条文本
PDF
摘要
客观的衰老伴随着多种身体功能的退化和炎症，这些共同导致虚弱。我们和其他研究人员已经证明，虚弱与肠道微生物群的变化共同变化，而这种变化会因食用限制多样性的饮食而加速。地中海饮食(MedDiet)与健康有关。在NU-AGE项目中，我们调查了为期1年的MedDiet干预是否可以改变肠道菌群并减少虚弱。
设计我们在五个欧洲国家(英国、法国、荷兰、意大利和波兰)进行了为期12个月的针对老年受试者的MedDiet干预(NU-AGE饮食)前后，对612名非虚弱或前期虚弱受试者的肠道微生物群进行了分析。
结果坚持饮食与特定的微生物群变化有关。通过坚持饮食而丰富的分类群与较低的虚弱和改善的认知功能的几个标记物呈正相关，与炎症标记物包括c反应蛋白和白细胞介素-17呈负相关。对推断的微生物代谢物谱的分析表明，饮食调节的微生物组变化与短链/支链脂肪酸产量的增加和次生胆汁酸、对甲酚、乙醇和二氧化碳产量的降低有关。微生物组生态系统网络分析表明，对MedDiet干预反应积极的细菌类群在网络中占据关键交互位置，而与脆弱相关的类群在网络中处于外围。
结论总的来说，我们的研究结果支持了改善习惯性饮食以调节肠道微生物群的可行性，从而有可能促进更健康的老龄化。
- 饮食
- 肠道细菌菌群
- 老化
- 炎症
- 肠道细菌
这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名非商业(CC BY-NC 4.0)许可证发布，该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此基础上进行构建，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是正确引用原始作品，给予适当的荣誉，任何更改都已注明，并且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．
数据来自Altmetric.com
本研究的意义
关于这个主题我们已经知道了什么?
衰老与多种身体功能的退化和炎症有关，导致身体虚弱。
虚弱的发作与肠道菌群的变化有关，而肠道菌群的变化与限制性多样性饮食有关。
地中海饮食制度与健康正相关。
新的发现是什么?
坚持地中海饮食会导致特定类群的丰度增加，这些类群与较低的虚弱和改善的认知功能的几个标志物呈正相关，与包括c反应蛋白和白细胞介素-17在内的炎症标志物呈负相关。
这些关联不受年龄和体重指数等宿主因素的影响。
推断的微生物代谢物分析表明，饮食调节的微生物组变化与短链/支链脂肪酸产量的增加和次生胆汁酸、对甲酚、乙醇和二氧化碳产量的降低有关。
微生物生态系统网络分析表明，MedDiet干预后富集的细菌类群在网络中占据关键交互位置，而脆弱相关类群在网络中处于外围。
本研究的意义
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
我们的研究结果支持了改变习惯饮食以调节肠道微生物群的可行性，从而有可能促进更健康的衰老。
我们的发现也提供了一个候选类群的简短列表，可以进一步研究作为活生物治疗剂直接给老年受试者以减少衰弱的发作。
简介
伴随衰老而来的衰弱包括多个生理系统的衰竭1先天免疫炎症反应的持续激活2虚弱可能包括慢性低度炎症(即炎症老化)的发展，3.认知功能的丧失，4sarcopenia5以及糖尿病和动脉粥样硬化等慢性疾病的发展。3.改变饮食模式，如采用地中海饮食(MedDiet)已被建议作为解决虚弱的主要治疗策略。6MedDiet养生法的特点是多吃蔬菜、豆类、水果、坚果、橄榄油和鱼类，少吃红肉、乳制品和饱和脂肪。7坚持MedDiet与降低死亡率、增加抗氧化活性、减少几种疾病的发病率以及减少炎症有关。8几项研究表明，增加对MedDiet的坚持与减少虚弱有关。9除了与疾病的负相关外，较高的MedDiet依从性与肠道微生物组组成的有益变化有关，变形菌丰度的减少伴随着短链脂肪酸产生水平的增加。10 11在全球范围内，大多数老年人不使用MedDiet，事实上，老年人保健的一个主要挑战是食用与低多样性肠道微生物组相关的限制性饮食，特别是在长期住院护理的受试者中。12日13在之前的工作中，我们使用精细的生物信息学(双聚类)分析来识别在从高多样性微生物组健康受试者到低多样性脆弱受试者过渡的增量阶段丢失的特定微生物类群。14在最近完成的为期6个月的饮食干预中，老年人每天补充多达20克的5种益生元，多种肠道微生物类群对益生元补充剂有反应，15但总体菌群α多样性没有变化，炎症标志物减少的趋势没有达到总体统计显著性。因此，我们认为需要采取更有力的饮食干预措施。
NU-AGE饮食干预项目旨在对1200多名年龄在65-79岁之间的老年人进行为期12个月的定制化MedDiet的影响研究。16分布在五个不同的国家(波兰、荷兰、英国、法国和意大利)。本研究的基线和干预后结果报告了代谢物水平以及身体成分数据的性别和国家特异性差异。对NU-AGE MedDiet的坚持增加与整体认知能力和情景记忆的增强之间观察到显著的相关性。17此外，较高的依从性已被证明可以降低骨质疏松症患者的骨质流失率18为了提高先天免疫功能，19血压和动脉硬化。20.在当前的研究中，我们分析了nuage MedDiet对nuage试验参与者子集肠道微生物群落的影响，该试验包括612名参与者(289名对照组(145名男性和144名女性)和323名nuage MedDiet参与者(141名男性和182名女性)。多种有益结果与微生物组的改变相关。
方法
研究参与者和饮食干预
NU-AGE研究是一项为期1年的随机多中心单盲对照试验(在clinicaltrials.gov上注册)。NCT01754012)．关于招募参与者和饮食干预的细节，以及与人体测量学、衰弱和认知反应相对应的元数据的收集，之前已经描述过。17日21在线补充表1提供可获得基线和最终时间点配对微生物组概况的国家参与者的描述性统计数据。
生物信息学和生物统计分析
在线补充文本3提供用于扩增子序列数据的生物信息学和多元统计分析的方法的完整描述。这包括对序列读取的预处理，25嵌合体的鉴定和清除，26日27日操作分类单位(OTUs)的分类学分类28 29基于机器学习的与饮食干预相关的微生物类群识别30.(描述的在线补充图1)、利用迭代二元双聚类基因集(iBBiG)方法识别分类模块、31饮食依从性和饮食相关的分类标记与饮食的各种成分以及虚弱和炎症的标记的关联分析，计算meddiet相关的微生物组指数(如图所示)在线补充图2)以及这些指标与膳食成分、炎症和虚弱的关联分析，根据每个样品的物种丰度和先前策划的实验验证的物种到代谢物链接的映射，获得推断的代谢物剖面32 33共现网络的生成和可视化以及中心性度量的计算(参见在线补充文本3)．30 34
结果
饮食和微生物组的概况在基线时在不同国家之间共同变化和不同
总体而言，共有612人(在对照和干预队列中)在基线和1年(称为“最终”)时间点收集了配对的微生物组数据。虽然各国对照组和干预组中个体的年龄范围相似，但干预组中女性的代表性略高(Fisher检验p<0.12;在线补充表1)．主坐标分析(PCoA)表明，在基线时，各国之间的饮食存在显著差异，显示出三个不同的亚组(图1一个) (PERMANOVA p<0.001: R2=0.33):第一个包含意大利语科目;第二部包含英国和法国科目;第三个是来自荷兰和波兰的。这种特定的聚类模式也在PCoA水平上观察到(基于Spearman距离)，使用基线时的16S rDNA OTU谱(图1 b)(显著性:PERMANOVA p<0.001;虽然有相当多的重叠:R2= 0.036)。虽然意大利受试者的微生物群组成不同，但来自英国/法国和波兰/荷兰的受试者彼此更相似。Procrustes对食物消耗和OTU丰度谱的分析证实了饮食和微生物组组成之间的显著关联(图1 a, B；在线补充图3；Procrustes RV系数0.23;p < 0.001)。特定的微生物组成分驱动了基线时国家特定的分离(Mann-Whitney检验fdr校正p<0.15;在线补充图4A-B)．正如预期的那样，干预组的饮食变化与对照组有显著差异(envfit p<0.006) (图1 c)．干预组的这些变化主要是由于纤维、维生素(C、B6、B9、硫胺素)和矿物质(Cu、K、Fe、Mn、Mg)摄入量的增加，而对照组的变化与相对于MedDiet干预组的脂肪摄入量(饱和脂肪和单一不饱和脂肪酸)的增加有关(图1 d)．
基线习惯饮食和微生物群组成因国家而分离和共同变化，饮食干预改变了宏量营养素的分布。5个不同国家(A)基线饮食概况和(B)基线16S微生物组概况的主成分分析(PCoA)图。对于两者，还表明了与国家关联的重要性的PERMANOVA p值。对于饮食频率之间的联系，微生物组分布R2并给出了用Procrustes分析得到的显著性值。结果表明，饮食习惯存在国家特有的模式，这也反映在微生物组概况中。(C) PCoA图显示干预组和对照组饮食模式的明显变化。同时还指出了这些差异的PERMANOVA p值。这反映了饮食干预的效果，以检测驱动这些影响的特定饮食成分。计算各组分的进气频率与两个PCoA轴(PCoA1和PCoA2)之间的关联。这些关联在(D)中表示。虽然干预组主要是由纤维、维生素(C、B6、B9、硫胺素)和矿物质(Cu、K、Fe、Mn、Mg)消费量的增加所驱动，但对照组的变化与脂肪消费量的增加有关。
增加对NU-AGE MedDiet的坚持会影响先前与健康相关的肠道微生物组的特定成分
在干预组和对照组中，来自各个国家的受试者的全球肠道菌群多样性没有显著变化(在线补充图5)．然而，我们观察到，在整个研究中，增加对饮食的坚持与微生物群落多样性的减少有关(表1)．为了进行更详细的微生物-饮食关联分析，我们使用了先前基于NU-AGE食物膳食指南(FBDG)计算的MedDiet依从性评分。35这些建议是促进或衡量遵守健康饮食倡议或改善公共健康的饮食干预措施的基础。nuage FBDG涵盖了15个饮食目标，包括Berendsen详细描述的维生素D补充剂等．35我们创建了随机森林(RF)模型，从基线和最终(1年)时间点的微生物组特征来预测饮食依从性。对于这两个模型，预测食物得分(使用随机森林模型)和实际食物得分之间的相关性观察是显著的(基线:R=0.27;p < 1.2 e-11;最后:R = 0.30;p < 2.2 e-14) (在线补充图6A,B)，表明微生物组和坚持MedDiet之间存在明显的联系。对于任何一个时间点，75个OTUs的最佳集合提供了最高的预测性能(两者结合的OTUs总数为129个;看到在线补充图6C,D)，以确定微生物组对MedDiet的反应。在整个研究中，我们将这些称为“饮食反应性”OTUs/类群/标记。总体而言，使用这一最佳OTUs集，预测的依从性评分与观察到的依从性评分之间的相关性为0.39 (p<2.2 e-16) (图2一个)．顶级预测OTUs的列表及其分类(使用SPINGO获得28)载于在线补充表2．
基于机器学习的饮食反应类群识别。(A)使用随机森林方法获得的实际和预测饮食分数之间的相关性。(B)对饮食做出积极和消极反应的顶级标记操作分类单位(OTUs)的特征重要性得分排序，以及它们的分类学从属关系(关于与食物得分显著相关的顶级标记的选择，请参见方法部分)。与饮食评分有显著正相关或负相关的顶级标记分别被标记为“饮食积极”和“饮食消极”。这两个类群显示出不同的分类。而饮食阳性标记有过度代表的物种，如Faecalibacterium prausnitzii，真细菌而且Roseburia阴性标记的特点是存在瘤胃球菌属扭矩，Collinsella aerofaciens，Coprococcus来，Dorea formicigenerans，ramosum梭状芽胞杆菌．关联不同组的依从性得分也反映在变化在时间点之间的干预和控制军团(见C)。(C)箱线图显示log-fold收益/损失比率变化的各种分类单元(即个人的数量给定OTU增加的数量除以个人在减少在时间点)干预组与不干涉的两组。虽然饮食阳性OTUs在干预组(与非干预组相比)中有相对积极的增加，但饮食阴性的变化表明干预后显著减少。(D)根据nuage饮食坚持的积极变化增加，将个体分为三组(低、中、高)后，得到的箱线图显示各组中饮食积极和饮食消极OTUs的跨时间点变化。关联显著性的p值表示为****p<0.0001， ***p<0.001， **p<0.01， *p<0.05。
共有44个最高预测OTUs与坚持得分呈正相关(随着坚持饮食的增加而增加)，45个与坚持MedDiet呈负相关(随着坚持MedDiet而减少)(见方法部分)。我们将其分别称为“积极饮食”和“消极饮食”OTUs。这些otu的一个子集(带有已定义的分类学分类)以及它们的绝对特征重要性分数显示在图2 b．组成这两个类群的分类群是不同的。饮食阳性OTUs主要分配给Faecalibacterium prausnitzii，连同Roseburia（r . hominis)，真细菌（大肠rectale，大肠eligens，大肠xylanophilum)，叫多形拟杆菌，普氏菌copri而且Anaerostipes hadrus．这些类群中的大多数以前都报道过积极的健康关系，包括短链脂肪酸(SCFAs)的产生和抗炎特性，以及与2型糖尿病和结直肠癌等疾病的负面关系。36-38f . prausnitzii也与老年人的虚弱发病呈负相关。39相反，饮食消极的otu主要属于瘤胃球菌属扭矩，Collinsella aerofaciens，Coprococcus来，Dorea formicigenerans，ramosum梭状芽胞杆菌，韦永氏球菌属dispar，Flavonifractor plautii而且放线菌lingnae．的丰度增加r .扭矩，c . aerofaciens，c . ramosum而且诉dispar与2型糖尿病、结直肠癌、动脉粥样硬化、肝硬化和炎症性肠病有关。38 40-43这些发现共同表明，坚持MedDiet有可能在与健康积极相关的方向上调节微生物组。
值得注意的是，尽管各国在基线时微生物组组成存在差异(图1 b；在线补充图4A,B)和不同的饮食习惯(在线补充图7A)(这也是先前对该队列的研究所报告的)，35 44在整个队列中确定的饮食响应分类群在很大程度上是在不同的民族中共享的，也就是说，它们与饮食的联系并不是特定于任何国家(见在线补充文本4；在线补充图4A,B；在线补充图7)．它们与MedDiet依从性的关系在干预组和对照组的丰度变化模式中得到了进一步的验证，以及在对饮食依从性增加的个体中得到了进一步的验证在线补充文本5；在线补充图8，图2 c, D)．
接下来，我们研究了肠道微生物群内的共发生模块。这些模块类似于微生物群落中的“行会”，具有相似或相关的功能特性。我们使用iBBiG来识别肠道微生物组中的模块，31这是我们之前在ELDERMET队列中用来确定微生物组颗粒差异作为健康老龄化功能的方法14(见在线补充文本3；在线补充图9；联机补充表3和4)．iBBiG在NU-AGE数据集中确定了6个重叠的分类模块(命名为A到F)。值得注意的是，我们发现了一个特定的模块C，它在虚弱程度增加的个体中显著过度丰富，在饮食阴性otu组中也有增加的表现(见在线补充文本6；在线补充图9C,D)．这表明模块C类似于我们在ELDERMET个体中识别的长时间逗留类模块。14然而，在遵循MedDiet而减少的OTUs组中，模块C的特定富集表明，MedDiet可能成功地以与虚弱负相关的方式调节肠道微生物组。
坚持NU-AGE MedDiet干预以一种与虚弱和炎症负相关的方式调节微生物组
NU-AGE饮食干预的主要目标是减少虚弱和炎症老化。根据Fried分数，研究对象被分为非虚弱(或明显健康)、前期虚弱和虚弱组。21虽然饮食阴性类群在三个脆弱类群(即，虚弱>前虚弱>非虚弱)中显示出逐步显著减少，但饮食阳性类群在健康(非虚弱)个体中显示出明显更高的丰度(与虚弱个体相比)在线补充图10A)．饮食阳性分类群在衰弱程度降低的个体中显示出显著的阳性变化(见在线补充文本7；在线补充图10B)．在干预期间，在对照组中，虚弱程度增加的个体比例(与干预组相比)略有显著增加(Fisher检验p<0.06;在线补充图10C)．然而，我们无法观察到饮食坚持得分与虚弱之间的直接联系(在线补充图10D)．我们假设饮食坚持对虚弱的影响可能是间接的，因此增加对地中海饮食的坚持可以调节微生物组(可能与一些无反应的人)，并且这种微生物组反应可能与虚弱的减弱或降低风险和其他健康指标的改善直接相关。
为了调查这一点，我们计算了整个研究队列中饮食响应性OTU标记物与虚弱、认知功能和炎症的特定指数之间的关联(见在线补充表5对于测试的元数据列表)。目的是测试饮食反应类群是否与这些指数表现出显著不同的关联趋势在线补充图11)．总体而言，尽管相关的绝对值相对较弱，但我们观察到饮食阳性和饮食阴性OTUs与五种不同细胞因子/生物标志物(即促炎高敏C反应蛋白(hsCRP)和白细胞介素17 (IL-17)、抗炎sGP130以及脂联素和瘦素)的关联模式存在显著差异;三项与虚弱相关的测量(Fried评分、握力和步态速度时间);巴布科克记忆评分和构造练习(两者都与认知功能有关)。然而，最值得注意的观察是这些关联的模式。饮食阳性OTU标记物与炎症标记物hsCRP和IL-17水平以及Fried评分和步态速度时间(两者都与虚弱增加有关)具有一致的负相关(显著低于饮食阴性标记物)(图3一)．相比之下，它们与认知功能改善(如构造练习、BabCock记忆评分)、虚弱程度降低(握力)和两种细胞因子(脂联素和sGP130)(与饮食阴性OTU标记物的趋势完全相反)的测量结果一致呈正相关。虽然脂联素作为一种抗炎标志物的作用已经得到了充分的证明，45sGP130是促炎反式IL-6信号通路的负调控因子。46值得注意的是，尽管在饮食摄入、微生物组评分和依从性评分方面存在国别差异，但至少有三个国家可以复制这些关联(除了巴布科克记忆评分)(就关联的方向和意义而言)(10个关联中的6个在5个国家中的4个重复)(图3 b)．这些结果清楚地表明，坚持NU-AGE MedDiet与微生物组的调节相关，这是一种相对一致的方式(在各国)，反过来又与减少虚弱、改善认知功能和减少炎症相关。
饮食反应类群与不同的虚弱、认知功能和炎症指标的一致关联。(A)热图显示粘附相关标记物操作分类单位(OTUs)(从上到下按与粘附分数相关性的递增顺序排列)与选定的虚弱、认知功能和促/抗炎细胞因子水平的关联模式的变化(使用斯皮尔曼罗斯获得)。对于每个单元格，颜色表示斯皮尔曼rho值(如图所示)。**与fdr校正p值<0.15显著相关。*与名义p值的边际相关性<0.05。饮食阳性和饮食阴性OTUs也被划分了。可以观察到不同测量的关联模式与饮食阳性和饮食阴性OTUs之间的具体差异。对于某些测量，如高灵敏度C反应蛋白(hsCRP)水平、白介素17 (IL-17)水平和步态速度时间，饮食阳性OTUs被观察到与饮食阴性OTUs相比具有明显更多的负相关性。对于其他与减少虚弱和改善认知功能以及脂联素和sGP130水平相关的措施，观察到完全相反的趋势。(B)热图显示这些趋势在每个特定国家队列中的复制情况。 Brown indicates those cases where the correlations of the DietPositive OTUs were significantly more negative than the DietNegative group, green indicates those cases with the opposite trend and yellow indicates those cases of no significant change.
微生物组反应，伴随着肠道代谢谱的特定有益变化，是饮食坚持和健康之间的关键中间物
基于之前的发现，与饮食坚持相关的微生物组似乎比仅仅坚持饮食本身对改善健康状况更重要。验证这一假设需要计算可测量的“微生物组得分/指数”(类似于饮食坚持得分)，这将考虑到与个体标记物OTUs相关的变化。转向nuage MedDiet的特点是改变特定膳食成分的消费模式，即增加纤维(蔬菜、水果)、碳水化合物(全谷物)、植物蛋白(豆类)、多不饱和脂肪酸(鱼类)和维生素(如维生素C(水果))的消费，同时减少脂肪、酒精、钠和糖(糖果)的消费。35我们首先验证了饮食反应性OTUs(根据其与整体NU-AGE FBDG评分的关系确定)，方法是检查其与不同食物成分的消费模式的关系(部分斯皮尔曼相关性考虑了年龄、体重指数、性别、国家和多用药作为混杂因素)。我们观察到，与FBDG依从性评分呈正相关的OTU标记物与纤维、维生素C、维生素D、植物蛋白和碳水化合物呈正相关，与MedDiet改变期间消耗减少的酒精、脂肪和糖成分呈负相关35(见在线补充图12)．因此，上述结果表明，标记物OTUs的相关性不仅与整体FBDG评分相关，而且与个体饮食成分的相关性也与NU-AGE MedDiet干预相关(即使考虑了所有与宿主相关的混杂因素，如年龄、体重指数、性别、国家和多药配药)。这证实了饮食标志物与饮食干预之间的关联。此外，每个饮食反应性OTUs与饮食依从性评分有特定程度的相关性，与饮食成分相关的特定趋势(见在线补充图12)．基于特定样本中饮食相关标记物OTUs与依从性评分以及丰度标记物OTUs的总体相关性，我们计算了特定样本的饮食调节微生物组指数(见方法部分;在线补充图2)．正如预期的那样，微生物组指数与总体依从性得分呈正相关，并且还获得了单个标记物OTUs的总体关联模式(即与纤维、碳水化合物、植物蛋白、维生素C、多不饱和脂肪酸呈正相关，与脂肪、酒精和糖呈负相关)，表明其作为与MedDiet消费相关的分类标记物的替代品的有效性(见在线补充图12,13；在线补充文本8)．
然后，我们检查了该指数与虚弱、认知功能和炎症(在整个队列中)的不同测量方法的关联，将坚持得分作为混杂因素。11个与改善认知、减少虚弱和炎症相关的指标中的10个可以重现。我们还观察到与炎症相关细胞因子白细胞介素(IL)-2和巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1b有额外的负相关，与语言流利性有正相关(图4)．这些结果表明，饮食调节的微生物组成分与虚弱、炎症和认知功能相关，与坚持得分无关(即，这些不是与坚持饮食相关的间接后果)。我们之前已经证明，这些关联在不同国家是稳定的(图3 b)．接下来，我们检查了混杂因素(如年龄、体重指数、性别、疾病病理生理学和药物摄入)对饮食-分类组关联程度的影响。研究观察到，患有多种疾病的个体，特别是糖尿病、心脏病发作和炎症性疾病的个体，与未患病的对照组相比，微生物组得分显著降低(癌症得分较低，但略有显著性)(见在线补充图14A-E；在线补充文本9；在线补充表6)．然而，微生物组指数与10个炎症标志物和虚弱指数中的7个的关联模式(在图4)在很大程度上保持不变，即使考虑了所有混杂因素，包括年龄、体重指数、性别、多重用药和不同的疾病病理生理学(见在线补充文本9；在线补充图15)．
MedDiet微生物组指数与虚弱程度降低、认知功能改善和炎症减少相关，与依从性评分无关。将依从性评分作为混杂因素考虑在内后，小提琴图显示了虚弱、认知功能和炎症标志物水平的不同测量与meddiet调节的微生物组指数之间的关联(部分斯皮尔曼相关性)。x轴表示斯皮尔曼rho值，y轴表示p值的−log(以10为底)。大多数负相关的测度被认为是在图的最左边，最正相关的测度被认为是在图的最右边。点根据所获得的关联的显著性进行着色(红色表示与fdr校正p<0.1的关联，橙色表示与fdr校正p<0.2的关联)。MedDiet微生物组指数被观察到与减少虚弱、减少炎症和改善认知功能相关的几种措施相关，并且这种相关性与依从性评分无关。
即使就跨时间点的变化而言，虽然饮食依从性评分的变化与微生物组指数的变化显著相关，但微生物组指数的变化与认知功能、身体健康的改善呈正相关，与hsCRP等炎症标志物呈负相关(见在线补充文本10；在线补充图16)．微生物组指数的阳性变化也与抗炎细胞因子IL-10水平的阳性变化和hsCRP与抗炎细胞因子水平的比值的负相关，进一步表明饮食相关微生物组指数与炎症细胞因子水平的负相关(见在线补充图16C而且在线补充文本10)．
饮食调节的微生物组变化对健康状况的积极影响可能是由特定的微生物代谢物驱动的。鉴于无法获得个体的粪便代谢组学数据，我们使用相应的16S物种组成谱预测了肠道微生物组的功能代谢谱(见方法部分)。将这些预测代谢谱丰度的跨时间点变化与微生物组指数变化相关联，确定了整个微生物组响应格局的巨大差异(见在线补充图17)．积极的微生物组变化与纤维相关的非淀粉多糖的微生物消费量的增加有关(可能表明地中海饮食的变化)。相反，与微生物单糖摄入量的增加相关的是负变化。微生物组的阴性反应还伴随着微生物对胆汁酸的牛磺酸和糖衍生物(如牛磺胆酸盐或甘鹅去氧胆酸盐)通过胆酸盐和鹅去氧胆酸盐的次级胆汁酸(石胆酸盐，脱氧胆酸盐)的消费量的预测增加(见在线补充图18A)．胆汁酸失调与不同的疾病状况有关，47具体来说，石胆酸和脱氧胆酸产量的增加与结直肠癌有关。48相反，支链脂肪酸(BCFAs)和SCFAs的增加与积极的微生物组反应有关。SCFAs与宿主健康的正相关是公认的。49之前的研究测量了与摄入MedDiet相关的代谢组学变化，也发现了类似的SCFA水平增加，10 50以及一个完全相似的联系，其中meddiet类饮食调节(增加纤维摄入量和减少脂肪摄入量)被观察到与粪便中短链脂肪酸水平呈正相关，与粪便次生胆汁酸呈负相关。51 52此外，在目前的研究中，我们获得了意大利和波兰人群中胆酸(CA)、糖鹅去氧胆酸(GDCDA)和鹅去氧胆酸(CDCA)血浆水平的测量数据。对于GCDCA和CDCA，将这些胆汁酸的血浆水平与饮食相关标记的丰度相关联，揭示了与饮食阴性OTUs相比，饮食阳性OTUs与GCDCA水平显著正相关，与CDCA水平显著负相关的趋势(在线补充图18B)．通过根据GCDCA/CDCA比值将这部分个体分组为三个梯队，我们观察到，GCDCA/CDCA比值增加的个体，其饮食相关微生物组指数(在线补充图18C)．这些结果证实了预测的代谢产物谱，其中饮食相关微生物组指数增加的个体预计GDCDA转化为CDCA的微生物量会减少(随后转化为石胆酸(LCA)和脱氧胆酸(DCA))，从而导致更高的GDCDA/CDCA水平。因此，我们检测到的一些关键的全局变化(胆汁酸和SCFA水平)，以及我们预测的与饮食相关的微生物组反应有关的变化，已在多项研究和血浆水平分析的文献中报道。唯一矛盾的趋势是CA水平，观察到的模式与预期相反。然而，这可能是因为测量的是血清样本(与粪便水平相反)，而CA/CDCA是由肝脏和微生物群产生的在线补充图18C)．
微生物组阴性反应还与其他有害代谢物有关，如对甲酚、乙醇和二氧化碳，其相对过量生产与结直肠癌、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝、细胞毒性和小肠细菌过度生长有关。53-57值得注意的是，在基线时，饮食相关微生物组指数被观察到与多种疾病呈负相关，包括高血压、糖尿病和癌症(在线补充图14)．因此，尽管推断而不是测量，数据表明，与积极的微生物组反应相关的代谢变化有利于影响宿主的健康。
饮食阳性OTUs是肠道微生物群落中的关键物种
最后，我们评估了饮食响应类群在整体微生物群落结构中的作用，由Reboot方法定义的网络表示(见方法部分)。30.共现网络提供了这些节点之间的节点和边(相互连接的线)的表示，其中节点表示分类群(在本例中为OTUs)，节点之间的边表示它们之间的显著共现关系(在提供的观测数据集或样本中)。该类群在共现网络中的位置表明该类群在群落稳定性中的相对重要性。我们首先获得了两个队列中所有样本跨时间点的共现网络。共现网络的主要组成部分是类群的聚集，其他类群充当相互连接的枢纽。然而，大多数正膳食分类群和负膳食分类群的定位有显著差异。饮食阳性分类群要么位于网络枢纽的中心，要么作为主要子节点(图5一个)．这表明了这些分类群在肠道群落结构中的中心地位，这种现象被称为“关键物种”。58相比之下，大多数饮食阴性分类群被放置在网络的外围。我们通过计算网络中每个分类单元的两个中心性度量来探讨这一观察结果:“度中心性”，即连接到给定节点的节点数量，以及“中间中心性”，即连接经过给定节点的任意两个节点的路径数量。饮食阳性类群的中间中心性显著高于饮食阴性类群或非相关标记(图5 b, C)．我们在每个不同的国家以及增加饮食依从性的重叠样本窗口内重新构建了网络(参见在线补充图19；在线补充图20；在线补充图21A)．尽管个体网络的整体结构存在重大差异，但分类群的放置模式及其在肠道微生物网络中的相对重要性在各个国家都是不变的。无论国籍和个体的饮食依从性如何，饮食阳性类群具有显著较高的中心性测度。正如预期的那样，饮食阳性和饮食阴性类群之间也存在不同的相互作用模式，特别是关于iBBiG识别的与虚弱相关的模块C，它与饮食阳性类群具有负共现倾向(图5 d)．有趣的是，随着饮食坚持的增加，共现倾向的强度明显变得更加消极(图5 e)．这在任何其他分类模块中都没有观察到(参见在线补充图21B)．
在微生物群网络中，对地中海饮食干预有积极反应的细菌类群占据了外围脆弱相关类群的关键相互作用节点。(A)操作分类单元(OTU)共现网络在时间点和队列中获得的所有样本，其中饮食阳性、饮食阴性和不相关OTU分别用绿色、红色和灰色表示。该网络显示了饮食阳性和饮食阴性标记物(或OTUs)的两个不同特征。虽然饮食阴性标记(除少数例外)被观察到作为网络中的外围节点出现，但饮食阳性标记大多作为中心连接的枢纽节点或枢纽之间的互连节点，表明它们对微生物组的中心地位。这也反映在(B)和(C)分别以箱形图显示的程度和中间中心性度量的比较中。(D)饮食阳性和饮食阴性otu与属于不同迭代二元双聚类基因集(iBBiG)模块的otu之间的相对共现倾向(计算为正边数与负边数的对数比)。我们观察到，特别是在与虚弱相关的长宿样模块C中，虽然饮食阴性标记显示出正共现，但饮食阳性标记显示出负相关，进一步表明对饮食有积极反应的类群与与虚弱相关的类群存在负相关。(E)通过为样本W1-W5的五个重叠窗口建立网络进一步研究了负相关性(见方法部分)，增加了对饮食的坚持。膳食阳性和模块C之间的相对共现倾向在网络中获得的重叠窗口的样本，增加对饮食的坚持。随着坚持饮食的增加，饮食阳性otu和属于模块C的otu之间的相对共现倾向变得越来越消极。 The p values of the significance of association are indicated as ****p<0.0001, ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05.
讨论
目前的结果提供了摄取NU-AGE MedDiet对微生物组和随后对老年人健康生物标志物的影响的系统观点。当前研究面临的一个重大挑战是五个国家个体之间微生物组的高度可变性，导致低信噪比，这意味着与元数据关联的分类信号较弱。使用传统方法进行分析是有用的，并提供了统计严谨性，即使自变量的假设并不能真实反映微生物群中的群落结构。然而，由于个体之间微生物群结构配置的多样性和差异性，再加上饮食在已建立的肠道微生物群群落中超过一年生命的影响相对较小，以及其他方面，如对社区居住个体的饮食测量的主观性质，以及饮食测量准确测量实际饮食变化的假设，传统的统计方法无法识别与遵循MedDiet在统计学上显著降低多样性损失相关的分类群。为了建立饮食响应分类群并生成饮食相关微生物组指数，我们应用了一种新的免单交叉验证机器学习方法，以良好的准确性预测每个人的依从性评分，并使用这些预测模型来探测和识别最能预测MedDiet依从性增加的特定分类信号。
我们观察到，增加对MedDiet的坚持可以调节肠道微生物群的特定成分，这些成分与降低虚弱风险、改善认知功能和减少炎症状态有关。由于上述原因，一些饮食调节的微生物组标记物的这些关联只能在相对较弱的阈值(rho <−0.09和rho >0.07, fdr校正p值<0.2)下观察到。这使得可视化和重新检查最具预测性的otu成为可能。然而，引人注目的观察结果是饮食调节的微生物组标记物与衰老的生物学标记物之间的一致性(与国籍无关)。单一样本特异性微生物组指数的制定和计算进一步阐明了这些关联。对于单个样本，该指数提供了饮食反应标记丰度模式的定量总结(该值越高，饮食阳性类群的丰度越高，反之亦然)，从而解决了与单个标记相关的样本特异性变异性。我们发现，它们不仅与饮食依从性相关，而且始终与虚弱和炎症标志物相关，从而证实了它们对健康维护的重要性，而不受年龄、体重指数和性别等其他人体测量混杂因素的影响。事实上，坚持得分与虚弱之间明显缺乏直接联系，这进一步暗示了个体对饮食的反应可能是由微生物组的变化介导的。除了这些联系，饮食阳性标记在肠道微生物组中的关键性质在多个民族中仍然非常稳定。这些饮食阳性标记的关键属性为所谓的安娜卡列尼娜原则提供了支持59该理论认为健康个体的微生物群落是相似的，而不健康个体的微生物群落各有不同。通过保护肠道微生物群落的“核心”，坚持这种饮食可以促进微生物群落保持稳定的群落状态，提供弹性，并防止不健康受试者出现其他状态的变化。
这些微生物类群对宿主健康的积极影响通过预测代谢物谱进一步表明，增加对饮食的坚持，特别选择了富含SCFAs/BCFAs生产的类群，同时选择了与胆汁酸调节失调和产生有害代谢物(如丙酮、对甲酚、乙醇和二氧化碳)相关的类群。虽然这是一种硅内预测，但先前已经显示，随着MedDiet的消耗(或MedDiet的特定成分)，SCFA的产生增加。10百分比较Pagliai的研究等该研究比较了MedDiet和素食饮食中微生物组和代谢组的变化，报告了碳水化合物摄入量(MedDiet中增加)与粪便中SCFA丁酸盐水平的显著正相关，而脂质和脂肪摄入量(MedDiet中减少)与SCFA丙酸和乙酸水平的显著负相关。SCFAs与炎症因子IL-17水平也呈负相关。50尽管Pagliai的研究等在MedDiet中观察到BCFA水平没有显著差异(与我们目前研究中进行的硅内预测代谢物分析相反)，还观察到BCFA水平与脂肪摄入量呈负相关(与我们目前的发现一致)。meddiet相关微生物组调节、SCFA产生和致癌次生胆汁酸产生之间的联系与之前两项针对非裔美国人和农村非洲人的研究结果完全一致。51 52有趣的是，在次级胆汁酸生产领域，而粪便代谢组的结果来自O 'Keefe的研究等血浆代谢物水平(在当前的研究中)证实了预测的关于CA和致癌次生胆汁酸DCA和LCA的代谢物变化(尽管血浆代谢物水平预计不能准确反映粪便代谢组)。因此，从这些研究中获得的结果在很大程度上相互补充，并与我们目前的发现产生共鸣，而其他潜在有害代谢物产生的预测下调提供了一个候选化合物的知情列表，可以在未来的研究中通过靶向代谢组学分析进一步验证。
饮食、微生物群与宿主健康的相互作用是一个复杂的现象，受多种因素的影响。它也可能是一个由特定的机械规则规定的多步骤过程。虽然这项研究的结果阐明了这种三种相互作用的一些规则，但年龄、体重指数、疾病状况和初始饮食模式等几个因素可能在决定这些相互作用的成功程度方面发挥关键作用。有趣的是，Meslier的研究证明，通过微生物组介导的MedDiet干预的有益效果并不局限于老年受试者等60(本卷;co-submitted来肠道这表明，对肥胖受试者进行类似的干预，导致了与能量摄入无关的肠道微生物组和代谢组的多种健康相关变化。尽管有这种理论和实践上的强化，但在许多国家，通过维持长期的MedDiet(或补充特定成分)来促进老年人健康的策略可能不切实际，成本高昂，或者在物流上不可能实现，因为这些成分既不是主食，也不是全年都有。对于一些有牙齿、唾液分泌、吞咽困难或肠易激综合症等问题的老年人来说，采用MedDiet可能不是一个现实的选择。我们在这里对与健康相关的meddiet响应分类群的定义，加上我们最近在2500名受试者的大型元组中发现的与健康老龄化相关的分类群，61提供了一个候选分类群的简短列表，用于开发作为活性生物治疗剂的直接给药给老年受试者，以减少衰弱的发作。
参考文献
补充材料
脚注
TSG、SR、IBJ和AS贡献均等。
贡献者TSG, IBJ, POT, CF和AS构想并设计了分析。MN, AS, MC, EG, AJ, MC, ST, EGZ, GDAH, CE, NM, CMB, EP-G, AM, JK, BP, BC, MN, MM-F等收集和/或提供数据。TSG、IBJ和SR进行了分析。TSG, IBJ和POT在SR, AS, PB, EGZ和WMDeV的协助下完成了论文。WMDeV、SF-T、AC、PB、CF、POT等对分析结果和稿件进行了审阅。
资金作者的部分资金由爱尔兰科学基金会(APC/SFI/12/RC/2273)以研究中心的形式资助，APC微生物组爱尔兰。IBJ得到了爱尔兰科学基金会的资助(13/SIRG/2128)。NU-AGE项目由欧盟第七框架计划资助，资助协议编号为no。266 486(“NU-AGE:解决欧洲老年人口对健康老龄化的具体需求的新饮食战略”)。
相互竞争的利益没有宣布。
患者发表同意书不是必需的。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。
数据可用性声明如有合理要求，可提供资料。与当前研究相对应的大部分结果都被收录在文章中或作为补充资料上传。其他数据可根据作者要求提供。