数>60，最小核<100，最小表面积为600µm²。共有31个aoi被标记为低阴性探针计数和一个样本具有低测序饱和度。如果(所有段内的几何探针)/(目标内的几何探针)≤0.1，且≥20%的段未通过Grubbs离群值检验，则在默认设置下执行探针QC，在所有段内将探针排除在目标计数计算之外。如果探针在某一特定段中未通过Grubb离群值检验，则该探针将被排除在该段的目标计数计算之外。利用负极探针几何形状的两个SDs计算了定量的极限。
为了确定是否需要从研究中去除标记的aoi，我们比较了背景信号强度和目标信号强度。我们在DSP分析套件中进行了四分位数3计数(Q3)归一化，以解释AOIs之间的技术影响(例如，片段面积，可靶向信使RNA的数量，原位杂交结合)。虽然大多数aoi的Q3信号明显高于NegProbe计数，但需要删除两个aoi，因为在这些aoi中，Q3信号与背景相当。QC后，得到的基因表达矩阵由141个通过QC的AOIs组成，共1825个基因。q3归一化表达式数据从DSP Analysis Suite中导出。所有下游分析均在R (V.4.0.3或更高版本)中执行。通过R包“Rtsne”(V.0.15)使用t-分布式随机邻居嵌入(t-Distributed random Neighbor Embedding)对表达式矩阵进行降维，并使用ggplot2 (V.3.3.3)进行可视化。
使用空间器官图集-结肠进行数据探索
空间器官图集的原始计数可从NanoString网站(https://nanostring.com/resources/soa-human-colon-minerva-story/)．16空间器官图谱包含四名健康个体(两名男性和两名女性)的GeoMx完整转录组图谱人类结肠数据。来自pT1样本的原始基因计数矩阵与空间器官图谱的原始计数合并。对合并后的矩阵进行q3归一化。在R中使用ggplot2生成Log2转换后的归一化基因表达箱图。
基因集富集分析
对log2转化后归一化的基因表达矩阵进行单样本基因集富集分析(ssGSEA)。17Wiki通路18使用R包' rWikiPathways '(参数:有机体= '智人'，格式= ' gmt ')的downloadPathwayArchive函数于2021年5月10日检索。在GeoMx CTA探针中，所有<2个基因可用的通路都被移除。维基路径数据库18提取适合ssGSEA的非冗余生物通路。通过使用the Cancer Genome Atlas Colon Adenocarcinoma (TCGA-COAD)数据集，测试下载的基因集在CTA表达矩阵(1825个基因)中ssGSEA的适用性。在完整的TCGA-COAD基因表达基质上进行ssGSEA，并将相同的基质过滤为仅包含CTA基因。为每个基因集确定获得的富集分数之间的Pearson相关性。Pearson相关系数<0.6的基因集，在我们的GeoMx CTA数据集中，我们认为不适合ssGSEA，排除进一步分析。在多个基因集描述同一生物学过程或途径的情况下，只有相关性最高的途径得以保持。描述特定疾病环境或器官的途径被排除在外。由此产生了一份117条维基路径的列表。
免疫细胞反褶积
为了从表达数据中估计相对丰度，我们实施了共识肿瘤微环境细胞估计(ConsensusTME)，这是一种依赖于来自多个来源的集成基因集的方法，并使用R包ConsensusTME (V.0.0.1.9)对每种癌症类型进行了优化。19参数设置为“COAD”以指定癌症类型，参数设置为“ssgsea”作为统计方法。为了证实这种方法的可靠性，我们观察到来自上皮室的AOIs中免疫细胞亚群的低富集分数(在线补充图1)．
免疫组织化学
有关所选蛋白质的免疫组化检测的详细信息，请参阅在线补充方法和在线补充表S2。
单细胞rna测序分析
单细胞rna测序(scRNA-seq)分析的详细信息可在在线补充方法。
统计分析
采用配对t检验确定PanCK和Vimentin片段之间的差异表达基因，并采用Benjamini-Hochberg法计算相应的错误发现率(FDR)。使用非配对t检验计算具有不同进展状态的区域之间的逐步差异表达分析。Spearman相关检验用于相关性定义在正常结肠癌逐步向癌转移过程中增加或减少的基因/途径/蛋白质。在这个测试中，区域参数被视为一个序数变量(1=正态;2 =过渡区域;3=低级别发育不良，4=高级别发育不良，5=癌)。我们分别对PanCK和Vimentin片段进行了分析。采用单因素方差分析(ANOVA)分析区域间基因表达差异。
结果
结直肠癌肿瘤发生的瘤内基因表达谱
为了破译CRC发生和发展过程中发生的分子变化，我们使用GeoMx DSP技术分析了8个pT1 CRC样本。对于每个样本，选择9个roi，包括正常黏膜、正常黏膜和异常增生之间的过渡区域、低级别和高级别异常增生区域以及癌组织(图1一个)．为了专门检查上皮细胞和间质间室的瘤内转录改变，我们分别询问每个ROI内的细胞角蛋白阳性(PanCK+)和波形蛋白阳性(vimentin +)部分(图1 b)．
早期CRC的数字空间分析。(A)经H&E染色的pT1 CRC样本的代表性例子。选择具有不同组织学特征的roi进行注释。(B)与图(A)中相同样本上的PanCK和Vimentin的免疫荧光检测。在每个ROI上人工覆盖组织分割，可见Vimentin+(粉色)和PanCK+(橙色)片段。插图:个体ROI的更高放大倍数。(C) tSNE根据总体基因表达谱对所有aoi进行降维可视化。tSNE图由片段(左)、样本ID(中)和组织学区域(右)标注。(D)配对t检验PanCK和Vimentin段差异表达基因的火山图。FDR采用Benjamini-Hochberg方法计算。(E)对PanCK AOIs (n=71，左)和Vimentin AOIs (n=70，右)使用无监督聚类的基因表达热图(n=1825)。 Heatmaps are annotated by histological region and sample ID. AOI, areas of illumination; CRC, colorectal cancer; FDR, false discovery rate; PanCK, pan-cytokeratin; ROI, region of interest; tSNE, t-Distributed Stochastic Neighbour Embedding.
使用t-分布式随机近邻嵌入(tSNE)降维的数据勘探显示，如预期的那样，aoi的分段分离清晰(PanCK/Vimentin) (图1 c，左面板)．CTA收集的绝大多数基因在片段间存在差异表达:583个基因在上皮片段上调，1068个基因在基质片段上调(配对t检验;Benjamini-Hochberg法FDR<0.05) (图1 d)．tSNE中AOIs的定位与所测区域的组织学特征相关(图1 c)．有趣的是，在上皮和间质段内，正常和过渡区与高度发育不良和癌性aoi分离。低级别发育不良的上皮段位于这些组织学之间，从而支持了我们研究CRC逐步改变的方法的有效性。在PanCK聚类中，我们观察到与高度发育不良和癌相对应的AOIs在样本中形成了小的亚聚类(图1 c)，很可能代表了肿瘤相关转录组谱的患者间差异。总的来说，这些发现支持CRC的发生不仅与(前)恶性上皮细胞的转录改变有关，而且与周围基质细胞的转录改变有关。
随后，我们在无监督聚类热图中可视化了所有1825个CTA基因的表达，每个片段(图1 e)．在肿瘤发生过程中，上皮段有242个基因上调，间质室有288个基因上调(Spearman相关，FDR<0.05)。有趣的是，在结直肠癌进展过程中，大量的基因表达下降(即上皮中有1152个基因，间质中有857个基因，Spearman相关，FDR<0.05)，这些基因在样本中基本一致，可能反映了恶性转化过程中组织生理特征的共同丧失(图1 e，在线补充图2)．
基因表达变化与CRC的阶梯式进展相关
为了深入了解与从正常组织到癌的逐步进展相关的基因表达变化，我们评估了不同组织学区域之间的差异基因表达(图2 a, B)．正如预期的那样，在正常黏膜和正常黏膜与发育不良之间的过渡区域之间，无论是上皮区还是间质区，只有很小的差异(图2 a, B，上面板)。然而，这些变化可能反映了肿瘤发生的重要初始事件。有趣的是，补体因子B (循环流化床)和C-C motif趋化因子20 (CCL20)在上皮细胞中上调，而C-X-C Motif趋化因子配体1 (处于受控)在过渡区的基质中增加，这为炎症过程的早期发生提供了线索。转到发育不良区域，在上皮细胞和间质区室中均观察到基因表达的实质性差异(图2 a, B)．
(A-B)火山图在逐步比较中显示不同组织学之间差异表达的基因(未配对t检验)。为比较指明了参照组。分别对上皮段(PanCK) (A)和间质段(Vimentin) (B)进行分析。p值为0.05(−log10 p值为1.30103)和log2FC值为0.5作为截断值。标记log2FC最高和最低的差异表达基因和选择感兴趣的基因。(C)在上皮细胞中检测到的5个差异表达基因的log2转化的归一化基因表达的箱线图，以及在间质段中相应的基因表达。(D)间质中鉴定的5个差异表达基因(波形蛋白)和上皮段中相应基因表达的箱线图。Log2FC, log2倍变化;PanCK pan-cytokeratin。
在所有患者中，特定基因在不同组织学的邻近区域之间表现出明显的表达变化，因此是早期疾病拦截的有希望的生物标志物(在线补充图3)．为了说明，我们选择了一些区域间表现出高差异表达的基因(ANOVA) (在线补充图4，在线补充图5)，并且可以在蛋白质水平上获得商业抗体进行验证。MUC4，20.而且沙土荒漠21(即双调节蛋白)，先前被描述为与CRC肿瘤发生有关，以及潜在的新型生物标志物的研究，CD46而且SPINK5在肿瘤的上皮段被强烈地解除调控(图2 c)．在基质中，THY1，PDGFRB，NOTCH3，SERPINH1(即Hsp47)和IFITM1被选作进一步分析(图2 d)．协调的基因表达变化在上皮和间质段被观察到IFITM1，SPINK5而且的研究。所有所选基因的表达变化在患者之间基本一致(在线补充图4)．为了验证这些基因表达的改变是否转化为蛋白质丰度的变化，在相同pT1病变的连续切片上对10个靶点进行免疫检测(图3一，在线补充图5)，以及另外20个pT1 CRC样本(图3 b)．在上皮段，我们证实了mmu -4的失调控(Spearman Rho=−0.68,p=3.96×10−14，图3 a, B)， IFITM1 (Spearman Rho=0.73, p=1.59×10−16)和CD81 (Spearman Rho=0.45, p=5.43×10−6，在线补充图5)．在间质段，我们证实NOTCH3蛋白表达增加(Spearman Rho=0.65, p=4.59×10)−12)， Thy1 (Spearman Rho=0.76, p=5.42×10−19)， PDGFRB (Spearman Rho=0.81, 2.27×10−23)和Hsp47 (Spearman Rho=0.82, p=1.20×10−23)在样本间CRC逐级递增期间(图3一，在线补充图5)．对于CD46，样品间差异较大(Spearman Rho=0.16, p=0.127，在线补充图5)．我们没有检测到丝氨酸肽酶抑制剂Kazal Type 5的蛋白表达(SPINK5)和双调节蛋白(沙土荒漠)不能可靠地评估(数据未显示)。
早期结直肠癌中候选生物标志物的蛋白质丰度差异。(A)使用DSP分析的早期CRC样本中候选生物标志物的蛋白质丰度(n=8)。IHC检测MUC-4、Thy1和Hsp47在不同组织学区域(正常、过渡、低级别异常增生、高级别异常增生和癌)的代表性图像。(B) 20个pT1 CRC样本的独立验证集中候选生物标志物的蛋白质丰度。堆叠柱状图反映了每个得分类别的样本比例。斯皮尔曼相关的显著性用星号表示。* * * p < 0.001。结直肠癌;DSP，数字空间分析;包含IHC,免疫组织化学。
为了研究在pT1样本中鉴定的正常组织区域是否确实代表“健康的”结直肠粘膜，我们使用最近发表的来自NanoString的空间器官图谱，研究了健康个体正常结肠组织中感兴趣的基因的表达。16大多数从正常上皮细胞逐步过渡到癌症的基因，在健康结肠组织的上皮细胞中表现出与pT1病变附近的正常组织相似的表达水平(在线补充图6)．同样，在结直肠癌肿瘤发生过程中，基质中被解除调控的相关基因在pT1病变旁正常区域的波形蛋白片段和健康结肠中波形蛋白阳性区域之间的表达具有可较性(在线补充图7)．这些结果表明，我们的方法识别的基因在CRC肿瘤发生的早期事件中失去了调控，因为它们在健康结肠和pT1病变中被识别为“正常”的区域之间的表达基本相似。
总之，我们的方法识别出的标记物不仅可以告知与恶性进展相关的生物过程，而且重要的是，它们也可以作为生物标记物应用于临床。
与结直肠癌发病相关的生物学过程在上皮和间质之间是不同的
为了全面评估从正常组织到癌的进展过程中的改变，我们使用从WikiPathways数据库检索的集合进行了通路富集分析。18基于通路富集评分，大多数癌性和上皮段高度发育不良的aoi聚集在一起，表明这些区域明显不同于正常和过渡区域以及低级别发育不良对应的组织学(在线补充图8)．我们确定了7个不同的通路簇(C1-C7)与恶性转化有不同程度的关联(图4，在线补充图8)．三个簇(C1, C2和C4)将主要活跃在上皮段的通路分组。c1通路包括与增殖和DNA损伤修复相关的生物过程，在CRC发病期间不断增加。与更高的增殖需求相一致22从正常组织到癌组织丝氨酸代谢途径也增加。大多数聚集在C2的通路与线粒体功能相关，并在上皮部分的恶性转化过程中显示出下降。与氧化磷酸化相关的基因富集减少，同时糖酵解途径的富集分数增加，指向代谢转向有氧糖酵解。23日24同样，在CRC发病期间，C4中的通路减少，主要包括与脂质代谢相关的通路，包括脂肪酸Omega氧化和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路。PPARγ可被脂肪酸激活，并具有抗肿瘤(如抗增殖和促凋亡)作用。25C4的这些改变在基质中是平行的，表明它们在两个生物区室中都有协调的调节。在上皮细胞和间质中观察到聚集在C3的通路的活性，并证明与肿瘤进展有不同的相关性。这些包括MUC1糖基化改变在肿瘤微环境中的作用，nod样受体(NLR)家族蛋白和细胞质DNA传感。C5、C6和C7簇的通路主要与间质室相关。C5中的通路主要反映了在肿瘤发生过程中明显解除调控的免疫相关通路。异常增生和侵袭性癌区域的基质中特别富集C6和C7通路，包括转化生长因子(TGF)-β受体信号、局灶性粘附、基质金属蛋白酶和新生血管，所有这些都与肿瘤恶性行为的增加有关。在上皮和间质室中，C7的特定通路与高度发育不良和癌组织学相关。这些途径包括通常与CRC进展相关的途径，如Wnt和p53信号，但也包括在这种疾病的背景下较少探索的途径，如先天免疫感应。这些结果证明了在肿瘤发生过程中显著的转录组改变，以及与恶性肿瘤相关的生物学过程的存在，这些过程在肿瘤的上皮或间质区室中特别丰富。
与上皮和间质间室的组织学进展相关的关键生物学途径。aoi按段、区域和样本ID排序。使用维基路径数据库中的基因集计算基因集富集分数(ssGSEA)的无监督聚类。所有与组织学有显著关联的通路，无论是PanCK段还是Vimentin段，都被包括在内(FDR<0.05)。已识别路径的主要集群用白色水平线表示。分别为PanCK段和Vimentin段的每个通路显示了组织学作为序数变量与富集分数之间相应的Spearman相关系数Rho(虚线热图)。FDR采用Benjamini-Hochberg方法计算。此热图的无监督版本，对行和列都使用了无监督聚类，包括为在线补充图S8。AOI，照明面积;FDR，错误发现率;PanCK pan-cytokeratin;ssGSEA，单样本基因集富集。
CRC进展过程中的免疫相关改变
对CRC发病期间观察到的免疫相关通路的变化感兴趣，我们随后关注不同组织学区域之间肿瘤(免疫)微环境的改变。首先，我们进行免疫细胞反褶积，以估计每个AOI中特定细胞亚群的相对丰度。在间质室中，我们定义了多个组织区域间相对丰度不同的免疫细胞亚群(ANOVA;Benjamini-Hochberg法FDR<0.05)。浆细胞、B细胞、CD8 T细胞、CD4 T细胞、T调节细胞、γδ T细胞和自然杀伤细胞的相对丰度从正常组织下降到癌组织(图5一个)．另一方面，成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞的相对丰度在肿瘤发生过程中增加(图5一个)．这些结果指向了伴随肿瘤进展的免疫抑制微环境的发展，这也与免疫抑制信号通路如TGF-β (图4 c，集群C7)。代谢途径
与结直肠癌组织学相关的免疫相关改变。(A) Vimentin片段中不同免疫细胞群在组织学上的反卷积丰度箱线图。(B) Spearman’s Rho森林图和对应的95% CI为WikiPathways免疫相关通路富集评分与组织学作为序数变量的相关性。分别在PanCK段和Vimentin段进行相关性分析。(C) Vimentin片段中不同区域免疫调节剂的表达。aoi(列)按组织学顺序排序，随后按样品ID排序。分别计算上皮段和间质段的表达z评分。免疫调节剂的类型，无论是抑制性或刺激性，指出。结合了PanCK和Vimentin区域的无监督热图版本，对行和列使用无监督聚类，包括为在线补充图9。(D)表达的折线图CD47而且SIRPA在tumourigenesis。显示平均富集分数和相应的95% CI。结直肠癌;log2FC, log2倍变化;PanCK pan-cytokeratin;ROI，感兴趣的区域。
为了定义超出肿瘤微环境细胞组成估计的免疫相关改变，我们重新评估了专注于免疫相关基因集的WikiPathways的改变富集。大多数免疫相关特征(20/27)在恶性转化过程中发生改变，反映了免疫微环境的实质性变化(图5 b)．与去卷积B细胞丰度的降低一致，从正常组织到癌组织，“B细胞受体信号通路”的富集评分下降。其他与组织学进展呈负相关的途径包括“T细胞受体和共刺激信号通路”和“干扰素介导的信号通路概述”，反映了微环境中T细胞数量的减少。在从正常粘膜到癌的发展过程中，不同的细胞因子相关通路在间质中上调，包括干扰素γ、白细胞介素(IL)-11、IL-10、IL-6、IL-9、IL1R和IL-18信号通路。许多这些细胞因子已经在先天免疫的背景下被描述过(IL-1, IL-6, IL-10和IL-18)。29（图5 b)．我们还确定了与先天免疫相关的两条通路，包括“纤维蛋白补体受体3信号通路”、“核酸代谢和先天免疫感应”和“NLR家族蛋白”。有趣的是，先天免疫感应基因在上皮细胞室中特别增加，这表明上皮细胞中这一途径的激活与先天免疫反应的发展之间存在联系。30.导致这一特征增加的基因包括DDX58，OAS1而且小牛，这对抗病毒先天免疫至关重要。31NLR家族蛋白与微生物的先天免疫感应和感染相关的生理变化有关，32并且在肿瘤进展过程中波形蛋白段被特异性上调。
接下来，我们重点研究了与癌症免疫相关的免疫调节基因的表达。正如预期的那样，大多数免疫调节基因的表达来源于间质片段(在线补充图9)．正常组织和过渡组织间质中大量免疫调节剂升高(图5 c，在线补充图9)，这可能反映了结直肠组织中存在的紧密平衡，以提供免疫防御，但防止炎症加剧。有趣的是，一组特定的免疫调节基因显示了一种双相模式(聚类4，图5 c)，在正常组织和转化组织中表达量高，在异常增生组织中表达量降低，在癌组织间质中表达量略有升高。这些免疫调节基因在癌组织中的“获救”表达表明，癌细胞侵入邻近组织时，t细胞调控机制的采用较晚。免疫免疫调节剂小鼠(B7-H3)和SIRPA(SIRPα)在高度发育不良和癌区间质中表达增加。B7-H3可导致T细胞抗肿瘤活性降低33 34已知它的表达来自骨髓细胞，也来自癌症相关的成纤维细胞，34 35这与肿瘤进展过程中它们的丰度增加是一致的。类似地，SIRPα，或信号调节蛋白α，主要在髓细胞中表达36这与肿瘤进展过程中观察到的去溶化巨噬细胞的增加相一致(图5一个)，有趣的是，它的结合伙伴在肿瘤细胞上的表达，CD47，在异常增生组织和癌组织的上皮室中增加(图5 d)．肿瘤细胞上的CD47与巨噬细胞上的SIRPα结合可抑制巨噬细胞介导的吞噬作用。37-40我们的观察表明，肿瘤细胞提供的这种“不要吃我”信号可能构成早期CRCs的免疫逃逸机制。
从正常组织向癌症发展过程中巨噬细胞群的转移
我们对CRC肿瘤发生早期CD47-SIRPα轴的潜在上调感兴趣，研究了8个pT1样本中CD47和SIRPα的蛋白表达(在线补充图10A)和18个独立的pT1结直肠癌组织(图6 a, B)．我们证实了CD47在上皮细胞和SIRPα在基质细胞上的表达。我们验证了这些蛋白的表达从正常的结直肠组织到癌的逐步增加(图6 a, B) (CD47, Spearman Rho=0.47, p=6.5×10−6；SIRPα， Spearman Rho=0.60, p=2.2×10−9)．
CD47/SIRPα轴的上调及巨噬细胞亚群在正常结直肠组织逐步向癌症发展过程中的相应转移(A)免疫组化在pT1 CRC不同组织学样本中检测SIRPα和CD47。(B) 18个pT1 CRC样本独立验证集中SIRPα和CD47的IHC评分。堆叠柱状图显示了每个组织区域根据SIRPα和CD47表达的样本分布。斯皮尔曼相关的显著性用星号表示。* * * p < 0.001。(C) pT1 CRC样本正常区域和癌区巨噬细胞亚群的成像质量细胞术可视化。显示HLA-DR的代表性图像+CD204+正常区域的巨噬细胞和HLA-DR−CD204+癌区巨噬细胞。髓系标记:CD68 (红色的)， cd204 (蓝色的)，以及HLA-DR (绿色)．肿瘤用ß-catenin (白色)．(D)由IMC定义的从正常结肠组织到癌的不同巨噬细胞亚群的相对丰度。(E)来自Pelka scRNA-seq数据集的62个CRC样本(n= 17590个细胞)和35个相邻正常样本(n=1257个细胞)的所有巨噬细胞的tSNE包埋等,2021年。每个点代表一个单元格。六组不同的巨噬细胞被鉴定出来。(F)小提琴情节表现的表达CD163，MSR1，HLA-DRA而且SIRPA在每个确定的巨噬细胞簇中。(G)正常组织和癌组织中各巨噬细胞簇的流行率。结直肠癌;包含IHC,免疫组织化学;IMC，成像细胞术;scRNA-seq，单细胞rna测序;tSNE, t分布随机近邻嵌入
为了更好地描述和证实CRC肿瘤发生过程中免疫微环境的改变，我们对来自相同病变的连续切片进行了成像细胞术(IMC)。在正常组织向癌变过程中，观察到树突状细胞、单核细胞、粒细胞、先天淋巴细胞、成纤维细胞和血管密度增加(在线补充图10B)．这些密度与基因表达数据的反褶积估计基本一致(图5一个)，但也有例外，包括巨噬细胞。有趣的是，尽管巨噬细胞的密度并没有从正常水平上偏离，但通过异常发育到癌区，特定巨噬细胞种群的相对丰度却发生了显著变化(图6 a, B)．巨噬细胞通过CD68的表达进行鉴定，并根据CD163、HLA-DR和/或CD204的表达进行划分。HLA-DR的相对频率+巨噬细胞(可能的促炎亚群)在从正常组织逐步发展到结肠癌的过程中减少(图6 c, D)．相反，HLA-DR的相对频率−CD204+在CRC进展过程中，与CD163表达无关的巨噬细胞亚群增加(图6 c, D)．HLA-DR−CD163+CD204−巨噬细胞表现为双阶段模式，最初增加，直到出现低级别发育不良区域，随后从低级别发育不良减少到癌症(图6 b)．基于这些数据，我们推测SIRPα在pT1 CRCs中的表达很可能来源于HLA-DR−CD204+巨噬细胞群(图6 b)．
我们通过询问Pelka从CRC和邻近正常组织中公开获得的scRNA-seq数据集来调查这一假设等。11该数据集包括来自62个CRC样本和35个相邻正常样本的单个细胞。我们分别从该数据集中聚类所有巨噬细胞，得出6个亚群(图6 c，在线补充图11)．这些巨噬细胞亚群表现出特定的基因表达谱(在线补充图11)，并表现出明显的表达水平CD163，MSR1(CD204),HLA-DRA而且SIRPA（图6 d，在线补充图11)．表达高水平的巨噬细胞群SIRPA(聚类0,1,3)，共表达MSR1(CD204)，表达较低HLA-DRA与其他巨噬细胞亚群相比(图6 e, F)．与我们的观察一致，我们注意到的流行率明显增加SIRPA+MSR1+-在肿瘤组织中表达巨噬细胞亚群(占所有巨噬细胞的77.3%)与正常组织(占所有巨噬细胞的24.6%)相比(图6克)．总之，这些结果为在从正常组织到癌症的逐步进展过程中巨噬细胞种群的转移提供了证据，并伴随着CD47/SIRPα轴的上调。
讨论
在这里，我们将DSP多区域转录组分析与IMC癌症免疫微环境的高维特征结合起来，以评估CRC发病期间的生物学变化。这种方法可以对CRC肿瘤发生早期阶段的改变进行独特而全面的评估，而这是无法通过批量或单细胞转录组学研究提供的。
除了重新认识被称为癌症特征的生物途径之外，2我们的方法为这些改变发生的相关生物隔室提供了背景。因此，我们能够确定结直肠癌肿瘤发生过程中致癌、代谢和免疫相关过程的改变。特别是在间质段，我们观察到从正常组织到癌组织的细胞组成发生了重大变化。与癌前息肉中免疫成分的观察结果一致，13我们注意到在pT1 CRCs中，B细胞和浆细胞减少，成纤维细胞从正常区域增加到癌区。此外，IMC发现血管、单核细胞、树突状细胞和粒细胞密度逐步增加。同时，我们注意到巨噬细胞种群从HLA-DR转移+亚群，据说代表促炎亚群，免疫抑制HLA-DR−CD204+CRC进展过程中的巨噬细胞亚群。41 42
适应性免疫反应对CRC的影响已经得到了很好的证实。43 44尽管浸润CRCs的免疫细胞中有很大一部分来源于髓系，但我们对先天免疫系统对癌症进展的贡献的理解还不够深入。45肿瘤引发的炎症被认为是由肿瘤发生过程中上皮屏障的破坏引起的，这使得微生物产物从肠腔转移到激活组织驻留的髓细胞。46个47此外，坏死性细胞死亡，缺氧条件和缺乏足够的营养已被描述为诱导先天和适应性免疫反应。46在这项研究中，我们观察到在正常组织逐步向癌组织转变的过程中，与先天免疫相关的基因增加。在正常组织向发育不良的过渡区域，我们检测到转录物的上调循环流化床而且CCL20在上皮细胞和处于受控在基质中。此外，我们还发现补体途径的主要成分以及与先天免疫相关的细胞因子(IL-1、IL-6、IL-10、IL-18和TGF-β)的上调。29在通路水平上，在pT1癌症的上皮细胞中，肿瘤进展过程中核酸代谢和先天免疫感应的上调是明显的。此外，我们在间质室中通过NLR家族成员发现了微生物传感活动的证据。肿瘤呈递细胞和抗原呈递细胞在核酸感测中的作用已被描述。48已经描述了Nod1和结直肠肿瘤发生之间的联系，其中细菌传感器Nod1通过精氨酸酶活性发挥免疫抑制潜能，从而通过创建肿瘤允许微环境促进肿瘤发生。49这些变化与慢性炎症是一致的，慢性炎症是癌症的标志之一，50它可以刺激肿瘤转化并维持疾病进展。
我们的分割方法使我们能够定义免疫调节基因的配体和相应的受体关系。我们定义了同时上调SIRPA在基质中CD47在结直肠癌的逐步发展过程中我们发现HLA-DR−CD204+在CRC肿瘤发生过程中出现频率增加的巨噬细胞正在表达SIRPA。由于CD47的表达向表达SIRPA的巨噬细胞提供了“不要吃我”的信号，38-40这可能是早期CRCs免疫逃逸的有效机制。因此，CD47/SIRPA轴也可能是这些癌症的一种有趣的候选治疗方法。阻断这种先天免疫检查点的免疫治疗策略目前处于早期临床试验阶段。38 51 52
这项工作也为发现新的生物标志物提供了一个框架，以帮助早期疾病拦截和临床管理。人口筛查规划旨在早期诊断和治疗结直肠癌，从而降低患者发病率和死亡率。53这些项目导致诊断为早期CRC(如pT1 CRC)的患者数量增加。54这些都适用于侵入性较小的临床干预，包括内窥镜切除肿瘤。在pt1期CRCs中，保守性(如内镜)手术后是否应该进行广泛的治疗性手术(如手术切除)的困境，通常通过对病灶的形态学和组织学评估来解决。55 56然而，这种策略是次优的，这反映在大量的过度治疗患者(~ 80-90%)。57 58在CRC的晚期，微卫星不稳定状态、共识分子亚型分类和免疫评分与临床结果相关。4 7 59这些参数无法准确预测pT1 CRCs的临床结果，60通过专门研究早期CRCs，强调了对新型标志物的需求。我们的方法通过对pT1 CRCs中从正常组织到癌症的基因表达动态进行特异性检查，识别出新的潜在生物标志物。未来需要在更大的患者队列中进行研究，以研究其与临床参数和预后的关系。此外，该技术和方法对于研究潜在的生物标志物，通过检查CRC患者和健康对照组的样本来识别癌症风险增加的个体也具有很高的价值。
总之，本研究展示了数字空间分析在早期结直肠癌中的应用，并为伴随结直肠癌逐步发展的生物学过程提供了见解。我们的结果表明先天免疫在CRC发病中起着重要作用。此外，我们的方法为识别CRC肿瘤发生过程中持续改变的生物标志物提供了一个框架。这些见解为改善早期结直肠癌患者的临床管理铺平了道路。
数据可用性声明
数据可以在一个公共的、开放访问的存储库中获得。GeoMx原始数据和规范化数据可通过FigShare获得https://doi.org/10.6084/m9.figshare.16818415。成像质量细胞仪文件(mcd文件)和相应的注释文件在BioImage Archive(登录号S-BIAD587，https://www.ebi.ac.uk/biostudies/bioimages/studies/S-BIAD587)．
伦理语句
患者发表同意书
伦理批准
本研究由医学伦理委员会METC leden - den hag - delft批准(方案B20.039和B22.036)，所有患者均知情同意。参与者在参与研究前均知情同意参与研究。
参考文献
补充材料
脚注
贡献者JR分析了数据，解释了结果，并撰写了手稿。MvdP进行实验。MEI分析了成像质量细胞术数据。HD、JJB、JCHH和LJACH提供了患者的样本。HD、LJACH和MvdP对样品进行了处理。NFCCdM和HM选择感兴趣的区域，进行免疫组织化学染色评分。该项目由NFCCdM发起、主导并撰写稿件，并作为担保人对整体内容负责。所有作者讨论了结果并对手稿进行了评论。
资金这项工作得到了欧洲研究委员会(ERC)在欧盟地平线2020研究和创新计划下的支持(资助协议编号:no。852832)，研究基金STIMAG ' Stichting Management Apothekers en de Gezondheidszorg ' 2021 (STIMAG2021)和欧洲科学技术合作(成本)行动(CA17118)。
相互竞争的利益没有宣布。
患者和公众参与患者和/或公众参与了本研究的设计、实施、报告或传播计划。更多细节请参阅方法部分。
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