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摘要
背景与目的:结肠菌群参与了克罗恩病(CD)的发病机制，但只有不到30%的菌群可以被培养。我们使用不依赖培养的技术，研究了缓解期结肠CD患者(n=9)、活跃期结肠CD患者(n=8)和健康志愿者(n=16)之间粪便微生物群的潜在差异。
方法:用6个放射性标记的16S核糖体核糖核酸(rRNA)靶向寡核苷酸探针进行定量斑点杂交，以测量每个系统发育类群对应的rRNA的比例。利用时间温度梯度凝胶电泳(TTGE)对16S rDNA优势种多样性进行评价。
结果:活动性CD和静止性CD中肠杆菌数量显著增加。患者探针加性显著低于健康对照组(99(7)%)(活动性CD和静止性CD分别为65(11)%和69(6)%)。TTGE谱在活跃和静止的CD之间显著变化，但在健康条件下是稳定的。
结论:乳糜泻患者肠道菌群的生物多样性仍然很高。在乳糜泻患者中观察到肠杆菌的频率明显高于健康人，30%以上的优势菌群属于尚未确定的系统发育类群。
- 粪便微生物区系
- 克罗恩氏病
- 时间温度梯度凝胶电泳
- 乳糜泻，克罗恩病
- CDAI, CD活性指数
- IBD，炎症性肠病
- rRNA，核糖体核糖核酸
- TTGE，瞬时温度梯度凝胶电泳
- PCR，聚合酶链式反应
数据来自Altmetric.com
内源性粪便菌群的一些成员在大多数结肠炎和肠炎动物模型中具有明显的有害作用。这也被强烈怀疑是炎症性肠病(IBD)患者的情况，尤其是克罗恩病(CD)。1，2特别是，粪便分流可以防止术后回肠乳糜泻的复发。3.同样,哈珀等报道了小肠出水再次进入克罗恩氏结肠炎患者的结肠采用裂口回肠造口术治疗诱发炎症，而无菌的小肠出水超滤液再次引入不会引起炎症。4并不是所有的细菌都具有相同的促炎特性，有些甚至可能具有保护作用。5，6事实上，最近的一些研究表明，益生菌微生物，如乳酸菌、双歧杆菌和酿酒对乳糜泻的病程有积极影响。7 -9以往对乳糜泻结肠菌群的研究受到几个因素的阻碍。所有这些都使用了细菌培养技术，但可以培养的微生物总数不到30%。10此外，可能影响菌群组成的因素，如疾病位置和活性、抗生素暴露、肠道清洁和人工营养，尚未考虑在内。
基于16S核糖体核糖核酸(rRNA)基因的细菌菌群分子分析消除了培养的需要，可用于表征健康受试者中约90%的优势粪便菌群。10 -14粪便样品中细菌的优势系统发育类群的相对比例可以通过定量斑点斑点分析进行评估，生物多样性可以通过时间温度梯度凝胶电泳(TTGE)进行估计。15日,16本研究的目的是调查结肠乳糜泻患者与健康志愿者粪便菌群的种群结构(即优势系统发育群的比例)，并比较疾病活跃期和疾病缓解期乳糜泻患者粪便菌群的生物多样性。
病人
研究了17例结肠或回结肠乳糜泻患者。收集13例缓解期患者的粪便样本(CD活性指数(CDAI) <150)。178例活动性乳糜泻患者(CDAI >150例，平均260例)。四名患者在疾病缓解期和活动期均提供了粪便样本。所有患者均未服用抗生素、磺胺氮嗪或接受至少四周的结肠清洗。它们的特点如表1所示。还从16名健康志愿者(年龄40(3)岁;7名男性/ 9名女性)，至少四周未服用抗生素。在一名健康受试者身上研究了优势菌群的稳定性，该受试者在两年的时间内提供了五份粪便样本。
方法
在住院患者排出粪便后的一小时内，将粪便样本在Starstedt 2.2 ml螺旋盖管中混合，并在−80°C冷冻。在- 80°C保存，直到分析。
点杂交
如Doré及其同事先前描述的那样，用定量斑点杂交法分析粪便。10从冷冻粪便和参考微生物菌株中提取总RNA。将膜上斑点状的RNA提取物与一组16S rRNA靶向寡核苷酸探针杂交，以评估六个独立的细菌系统发育群，约占健康成人粪便细菌rRNA的90%(表2)拟杆菌类群包括本属的所有种拟杆菌，普氏菌,Porphyromonas11；双歧杆菌属是整个属包括一切吗双歧杆菌属物种;乳酸菌包括所有种类的乳酸菌，肠球菌，链球菌，Lactococcus，片球菌属,明串珠菌属21；的leptum梭状芽胞杆菌而且球菌样的梭状芽胞杆菌组都包括属的种真细菌，瘤胃球菌属,梭状芽胞杆菌以及一些特殊的物种，比如丁酸弧菌属fibrisolvens，Coprococcus eutactus,梭菌属prausnitzii19 -20.；最后，肠杆菌群包括整个肠杆菌科。每组的丰度以rRNA指数表示，即特异性16S rRNA占细菌总16S rRNA的比例(三次测量的平均值(SEM))。以参比菌株为标准，评价rRNA指标拟杆菌vulgatus写明ATCC 8482,双歧杆菌longum写明ATCC 15707,嗜酸乳杆菌写明ATCC 4356,真细菌siraeum写明ATCC 29066,瘤胃球菌属长生蜿ATCC 27340，以及大肠杆菌(rRNA标准;罗氏，梅兰，法国)。
时间温度梯度凝胶电泳(TTGE)
DNA分离和rDNA扩增
如前所述，提取总DNA16取自0.2克粪便样本。用含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳直观测定核酸的浓度和完整性。
引物GCclamp- u968 (5 ' GCclamp- GAA CGC GAA GAA CCT TAC)和L1401 (5 ' GCG TGT GTA CAA GAC CC)用于扩增细菌16S rDNA的V6至V8区域。15聚合酶链式反应(PCR)采用Hot Star Taq DNA聚合酶(Qiagen, Courtaboeuf, France)进行。PCR混合液(50 μl)中含有1×PCR缓冲液，2.5 mM MgCl2， dNTP各200 μM，引物U968-GC和L1401各20 pmol, Hot Star Taq聚合酶2.5 U, DNA约2ng。样品在PCT 100热循环仪(MJ Research, Inc, USA)中按以下程序进行扩增:95°C 15分钟，97°C 1分钟，58°C 1分钟，72°C 1分30秒，最后72°C 15分钟。16PCR产物在含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶上进行电泳分析，检查其大小(500 bp)并估计其浓度。
PCR扩增子TTGE分析
我们使用DCode通用突变检测系统(Bio-Rad，巴黎，法国)进行PCR产物的序列特异性分离。电泳采用1 mm厚的16×16 cm聚丙烯酰胺凝胶(8% wt/vol丙烯酰胺/双，7 M尿素，1.25× TAE，分别加入55 μl和550 μl temed和10%过硫酸铵)，以7升1.25× TAE为电泳缓冲液。电泳在64 V固定电压下运行16小时，初始温度为66℃，斜坡速率为0.2℃/h。为了获得更好的分辨率，电泳开始时固定电压为20 V，持续15分钟。每个孔加载100 - 200ng扩增DNA和等体积的2×凝胶负载染料(0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯氰醇和70%甘油)。每种凝胶使用M Sutren获得的标记。它由克隆的rDNA的PCR扩增混合物组成C球菌样的(157、93及40号)，C leptum(365号和296号)，以及拟杆菌(303及73号)。23凝胶在黑暗中浸泡在SYBR Green I核酸凝胶染色液(Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Germany)溶液中30分钟，并在Storm系统(分子动力学)上读取。
计算和统计分析
斑点杂交实验分为3个重复，结果以rRNA指数(占细菌16S rRNA总数的百分比)的均值(SEM)表示。探针的可加性表示所有6个探针对细菌rRNA总量的附加贡献。使用GelCompar软件(2.0版应用数学，Kortrigk，比利时;执照AJC7-8JHL-AX57-ANEV-GFEJ-AV47)。分析包括计算每个模式的频带数，以及在模式比较之间使用Pearson系数计算作为相似程度的衡量标准。在受试者组(即健康受试者、缓解期乳糜泻患者和活动性乳糜泻患者)之间进行统计比较。比较使用的是学生t对具有正态分布的变量进行检验，否则使用Wilcoxon检验。
结果
采用斑点杂交法评估粪便菌群的组成
检测到显著的杂交信号拟杆菌，双歧杆菌属，乳酸菌，C leptum,C球菌样的组，表明它们存在于所有分析的粪便样本的主要菌群中。三组受试者中细菌种群的相对比例如图1所示。在所有乳糜泻患者的样本中都检测到肠杆菌的信号，但在健康受试者的样本中没有检测到。活动期患者与缓解期患者肠杆菌rrna差异无统计学意义(p=0.193)。这两个拟杆菌组和双歧杆菌在CD患者的细菌rRNA中表现较低。与健康对照组相比，这些差异仅在非活动性疾病患者中具有显著性(p=0.013)拟杆菌双歧杆菌组，p=0.010)。对于来自CD患者(活动性或非活动性疾病)的样本，探针的加和性明显低于来自健康受试者的样本(p=0.006，图1)，这表明患者主要菌群中平均30%的细菌rRNA没有被六种探针所解释。
在健康志愿者、非活动性克罗恩病患者和独立的活动性克罗恩病患者中，用特异性探针进行斑点杂交，评估主要粪便菌群的组成。核糖体核糖核酸(rRNA)指标对应特定的16S rRNA占细菌16S rRNA总数的比例(三次重复测量的平均值(SEM))。比较与健康受试者:* p = 0.0001, * * p = 0.006, p = 0.010 * * *, * * * * p = 0.013, p = 0.034 * * * * *。
在活跃期和非活跃期对4例患者进行研究，得到以下结果(分别为平均(SEM) rRNA%、活跃期和非活跃期):拟杆菌7.2(2.7)和29.2 (10.3)，双歧杆菌属spp5.5(2.8)和5.0 (2.1)，乳酸菌3.3(0.8)和2.5 (1.0)，C leptum19.4(4.0)和26.4 (10.8)，C球菌样的10.9(5.0)和21.7(6.3)，肠杆菌4.5(2.3)和3.7(0.4)。
TTGE法评估粪便菌群的生物多样性
缓解期独立患者(n=9)和活动性CD患者(n=8)的TTGE谱如图2所示。他们在不同的受试者之间有很大的差异，并且在所有情况下的带状模式都是复杂的。缓解期条带数为19.9条(2.5条)，活动期条带数为16.5条(4.9条)(p=0.086)。
16S rDNA扩增子的时间温度梯度凝胶电泳(使用基因V6-V8区域的引物获得)来自独立患者的活动性和非活动性结肠克罗恩病患者的样本。M，标记物，由聚合酶链反应扩增混合克隆的rDNA从球菌样的梭状芽胞杆菌(157、93及40号)，leptum梭状芽胞杆菌(365号和296号)，以及拟杆菌(303及73号)23．我，懒惰病;A、活动性疾病。
在两年内提供5个样本的健康受试者中获得的条带模式之间的Pearson系数在日常比较(80天内收集的4个粪便样本)的93%至98%之间，在两年内收集的样本的比较中超过93%(图3)。
对健康对照受试者中优势菌群的16S rDNA扩增子进行为期两年的时间温度梯度凝胶电泳。S1, 1997年采样;S2-S5，分别于1999年第1、23、58和78天采集。基于皮尔逊相关系数矩阵和使用算术平均(UPGMA)的非加权对组方法，树状图给出了时间温度梯度凝胶电泳剖面之间相似性的统计最佳表示。
在活跃期和非活跃期研究的4例患者的TTGE谱如图4所示。每个患者的束带模式在两个阶段之间有显著差异。一名患者在缓解期与活动性疾病期间条带模式比较的Pearson系数低于50%，其他患者则约为70%(图4)。活动性疾病期间平均损失1.7(2.7)个条带(p=0.29)。一些条带仅在活动性疾病期间观察到，但在所有患者中均不存在。4例患者仅在缓解期观察到两个条带，如图4所示。
4例克罗恩病活动性和非活动性患者配对粪便样本16S rDNA扩增子的时间温度梯度凝胶电泳。树状图如图3所示。IX, X患者非活动性疾病期间的样本;AX, X患者活动性疾病期间的样本。
讨论
使用分子方法，我们观察到非活动性和活动性结肠乳糜泻患者的粪便菌群与健康受试者的粪便菌群不同，含有明显更多的肠杆菌．此外，约30%的优势细菌不属于通常的优势系统发育类群。在疾病活跃期，优势菌群的平衡被破坏，但物种多样性仍然很高。
一些证据表明内源性菌群在CD发病机制中的作用。肠道病变主要发生在肠道菌群最丰富的胃肠道远端，据报道，粪便流中的细菌是导致术后肠道病变复发的原因。3.4,24日,25可培养的内源性结肠细菌不到30%。10，23基于核酸序列比较的现代分子技术是复杂生态系统微生物组成的非培养特征的强大工具，26并能更好地代表优势细菌种群。本研究中使用的方法允许检测一个系统发育组(点杂交)或一个细菌物种(TTGE中的单个16S rRNA序列)，只要它至少代表总细菌菌群的1%27也就是说，大约10个8每克细菌数。这种方法不能检测低浓度的细菌，其中一些细菌可以通过培养技术识别。
为了检查缓解期内源性微生物群的主要变化，我们选择了患有结肠疾病的CD患者，这些患者在分析前至少4周没有接受抗生素、磺胺柳嗪或结肠清洗。我们的患者接受了维持缓解所需的治疗，即美沙拉嗪、皮质类固醇或免疫抑制剂。这种处理对菌群组成的影响是未知的。我们决定不研究磺胺柳嗪治疗的患者，因为它可能会影响菌群，可能是因为磺胺部分。28
在非活动性和活动性乳糜泻期间，肠杆菌的增加已经在培养研究中得到了证实。29日,30.大肠杆菌一些菌株与乳糜泻的发病机制有关，特别是一些具有特殊粘附特性的菌株，在乳糜泻的回肠病变中粘附性能增强。31然而，相比之下，大肠杆菌在溃疡性结肠炎患者中进行的临床试验表明，Nissle 1917菌株口服给药可能具有保护作用32位34和CD。7
拟杆菌在几种IBD动物模型中表现出促炎特性。35而一些文化研究表明粪便可能会增加拟杆菌在CD,36岁,37我们观察到相对比例的下降拟杆菌系统组。群探针与拟杆菌但也是成员Porphyromonas而且普氏菌属，并不能检测细微的具体修改拟杆菌例如，在物种层面上B vulgatus．37一些作者认为双歧杆菌和乳酸杆菌(或至少这些群体的一些成员)对IBD具有潜在的保护作用。5，38 -40这基本上是基于对益生菌菌株的研究，益生菌菌株似乎可以在IBD动物模型中预防炎症5，38，39在最近的临床试验中。9日,40岁,41之前的一项研究表明，乳糜泻期间双歧杆菌数量下降，42我们注意到在我们的病人中有这种减少的趋势，这种减少只在非活动性疾病的病人中是显著的。假定双歧杆菌对乳糜泻的保护作用仍有待证实，但Campieri等报道了含有4株双歧杆菌的益生菌VSL#3降低了术后CD复发的风险。9有趣的是，我们发现乳糜泻患者的内源性微生物群(约30%)的高比例不属于健康对照组的主要微生物群。鉴定存在于这一“系统发育缺口”中的细菌种类或类群对于理解乳糜泻的发病机制很重要。基于16S rDNA的克隆和测序，对乳糜泻患者的整个细菌种群进行了描述。23目前正在进行中。
在健康情况下，粪便微生物群的TTGE谱在一段时间内非常稳定，但在患者中不稳定。我们观察到，在疾病的活动性阶段，条带的数量仅略有减少，这表明在两种情况下，微生物区系都保持了高度的多样性。我们观察到没有特定的单一带指向细菌的存在，可以具体参与疾病活动。
更好地了解微生物群的变化应该有助于确定抗生素、益生菌和益生元的治疗靶点。我们的研究结果表明，针对肠杆菌或导致系统发育缺口的细菌的抗生素应在CD患者中进行研究。在益生菌中，含有双歧杆菌的益生菌应在预防结肠CD复发的试验中受到特别关注。
致谢
P Seksik获得了Ferring-France奖学金以完成这项工作。