条文本
PDF
摘要
背景与目的:C-myc过表达与恶性肿瘤有关，尽管到目前为止还没有在Barrett化生中进行过研究。我们试图确定c-myc在Barrett化生恶性进展中的表达，以及它是否可能由胃食管反流中的胆汁酸诱导。
方法:采用western blotting和实时聚合酶链式反应检测20例Barrett化生和20例食管腺癌标本中C-myc蛋白和mRNA水平。用脉冲刺激或持续暴露于胆汁酸去氧胆酸和鹅去氧胆酸刺激OE21、OE33、SW-480和TE-7细胞系，也评估了c-myc水平和增殖。
结果:与鳞癌、胃癌和十二指肠癌对照组相比，50%的Barrett化生和90%的食管腺癌样品中C-myc蛋白上调。巴雷特化生中的C-myc免疫定位显示离散的核定位，随着从低级别到高级别异常增生到腺癌的进展而变得更加弥散。连续胆汁酸和脉冲胆汁酸在pH值为4时均可诱导c-myc，在pH值为7时或单独使用酸化介质均无影响。脉冲胆汁酸处理诱导细胞增殖(p<0.05);相反，持续暴露导致增殖抑制(p<0.05)。
结论:我们发现c-myc随着Barrett化生的恶性进展而上调，并提示酸化的胆汁可能是诱导该癌基因的一种新因子。
- 原癌基因
- 巴雷特的化生
- 胆汁酸
- 胃食管反流病
- 脱氧胆酸
- 鹅去氧胆酸
- PCR，聚合酶链式反应
- Ct，周期阈值
- ESA，上皮细胞特异性抗原
数据来自Altmetric.com
在过去的三十年里，西方人群食管癌的发病率每年增长10%，而食管癌的发病率保持不变。1食道下部和胃食道交界处的腺癌现在是西方世界增长最快的癌症。1，2来自英国地区的最新癌症登记数据证实了食管癌发病率的上升，每10万男性中有12-18.7人患食管癌，3 -5现在腺癌的数量已经超过了鳞状细胞癌。5由于发病率迅速增加，这可能低估了目前的流行率。
Barrett食管是一种食管下上皮柱状化生，是已知发生食管腺癌的最强危险因素。据信，巴雷特化生在发展为腺癌之前由低到高级别的发育不良发展。6患有巴雷特食管的患者每年患这种癌症的风险约为0.5-2%，是一般人群的30-125倍。7Barrett食管与严重胃食管反流病(GORD)相关8但关于返流液中对食管上皮细胞有害的确切成分存在很大争议。胃酸性内容物反流显然与巴雷特化生有关，但越来越多的证据表明十二指肠液反流可能在恶性发展中起重要作用。在动物模型中，十二指肠内容物转向食管下段导致强效腺癌形成，9在人体研究中，十二指肠内容物的反流与食管损伤的严重程度增加有关。10，11这种回流液中的胆汁酸可能是至关重要的，其中脱氧胆酸(DCA)和鹅脱氧胆酸(CDCA)是回流液的常见成分，11在细胞培养模型中被广泛研究。
从巴雷特化生到腺癌的进展涉及关键细胞过程的失控，包括增殖、凋亡和细胞分化。12，13一般来说，这些过程受到许多因素的严格调控，包括原癌基因c-myc。在许多人类癌症中都观察到c-myc的失调，14包括胃和结肠，c-myc在瘤变中的作用进一步得到c-myc过表达转基因小鼠中癌症发病率增加的支持。15然而，c-myc在肿瘤发生中的作用是复杂的，其在细胞增殖、生长阻滞和凋亡中的确切作用取决于组织类型和环境。16编码c-myc的基因位于染色体8q23-24区，最近对巴雷特腺癌的研究已经确定染色体8q区是最常观察到的扩增区。17然而，到目前为止，还没有关于巴雷特腺癌中c-myc蛋白表达的全面研究报道。
因此，本研究的目的是确定良性巴雷特化生和食管腺癌中癌基因c-myc的表达和定位，并研究十二指肠-胃-食管反流液中存在的胆汁酸对其的诱导作用。
材料与方法
病人组织
western blotting取良性长段(≥3cm) Barrett化生20例和食管腺癌20例。匹配的食管鳞、胃底和十二指肠上皮活检组织作为对照。另外20例Barrett化生患者和20例食管腺癌患者的组织以及鳞状对照活检也被用于实时聚合酶链式反应(PCR)估计c-myc mRNA水平。组织学确认诊断进行了邻近的活检，从同一地点和在同一调查。巴雷特化生组的所有样本均来自无异常增生或腺癌宏观或组织学证据的患者。对于western blotting，活组织切片立即处理并在−20°C下存储。对于实时PCR，活检立即进行RNA提取。免疫组化方面，从研究前进行的大型石蜡组织档案和病理组织学确认中选取正常食管鳞状上皮(n=30)、正常十二指肠上皮(n=10)、正常胃底黏膜(n=10)、良性Barrett化生(n=30)、Barrett化生含低级别异常增生(n=10)、Barrett化生含高级别异常增生(n=10)、食管腺癌(n=30)切片。当地伦理委员会批准了这项研究。
细胞培养
食管癌(OE21)细胞系18食管腺癌(OE33)18会宗,19和结直肠癌(sw480)在培养基(Dulbecco 's modified Eagle 's培养基+ 10%小牛血清+100单位/ml青霉素和0.1 mg/ml链霉素)中维持。当汇合度达到70%时，对细胞系进行如下刺激:(1)pH为4的培养基;(2) pH为4、含100 μM DCA的培养基;(3)含100 μM DCA的pH为7的培养基;(4) pH为4、含100 μM CDCA的培养基;(5) pH为7、含100 μM CDCA的培养基。所有实验均使用中性pH生长介质中生长的细胞作为对照。细胞要么被连续刺激24小时，要么被脉冲1分钟，用生长介质清洗，然后在生长介质中培养3小时。所有实验均重复三次。选择胆汁酸DCA和CDCA是因为它们是回流液的常见成分11在细胞培养模型中被广泛研究。使用100 μM浓度，因为在我们的细胞培养模型系统中，这是一个生理浓度，也是诱导最大c-myc反应所需的最低胆汁酸浓度(结果未显示)。此外，选择1分钟作为刺激的时间间隔，因为这与平均反流发作相当。20.
细胞增殖
细胞增殖用CellTiter96 AQ进行评估ueousOne Solution Cell Proliferation Assay (Promega Corporation, Madison, Wisconsin, USA)，一种比色测定系统，用于测定增殖中活细胞的数量。这是根据制造商的说明进行的。简单地说,4×104将0.5 ml生长培养基中的细胞镀于24孔板的每孔中。24小时后按一定的处理方案处理细胞，100 μl的CellTiter96 AQueous在每个孔中加入一种溶液试剂，在37°C下孵育1小时，然后在490 nm处测量吸光度。以新鲜培养基为阴性对照。实验一式三次。
实时PCR
根据制造商说明书，使用Trizol试剂(Gibco, Paisley, UK)提取RNA。使用cDNA反转录试剂盒(Promega，根据制造商说明书)对新鲜制备的RNA (1 μg)进行反转录。所有反应均在实时PCR仪(PE7700 ABI Prism)上进行，以18S核糖体RNA作为内标(PE Biosystems, Roche, USA)。每个反应重复三次，在25 μl反应中包含900 nM c-myc特异性5 ' (TCAAGAGGTGCCACGTCTCC)和3 ' (TCTTGGCAGCAGGATAGTCCTT)引物，1× Mastermix (PE Biosystems)， 125 nM c-myc特异性探针(5 ' FAM-CAGCACAACTACGCAGCGCCTCC-TAMRA 3 ')， 50 nM 18S 5 '和3 '引物，200 nM 18S探针(5 ' VIC, 3 ' -TAMRA标记)和0.25 μl cDNA(相当于12.5 ng逆转录RNA)。阴性对照包括无cDNA的反应。循环阈值(Ct)为c-myc和18S内标的图形。基因表达归一化到18S，并用ΔCt值表示。对于每个样本，计算三个ΔCt值的平均值。对照与处理样品的基因表达比较，由处理样品的ΔCt值减去对照样品的ΔCt值得到ΔΔCt值，计算相对基因表达量为2−ΔΔCt．相对基因表达归一化至1.0(100%)的对照。所有实验均重复三次。将巴雷特粘膜或腺癌活检样本中的C-myc水平与匹配的正常鳞状上皮对照进行比较，归一化为1。
西方墨点法
如前所述，对内镜活检和刺激后建立的细胞株进行western blotting，21抗c-myc单克隆抗体(Santa Cruz, California, USA;1:1000)和上皮细胞特异性抗原(ESA) (Novocastra实验室，英国1:25)，后者用于上皮蛋白负荷的正常化。HeLa和Cos细胞裂解液分别作为阳性和阴性对照。巴雷特化生和腺癌样本(ESA已归一化)的c-myc免疫反应阳性，使用NIH Image 1.62软件进行密度测定。
免疫组织化学
如前所述，采用链霉亲和素-生物素间接免疫过氧化物酶法进行免疫组化，21单克隆c-myc抗体(Santa Cruz 1:500)。有无一抗的结肠癌切片分别作为阳性和阴性对照。
免疫荧光
将细胞固定在甲醇/丙酮中，封闭(20%山羊血清在1%牛血清白蛋白/磷酸盐缓冲盐水中)，并与单克隆c-myc抗体(Santa Cruz 1:50)孵育1小时，然后用FITC山羊抗鼠标记(Jackson免疫研究公司，West Grove, Pennsylvania, USA;1:50 0)。细胞洗净，在4 '，6-二氨基-3-苯基吲哚二盐酸水合物(1:10 000)中孵育1分钟，然后显像。阴性对照为一抗遗漏。
统计数据
c-myc蛋白和mRNA表达实验采用Fisher精确检验，脉冲/连续刺激细胞与非刺激细胞增殖实验采用Mann-Whitney U检验，western blots密度数据分析采用Mann-Whitney U检验。采用SPSS 9.0版本(SPSS Inc，芝加哥，美国)进行双侧检验，p<0.05为显著性。
结果
c-myc在Barrett化生和食管腺癌中的表达
c-myc的Western blotting检测显示，在任何配对的食管鳞状上皮、胃或十二指肠对照活检中均未发现c-myc蛋白表达。C-myc在18/20(90%)腺癌和10/20 (50%)Barrett化生中表达(p<0.05)。图1A是c-myc蛋白表达的代表性western blot，表明与Barrett化生相比，食管腺癌中c-myc蛋白表达更高。此外，所有c-myc阳性的样本都进行了密度测定，与腺癌相比，Barrett化生中c-myc的平均表达水平如图1B所示。
(A) c-myc蛋白Western blot显示，与Barrett化生(B)相比，食管腺癌(A)中c-myc蛋白表达较高，而正常食管鳞状上皮(S)、胃(G)或十二指肠(D)样本中c-myc蛋白表达不高。上皮细胞特异性抗原(ESA)显示上皮蛋白负荷相同。HeLa和Cos细胞裂解液分别作为阳性(+)和阴性(−)对照。(B)通过密度扫描定量c-myc的western blot。所有20例Barrett’s和20例腺癌样本最初使用ESA进行上皮负荷相等的正常化，随后进行c-myc western blot。所有c-myc阳性样本(Barrett化生组10/20，腺癌组18/20)随后进行密度测定，数据以平均(±2 SEM)像元数表示。*腺癌组与Barrett化生组差异有统计学意义(p<0.05)。
通过实时PCR，与配对对照组织相比，33%的Barrett化生病例(p<0.05)和84%的食管腺癌病例(p<0.05) c-myc mRNA表达上调。在显示c-myc上调的病例中，Barrett组的中位数翻倍增加为2.37(范围1.29-80)，腺癌组的中位数翻倍增加为2.44(范围1.24-82)。
c-myc的免疫组化分析显示胃黏膜(图2F)和十二指肠黏膜(结果未显示)无免疫反应性，仅在正常鳞状上皮基底层有极低的核c-myc表达(图2A)。在所有巴雷特化生病例中观察到c-myc核表达，比正常鳞状上皮更强烈(图2B)。所有病例均未见细胞质免疫反应。然而，在低级别和高级别发育不良中，c-myc不仅在细胞核中表达，而且有弥漫性细胞质染色的证据(图2C)。这种细胞质免疫反应性在所有腺癌病例中进一步增强(图2D, 2E)。
Barrett食管恶性进展中的c-myc免疫定位(×40目标)，在鳞状上皮基底层(A)和良性化生(B)(用*表示)中显示局部核染色，在发育不良(B)(用+表示)中变为细胞质。(C)高度发育不良显示核和细胞质C -myc免疫反应性，在腺癌中进一步加重(D)。低倍率腺癌(E) (×25目标)。胃粘膜未观察到c-myc免疫反应性(F)。
胆汁酸持续刺激诱导c-myc表达
为了研究GORD临床环境下c-myc的诱导，我们研究了酸和胆汁酸(在生理浓度下)的影响11)使用材料和方法中描述的方案建立细胞培养。来自人类食管腺癌的TE-7细胞系被用于初步研究。在pH值为4的DCA或pH值仅为4的CDCA连续刺激的细胞中观察到c-myc的诱导。在pH值为7的DCA或CDCA，或单独酸化培养基，未能在24小时内诱导c-myc显著升高(图3)。c-myc转录增加首次在刺激后10小时检测到，在24小时观察到最高水平。通过免疫荧光检测不同方案处理的细胞中的C-myc定位(图3)。只有pH值为4的DCA或CDCA处理的细胞显示出任何免疫反应性，C-myc在细胞核内和周围最为明显(图3B)。为了扩展这些观察，在OE21、OE33和SW-480细胞系中重复实验方案。实时PCR分析和免疫荧光的结果与TE-7细胞系中的结果几乎相同(图4)。在TE-7细胞系中观察到，c-myc主要定位在细胞核中，并具有一些核周免疫反应性。由于c-myc具有调节增殖的作用，我们评估了这些24小时刺激细胞的增殖水平(图5)。与未刺激的对照细胞相比，在胆汁和酸的存在下持续培养的细胞增殖显著降低(p<0.05)。然而，当细胞被单独的酸刺激时，也观察到这种增殖抑制(p<0.05)，而与单独的生长介质相比，单独的胆汁酸(pH 7)对细胞的增殖率没有影响。
TE-7细胞在24小时刺激期间C-myc mRNA水平(a)。pH为4的脱氧胆酸(DCA)或pH为4的鹅脱氧胆酸(CDCA)刺激的细胞中C-myc的诱导，但在pH为7的DCA或CDCA刺激的细胞中或单独酸化(pH为4)的生长介质中没有。数据为三次实验的平均值(±2 SEM)。在pH值为4的DCA或pH值为4的CDCA刺激TE-7细胞中C -myc (FITC)的免疫荧光(B)， pH值为7的DCA或CDCA，或单独酸化的生长介质(pH值4)(C)和未刺激的细胞(D) (×60目标)。(E) western blotting检测C-myc蛋白表达。Lane 1, TE-7细胞单独在培养基中培养;2道，pH值4;DCA (pH值7);CDCA (pH值7);DCA (pH值4);HeLa和Cos细胞裂解液分别作为阳性(+)和阴性(−)对照。 Cell lysates were normalised for equal protein loading by Coomassie blue staining.
用脱氧胆酸(DCA) (pH值4)或鹅去氧胆酸(CDCA) (pH值4)刺激上皮细胞系sw480、OE33和OE21，在所有细胞系中均可在24小时内显著诱导c-myc mRNA。数据为三次实验的平均值(±2 SEM)。24小时后，通过免疫荧光(FITC)在DCA (pH值4)或CDCA (pH值4)刺激的细胞(B)中与未刺激的细胞(A) (×60目标)中证实了c -myc蛋白的诱导。
评估TE-7、SW-480、OE33和OE21细胞系暴露于脱氧胆酸(DCA) (pH值7)、DCA (pH值4)和酸性培养基(pH值4)24小时后的增殖水平，与仅在培养基中培养的细胞(对照)相比。数据为三次实验的平均值(±2 SEM)。*受刺激细胞与未受刺激细胞间差异显著(p<0.05)。
脉冲DCA和CDCA (ph4)对c-myc诱导的影响
由于GORD最常见的是间歇性事件，其特征是反复短时间暴露于回流的汁液中，我们试图通过刺激四种细胞系(OE21、OE33、TE-7和sw480)来模拟这种情况，根据前面描述的方案仅刺激一分钟，然后用生长介质替换三小时。暴露一分钟的胆汁酸，然后在生长介质中孵育三小时，足以在四种测试的细胞系中诱导c-myc mRNA的1.7-3.4倍(p<0.05)(图6)。单独的酸或pH值为7的胆汁酸再次未能诱导c-myc(结果未显示)。与未受刺激的细胞相比，c-myc诱导与四种细胞系的增殖增加15-22% (p<0.05)相关。
(A)用一分钟的脱氧胆酸(DCA)脉冲(pH值为4)刺激上皮细胞系sw480、TE-7、OE33和OE21，然后在生长介质中孵育三小时，与未受刺激的细胞相比，诱导c-myc mRNA明显诱导。(B)与未受刺激的细胞相比，DCA脉冲1分钟(pH值4)，在生长介质中孵育3小时后，所有四种细胞系的增殖水平。数据为三次实验的平均值(±2 SEM)。*受刺激细胞与未受刺激细胞间差异显著(p<0.05)。
讨论
原癌基因c-myc与许多人类癌症有关，14包括胃和结肠。据我们所知，我们是第一个发现c-myc蛋白和mRNA在Barrett化生和食管腺癌中的上调。Western blotting结果显示，在50%的Barrett良性化生和90%的食管腺癌样本中c-myc表达上调。此外，western blots密度测定显示腺癌中的c-myc明显高于Barrett化生样本。在RNA水平上，与腺癌样本中84%的巴雷特基因c-myc表达上调相比，33%的巴雷特基因c-myc表达上调，这与在蛋白质水平上观察到的结果相当。有趣的是，两组间c-myc mRNA增加的中位数是相同的。这表明，与Barrett化生相比，在腺癌中观察到的c-myc蛋白表达的进一步增加可能是翻译后机制的结果，该机制可能增加c-myc的稳定性或减少其周转率。
我们也在化生-腺癌序列的进展阶段显示了异常的c-myc定位。在良性Barrett柱状化生中观察到c-myc的离散核染色。当上皮细胞发育异常时，除核染色外，细胞质内c-myc表达明显;这种异常定位在腺癌中进一步加重。在其他恶性肿瘤中，有人认为这种异常定位可能是由于蛋白质C末端的改变，降低了核靶向的效率。22此外，如果这个额外的细胞质c-myc池具有与核池不同的周转/稳定性，这可以解释中位折叠mRNA增加和蛋白质水平之间的差异。
这些c-myc升高的观察结果得到了最近一项检查巴雷特腺癌染色体失衡的研究的支持，该研究报告称，包含c-myc序列的最小共染色体区域8q23-24是最常见的扩增区域，在80%的检查病例中发生扩增。17
由于c-myc过表达在腺癌样本中非常常见(90%)，这表明它可能是腺癌发展过程中的许多事件之一。然而，由于良性巴雷特化生患者中c-myc失调的比例很高(50%)，因此c-myc不太可能单独导致腺癌的进展，因为巴雷特化生患者每年发生腺癌的风险仅为0.5-2%。7
以及c-myc在细胞增殖中很重要，它在使细胞对凋亡触发器敏感方面也有作用。然而，这种作用可能会被下游凋亡控制机制的畸变所废除，如p53突变，经常在食管腺癌中观察到。23细胞凋亡的缺失可能会使增加的增殖不受抑制，从而导致恶性进展，这是巴雷特化生中c-myc失调可能增加恶性进展风险的潜在机制。
胃和十二指肠液的反流与食管腺癌密切相关，因此我们研究了这种反流液的成分作为潜在的c-myc诱导剂。未结合胆汁酸DCA和CDCA已被证明是十二指肠胃食管反流的常见成分，11并在细胞培养模型中被广泛研究。虽然胆汁酸在由肝脏排出之前通常是结合在一起的，但在某些肠道细菌的作用下，胃肠道中经常发生解凝作用。24
我们的研究表明DCA和CDCA都能有效诱导c-myc，但仅在酸性条件下，中性pH的胆汁酸在24小时连续培养系统中不能诱导c-myc。这可以解释为pH值为7的胆汁酸的电离形式的优势，它不能穿透磷脂双分子层。在pH值下，胆汁酸是非电离的，可以穿透细胞膜。一旦进入细胞，胆汁酸就会再电离，无法离开细胞，导致细胞内逐渐积聚电离胆汁酸。这种低pH值下胆汁酸在细胞内的积累已经得到了胃和食管的其他研究的支持。25虽然可能是由于c-myc调节蛋白的差异，但为什么四种细胞系之间c-myc mRNA诱导的幅度是可变的还不清楚。此外，仅用酸性生长介质刺激的细胞不能诱导c-myc。然而，有趣的是，在pH值为4的情况下，胆汁酸连续培养24小时可完全抑制增殖。这很可能是由于酸性环境，因为单独的酸对这些细胞造成了增殖的急剧损失，与先前的报道一致。26这表明，在连续培养系统中，胆汁酸可以诱导c-myc，但任何增加的增殖都可能被酸介导的增殖抑制所覆盖。
在GORD患者中，反流本质上是一种间歇性事件，20.27我们试图在体外模拟这个过程。在测试的所有四种细胞系中，单独的一分钟的酸化DCA或CDCA脉冲，然后在生长介质中培养三小时，导致c-myc mRNA的显著诱导。更重要的是，与连续接触胆汁酸不同，以这种方式脉冲会引起适度的增殖诱导。因此，酸化的胆汁似乎可以诱导c-myc，从而增加细胞增殖。我们的数据与考尔相反等他们证明了胆汁酸混合物脉冲一小时可以抑制增殖。28然而，在比较这两项研究的数据时必须谨慎，因为存在许多实验差异，包括胆汁酸的使用、浓度和模型系统，其中最重要的差异可能是刺激持续时间。从这两项研究中可以推断，胆汁酸暴露的持续时间和模式可能对生物反应至关重要。
在本研究中观察到的胆汁酸介导的增殖的精确机制可能是一个涉及信号蛋白和通路级联的高度复杂事件。几项精确的研究表明，酸介导的增殖涉及诸如钠活化等因素+/小时+换热器,29蛋白激酶C，29还有丝裂原激活的蛋白激酶途径30.而胆盐诱导的增殖由蛋白激酶C介导。28需要进一步的工作来阐明这些途径是否有助于调节本研究中观察到的胆汁酸介导的增殖。
如果我们的体外研究结果能够代表体内情况，如Barrett化生，那么控制胆汁回流到食管可能会降低c-myc的表达。虽然可能有人认为抗反流手术是实现这一目标的最佳方法，但我们已经证明，胆汁酸仅在酸性环境中上调c-myc，因此通过质子泵抑制或其他手段抑制酸同样可以防止诱导。显然，这将对巴雷特腺癌的化学预防策略产生重大影响。
虽然通过回流等环境线索诱导c-myc可能很重要，但它肯定不是诱导该癌基因的唯一手段，而且可能有许多其他机制诱导c-myc，如通过基因扩增。
综上所述，我们在50%的Barrett化生病例和90%的食管腺癌病例中均发现c-myc蛋白表达上调，在mRNA水平上也证实了c-myc蛋白表达上调。我们还确定了酸性环境中的胆汁酸作为该致癌基因的有效诱导剂的作用。c-myc的影响可能是复杂的，但很明显，一系列因素，包括回流的持续时间和模式、遗传易感性和环境影响因素，可能不仅决定这些影响，而且决定c-myc本身的表达。体外研究是在来自恶性肿瘤的细胞系中进行的，这些机制是否在非恶性组织中同样重要仍有待证明。然而，研究发现c-myc在大多数食管腺癌和50%巴雷特化生中表达升高，酸性条件下胆汁酸可诱导c-myc表达升高，这有助于解释十二指肠液反流与食管腺癌之间的关系。
致谢
本研究由英国癌症研究运动和英国皇家外科医学院资助。