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摘要
背景对溃疡性结肠炎的组织学活性的评价需要重现性，但很少进行测试。这在临床和临床试验中都是有用的。
目的制定可重复的标准，有效评估急性炎症(活动性)和慢性，并在观察者间变异性研究中评估这些特征。
方法研究人员开发了一个炎症分级系统，可在每个分级中进行微调。评分为:0分，仅结构变化;1、慢性炎症;2、固有层中性粒细胞;3、上皮细胞中性粒细胞;4、地下室破坏;5、糜烂或溃疡。来自远端溃疡性结肠炎患者的内镜下炎症和非炎症黏膜的99个苏木精-伊红切片由三名病理学家在不了解临床状况的情况下独立进行了两个独立的阅读。使用kappa统计数据两两比较观察者之间的一致性。
结果最初，观察者之间的kappa值为0.20、0.42和0.26，这太低而没有价值。在开发了每种标准的半定量图示量表后，kappa值提高到0.62、0.70和0.59。对于由上皮细胞间中性粒细胞定义的活性，kappa值分别为0.903、1.000和0.907。在内窥镜下正常的64%的样本和内窥镜下炎症组织的66%的样本达到完全一致。上皮中的中性粒细胞与隐窝破坏和溃疡的存在相关。
结论为溃疡性结肠炎开发了一个组织活性系统，显示出良好的重现性，并与它补充的内镜分级系统适度一致。它在临床和临床试验中都有潜在的价值。
- 溃疡性结肠炎
- 活组织检查
- 炎症
- 评分系统
本文中使用的缩写
- 炎症性肠病
- 炎症性肠病
- 加州大学
- 溃疡性结肠炎
来自Altmetric.com的统计
特发性炎症性肠病(IBD)的诊断通常基于临床、放射学、内窥镜和显微镜标准的结合。用于溃疡性结肠炎(UC)诊断的显微镜标准的可重复性已经在几项研究中进行了检验。1 - 4总的来说，区分正常组织和IBD、UC和克罗恩病的最重要特征是结构异常和炎症改变。5 - 8隐窝结构和基底浆细胞变化对IBD和非IBD有很好的预测诊断价值。8 - 10UC是一种慢性复发性疾病。因此，不仅要作出正确的诊断，而且要评估疾病的活动性。这是在临床参数的帮助下完成的，有时结合到临床指标，并使用内窥镜检查，通常辅以活检。研究表明，治疗可以改变微观诊断特征和活动迹象。11 - 14号尽管组织活性在患者的日常管理中可能并不重要，这往往取决于患者的总体健康状况，但它在药物治疗的选择和药物治疗的监测中可能很重要，在旨在显示治疗效益的任何研究的设计和评估中可能特别重要。残留镜下急性炎症的患者更容易复发。15，16
不同的组织学评分系统被设计用于UC疾病活动的评估。14，17日至19日通常它们结合了慢性和更急性的变化，上皮和炎症特征。20.显微镜下的活性是基于中性粒细胞的存在，或定义为表面和隐窝上皮的明确损伤，通常与中性粒细胞有关。21白细胞扫描的研究支持使用中性粒细胞作为疾病活度的指标。22，23组织学上，中性粒细胞似乎是引起上皮损伤的效应细胞。24组织学评分系统被用于许多临床药物试验，但关于评分的可重复性以及糜烂和溃疡发生与上皮内中性粒细胞存在之间的可能关系的数据有限。16，17因此，我们的研究目的是评估基于不同活动等级的UC显微评分系统，并评估其可重复性。该评分系统旨在帮助评估UC治疗的有效性。
材料和方法
在文献搜索了用于诊断和评估UC活性的不同特征和可用的不同评分系统后，提出了一个评估进展性炎症和活性的新的分类和分级系统(表1)．潜在的假设是，不同的主要分级和基础分级是渐进的，并与疾病严重程度或活动性的增加有关。
此外，中性粒细胞在上皮细胞之间的位置分别评分为3级。确定了7种可能的组合(图1)．目的是检查中性粒细胞的位置与糜烂、溃疡和隐窝破坏的发生之间的关系。如果存在这样的关系，中性粒细胞的位置将是重要的医疗评估。此外，还评价了切片和样品定位的技术质量及其对精确显微分析的影响。
上皮内中性粒细胞位置的不同组合。确定了七种可能的组合。
明确了不同的主要等级和路基:0.0级表示无异常;0.1级表示孤立的结构异常，如一个明显异常的隐窝或不适当的间距;当病变严重且弥漫性时使用0.3级;0.2级为单个病变与弥漫性病变之间的异常。固有层浸润的慢性炎症增加提示1级评分。路基1.1轻度但明显增加，路基1.3慢性炎症明显增加。在固有层内或上皮细胞之间存在粒细胞的评分为2级及以上。路基2 b。1was scored when one or more neutrophils were present in the lamina propria. For the assessment of subgrades, the worst area of the biopsy, and not the average aspect, was used. A series of photographs was constructed to define the upper and lower limits of each subgrade (fig2)．
显微镜照片说明不同的等级，以及上下边界。(A) 0.3级:切片质量良好，结构严重弥漫性改变，但固有层细胞浸润强度未增加。(B) 3.3级:50%的隐窝>中中性粒细胞浸润隐窝上皮(箭头表示隐窝管腔中性粒细胞)。(C) 5.1级:表面被衰减细胞覆盖，表现为恢复上皮的特征。此外，还有严重的邻近炎症。(D) 5.3级:由于表面上皮细胞的丢失，相邻的恢复上皮细胞，以及严重的炎症(苏木精-伊红)，可见明显的侵蚀。
研究结果用三种不同的方法进行了分析。在第一次分析中，根据六个不同的主要等级对活动进行了评价。在第二次分析中，0级和1级组合在一组，其他组在第二组。在第三次分析中，主要等级0、1、2A和2B被合并为一组，等级3、4和5被合并为第二组。两组之间的分界线是在第二次分析中固有层中或在第三次分析中上皮细胞之间存在中性粒细胞。不同分析的目的是审查简单和较复杂的评分系统之间可能存在的差异。
总共检查了99个从确诊的UC远端患者的活检中获得的苏木精-伊红染色切片。选择所有患者进行对照临床试验。活检是在内镜下炎症(n=68)和非炎症(n=31)的黏膜上进行的。在66个案例中，可以从同一区域获得一个以上的样本。进行了两次单独的读数。在第一次阅读中，三个病理学家(KG, RR, AÖ)对每个活检组织的三个不同的半切片(5 μm)进行了评估。在第二阶段，同样的部分由所有三个病理学家检查，以尽量减少由于不同部分之间的差异造成的任何影响。两个读数都是独立进行的，不了解内窥镜状态。在第一次阅读之后，分析了与分节和使用半分节有关的分歧领域。通过在多头显微镜上重新检查载玻片，确定并澄清了可能的错误来源和分歧区域。 The grading scale was adapted and refined. In particular the boundaries within each grade between different degrees of severity and the features allowing identification of a precise lesion such as crypt destruction and erosion were discussed and defined more precisely.
二读之后，对数据进行统计分析，并重新审查幻灯片，以查明分歧的来源。使用kappa统计数据两两比较观察者之间的总体一致性。kappa值⩽0.5被认为是“差”，0.51-0.6被认为是“中等”，0.61-0.8被认为是“好”，>0.8被认为是“优秀”。此外，我们还研究了镜下和内窥镜检查结果之间的关系，并计算了上皮中中性粒细胞不同位置的p值。
结果
最初的阅读
第一次阅读的结果总结在表中2．通过分析观察者之间的差异，可以区分四种不同的类别:(a)观察者错误——即一个或多个观察者遗漏了一个特征;(b)由于使用三个不同的半柱截面而产生的误差;(c)由于section的质量而产生的差异;(d)因解释的不同而产生的分歧。
经过讨论，调整了等级比例尺，并对路基之间的边界进行了更明确的定义。为了排除因使用不同切片而产生的差异，我们决定在二读中只使用一个连续切片，由所有三位病理学家独立阅读。为了评估不同程度的严重程度，决定构建一系列照片，显示给定特征的上下限，而不是使用某个严重程度的典型例子，因为这是解释上存在许多差异的原因之一。最后，还决定对样品的质量进行评估，以确定技术质量是否对分析有重要影响。
二读
二读的结果也总结在表中2．主要0级和5级的一致性非常好。三名观察员检查的65%的优质样本(n=86)对最终评分(主要等级和辅助等级)完全一致。在内镜下正常组织的活检中，64%的样本最终得分完全一致，而在内镜下炎症组织的活检中，66%的病例完全一致(n=58)(图)3.，4)．18例(21%)发现一名观察员与另外两名观察员之间有一个主要职等的差异，9例发现两个职等的差异。在两种情况中发现了很大的差异，其中一种情况中有两名观察员将其评为5级，另一种情况中有两名观察员将其评为5级和3级。
评分系统的不同等级的观察者间可变性。三名观察员(A、B和C)的平均分显示在第二次阅读中。只包括来自内窥镜相关区域的活检。3、4、5级的观察员认同度较高。
内窥镜下健康组织活检评分系统不同等级的观察者间变异性。三名观察员(A、B和C)的平均分显示在第二次阅读中。对于3年级和4年级的学生来说，协议非常好。
三名鉴定员均检出31个样本质量优良，而36个样本质量不达标，22个样本质量较差(其中13个样本因质量较差而未由三名鉴定员检出)。综合得分中，差样的kappa值分别为0.489、0.434、0.670，好样的kappa值分别为0.666、0.706、0.510。
有粒细胞组和无粒细胞组之间的差异极好，kappa值分别为0.815、0.945和0.869。对于活性的诊断，通过存在明显的表面或隐窝上皮损伤以及中性粒细胞(主要等级3、4和5)来定义，也很好，kappa值为0.903、1.000和0.907。
对于内镜下未发炎组织的优质样本(n=28)，病理学家与内镜一致的kappa值分别为0.613、0.545和0.386，表明一致程度中等。病理学家对这些样本的平均评分低于2(固有层中存在粒细胞)或更高。平均值分别为1.07、1.13和1.07。
对于内镜下炎症组织中获得的质量良好的标本，病理与内镜一致性的kappa值分别为0.648、0.808和0.570，为中等至极好的一致性。每个病理学家对炎症组织的平均评分分别为3.25、2.75和3.00。所有评估者的炎症组织内镜评分与5级、3级和2B级(p<0.02)相关性良好。2A级，仅存在于固有层的嗜酸性粒细胞，也与每位观察者的内镜评分相关(p<0.11)。然而，这并不意味着内镜评分与组织学结果完全一致。3例(4%)内镜下炎症组织表现正常，在内镜下未炎症组织中，13/28例(46%)镜下活性炎症仍存在。11/28例(39%)无异常。其余的三个观察者中至少有一个观察到单个核细胞的结构变化或强度增加。
不同主要等级(0、1、2A、2B、3、4、5)的Kappa值如图所示5．数值超过0.4,1、3和4级通常超过0.5。分析路基内部差异和变异性的结果(例如，1.1v1．2v1.3)的主要级别0至4见表3.．对于主要的4级和5级，66%的病例对有无隐窝破坏或类型达成完全一致，44%的病例对有无糜烂或溃疡的存在或类型达成完全一致。在17%的病例中，隐窝破坏有一个等级差异，但只有14%的病例认为病变不存在。22%的病例表现为糜烂，其中一名观察者并未识别出病变。
直肠活检中溃疡性结肠炎活性评估的观察者间变异性评分系统不同等级的Kappa值显示了三对观察者(A:B, A:C，和B:C)。两对观察者在没有相关炎症变化(即静止性结肠炎)的情况下，对结构变化的评估一致性较差。
不一致是由于观察者的错误，解释的错误，或两者的结合。当不考虑中性粒细胞的位置时，观察者误差的总数占所有观测值的4.67%，当考虑这一项时，观察者误差的总数占所有观测值的3.06%。在所有主要等级中都发现了观察者误差:0级为10%;一级为2%;2A级8%;2B级6%;3级1%;四年级和五年级只有3%。
中性粒细胞在上皮中的位置与隐窝破坏、糜烂和溃疡发生之间的相关性
中性粒细胞在上皮中的位置(主要3级)与主要4级(隐窝破坏)和5级(糜烂)的相关性显示，当上皮中存在中性粒细胞时，隐窝破坏和糜烂明显更常见。对于提示隐窝破坏的主要4级，病灶与隐窝上皮中性粒细胞之间的p值(位置2+3+6+7)v1+4+5)分别为0.18、0.026和0.062。4级，隐窝破坏和隐窝脓肿(位置4+5+6+7)v1+2+3)， p值分别为0.0002、0.015和0.0001。这表明隐窝脓肿的存在意味着隐窝破坏。对于5级(糜烂或溃疡)，与表面上皮中性粒细胞(位置1+3+5+7)的相关性v2+4+6)， p值分别为0.0045、0.16和0.0057。这意味着上皮细胞中中性粒细胞的存在暗示着糜烂或溃疡的可能性(表4)．
讨论
总体而言，对于56/86份质量良好或可接受的样本(65%)，所有三位观察员对最终得分达成了完全一致的意见。从内镜下正常组织中获得的28个样本(1.07,1.13,1.07)和从内镜下炎症组织中获得的58个样本(3.25,2.75,3.00)的平均评分是相似的。Kappa值分别为0.62、0.70和0.59，表明一致性中等至良好。在3.5%的病例中发现了观察者的错误。二读之后的改进表明了精确定义的重要性。
技术质量和定位提高了微观评估和最终分级。不一致的部分原因是存在多个样本，并且在比较样本时病变不连续性。病变的不连续已被报道为UC，准确评估显微镜下的疾病活动性可能需要分析多个活检样本。12，13由于只有一个综合了主要等级和路基等级的最终评分，当病变不连续时，一些观察者给出了平均评分，而另一些则给出了最差的评分。最后决定采用最差的分数。
当班级或成绩崩溃时，Kappa的价值会提高，一致性会变得非常好。当疾病活动度由中性粒细胞明显损伤上皮来定义时，kappa值分别为0.903、1.000和0.907。这证实了早期的研究，表明中性粒细胞可以重复评估，观察者之间的一致性有利于中性粒细胞相关的组织学特征。1，14，17因此，正如预期的那样，一个简单的评分系统的再现性很高。然而，本研究的目的是构建一个更精细的评分系统，使我们能够更精确地定义疾病活动性，并最终指导长期治疗;我们的研究显示，对于这样一个复杂的系统，我们有中等到极好的一致性。
在过去，一些研究在比较UC的内镜评分和组织学时发现了不同的结果。20.，25在目前的研究中，内镜检查与组织学检查的相关性通常是良好的内镜下炎症黏膜。内窥镜下无炎症的黏膜相关性较差。这并不奇怪，因为内窥镜和组织学不能评估相同的特征。局灶性活动性炎症很可能被内窥镜和活组织检查遗漏，因此增加了炎症存在的额外维度。因此，使用内窥镜和组织学来评估疾病的活动性和程度似乎是合适的。在没有内镜下病变的情况下，持续的显微镜病变可能表明复发的可能性增加。15，16
对第一次阅读后出现分歧的区域的分析表明，只有少数几张玻片中，固有层中的中性粒细胞是唯一的活动迹象，而与中性粒细胞浸润表面或隐窝上皮无关。由于一个或多个病理学家未能检测到病变，或由于内皮通道内的中性粒细胞的解释是正常的或异常的。观察员误差减少，但在第二次读后仍注意到。这主要是由于技术质量差，但在5个质量好的标本中，活检的最终分级受观察者误差的影响。
观察糜烂或溃疡的误差很小。分歧主要与对上皮真正侵蚀或人为剥离的不同解释有关。因此，在评估表格中包括恢复上皮细胞，定义为衰减(扁平或立方)表面上皮细胞，以提高对侵蚀的认识。添加邻近严重炎症，以尽可能排除其他潜在的浅表损伤原因。我们还包括了可能的侵蚀和局部剥离的类别。后一类的列入导致5/12个发现这种重大差异的案例的最终分数有两个等级的差异。因此，将这一步骤列入第5级可能并不合适。
一些口译问题在第一次阅读后没有得到解决。对固有层单核浸润的评价仍然是一个问题。在其他研究中也观察到了这一点。26已有研究表明，固有层细胞化是IBD的一个重要特征，但正常细胞固有层浸润的边界需要澄清和标准化。27，28对固有层中嗜酸性粒细胞的鉴定是另一个分歧来源，造成了8%的观察者错误。然而，一些文献资料表明嗜酸性粒细胞在CD和UC的发病机制中起重要作用。28 - 30因此，我们建议将嗜酸性粒细胞纳入评估IBD疾病活性的组织学评分系统中。
对于0级，只有22%的病例在第二次阅读后达到完全一致。在一读后也注意到类似的分歧。在分析之后，我们构建了一系列的摄影标准进行比较，这些标准不是代表一张普通的照片，而是不同类别之间的界限。二读的数据显示，分歧部分是由于观察员的错误，部分是由于解释的差异。在结构变化上的分歧主要是由于来自同一患者和同一区域的多个样本的可用性。章节的方向是另一个分歧的来源。双裂隐窝和隐窝基部和肌层粘膜之间的距离增加被作为主要标准，但这些特征不能充分评估横切面或切线切面。隐窝直径和隐窝间距的可变性显然是更难使用的参数。
中性粒细胞的位置与隐窝破坏、糜烂和溃疡的发生之间有良好的相关性。我们的数据证实上皮细胞间的中性粒细胞与上皮细胞损伤有关。表面上皮中的中性粒细胞与糜烂的发生有关。隐窝脓肿暗示隐窝破坏。因此，在连续的活组织检查中，上皮细胞中性粒细胞的减少或消失最有可能是疾病活动减少的迹象，并可能表明特定治疗的疗效。
总之，我们的评分系统具有足够的可重复性，在临床试验和临床活动的常规评估中可能有价值。技术素质，无论是从各科的质量还是从良好的方向来看，都可以提高报告的质量，因此受到大力鼓励。一些组织学特征，特别是结构异常，需要更准确的定义。嗜酸性粒细胞的存在必须包括在任何评估UC的分级系统中。上皮中中性粒细胞的存在与隐窝破坏、糜烂或溃疡等病变的发生密切相关。虽然内镜是诊断和评估疾病活动性的一个非常重要的工具，而且内镜和组织学之间有很好的相关性，但联合内镜和活检比单独内镜提供了更好的活动性指示，特别是在内镜下无炎症的黏膜。
致谢
这项研究得到了瑞典阿斯利康公司的资助。IOIBD病理学部分提供了预备讨论的机会。
本文中使用的缩写
- 炎症性肠病
- 炎症性肠病
- 加州大学
- 溃疡性结肠炎