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摘要
背景炎症性肠病(IBD)可由破坏肠上皮细胞完整性或免疫调节的基因突变引起。SHIP先前已被证明在限制免疫调节细胞的数量及其功能方面起着关键作用。
目的确定SHIP是否在肠黏膜免疫耐受的控制中起关键作用。
方法在三株不同的ship缺陷小鼠和它们各自的野生型(WT)窝鼠中评估了胃肠道病理。用WT造血细胞重建的ship缺陷宿主和用包括整个脾细胞、纯化T细胞或自然杀伤细胞(NK)的ship缺陷造血细胞重建的WT宿主的胃肠道病理进行了分析。我们还分析了ship缺陷小鼠和WT对照小鼠小肠中的主要免疫细胞群。
结果ship缺陷小鼠发生节段性、透壁性脓疱性肉芽肿性肠炎，再现了克罗恩病肠道病理学的经典特征。造血嵌合体分析显示，WT骨髓重构的SHIP−−/主机纠正回肠炎。调整与船−−/脾细胞转移回WT宿主。采用纯化的SHIP转移−−/T细胞或NK细胞向WT宿主不转移回肠炎。ship缺陷小鼠小肠中CD4和CD8 T细胞均缺乏;然而，中性粒细胞数量显著增加。
结论SHIP在肠道的免疫功能中起着关键作用;有必要对IBD患者中的这一通路进行进一步的研究。有人认为，ship缺陷性回肠炎是由于黏膜T细胞免疫的局部缺陷导致回肠远端粒细胞单核细胞炎症。
- 船
- 免疫调节
- 炎症性肠病
- 克罗恩氏病
- 骨髓嵌合体
- 细胞信号传导
- 克罗恩病结肠炎
- 遗传学
- 粘膜免疫
- 信号转导
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本研究的意义
关于这个主题我们已经知道了什么?
免疫调节对小肠的完整性和功能至关重要。
SHIP控制外周淋巴组织(如脾脏和淋巴结)中免疫调节的髓细胞和T淋巴细胞的稳态。
肺髓样实变是ship缺陷小鼠发病和死亡的重要原因。
新的发现是什么?
尽管ship缺陷小鼠外周血淋巴组织的免疫调节增强，但这些小鼠小肠的免疫功能和调节受损。
正常的免疫功能和小肠内稳态需要酶活性的SHIP。
肠上皮细胞对SHIP的表达对小肠的完整性并不是必需的。
缺乏ship的血淋巴细胞足以将回肠炎转移到野生型宿主。
ship缺陷小鼠小肠中CD4和CD8 T细胞均缺乏。
ship缺陷小鼠小肠内存在局部中性粒细胞。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
这些发现表明，对人类IBD患者SHIP基因的详细分析是有必要的，也可能有助于更好地理解免疫功能和人体肠道调节所需的免疫细胞信号通路。
简介
克罗恩病(CD)是一种慢性、复发性特发性炎症性肠病(IBD)，可影响胃肠道内的多个部位，但典型的是回肠，导致腹部绞痛、腹泻和胃肠道出血。1 - 4乳糜泻组织病理学病变开始于中性粒细胞浸润的多发虫状溃疡的形成，进展并合并成明显分隔的、区域性的、跨壁炎症，伴有肉芽肿形成、固有肌层增厚、狭窄、裂隙和瘘管。1 - 4尽管全基因组关联研究已经确定了30多个IBD易感位点，它们干扰肠上皮细胞(IEC)屏障内稳态或免疫效应细胞功能以及与肠道菌群和抗原的相互作用，5 - 7许多易感基因在IEC和造血细胞中具有不同的功能，基因易感个体的原发性IEC或免疫缺陷通常仍然是谜。89
被认为有助于乳糜泻病理发展的主要免疫改变包括固有层细胞中th1极化细胞因子白细胞介素-12和干扰素γ的表达增加，1011异常的il -23启动了th17相关的免疫反应，1213调节性T细胞(Treg)通过转化生长因子β或IL-10依赖机制调节效应功能的缺陷，14异常的b细胞特异性和血清自反应性15骨髓细胞功能障碍。16一些异体骨髓移植后疾病缓解的报道支持了免疫细胞功能的原发性缺陷导致一些患者的乳糜泻。17
可能导致乳糜泻发展的IEC屏障缺陷包括Paneth细胞衍生的NOD2变体无法排出腔内细菌，18IEC自噬和抗菌颗粒胞吐减少，19改变了IEC toll样受体的表达，对常见细菌基序的反应可能失调，20.改变IEC细胞因子表达21增加了IEC对肠管内容物的胞旁通透性，可能是由于IEC紧密连接形成不充分所致。22
虽然已经描述了IBD的动物模型，但大多数模型系统影响大肠，不表现出cd特异性的组织病理学特征，而且通常是诱导而不是自发发展的模型。5723只有两种动物模型，即SAMP1/Yit小鼠，自发发生回肠慢性炎症24和肿瘤坏死因子∆是鼠标。25在Th1-和th2型免疫应答的驱动下，SAMP1/Yit小鼠在10周龄时自发发生终末回肠炎，抗肿瘤坏死因子(TNF)抗体可降低其严重程度。232627虽然SAMP1/Yit肠系膜淋巴结CD4+T细胞能够过继地将回肠炎转移到重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠，增加的IEC旁细胞通透性似乎是该模型的主要易感性因素。22的肿瘤坏死因子∆是通过在编码TNF基因的AU-rich区域(ARE)中删除69bp生成小鼠模型，导致与CD8扩增相关的全身TNF水平升高+杂合子和纯合子小鼠中介导慢性回肠炎和关节炎的效应细胞亚群。2528SAMP1/Yit和TNF的造血细胞∆是小鼠能够过继地将cd样疾病转移到具有免疫能力的宿主。
含有Src同源2 (SH2)的肌醇-5-磷酸酶(SHIP)蛋白在各种细胞因子的表面受体(包括促红细胞生成素、IL-3、GM-CSF、M-CSF)激活后，或在B细胞抗原受体交联或T细胞激活时，在造血细胞中成为酪氨酸磷酸化。2930.在周围淋巴系统中，SHIP信号在限制免疫调节细胞的数量和功能方面起着关键作用。31-37我们最近发现SHIP限制了脾脏和肠系膜淋巴结中免疫调节T细胞的数量。35SHIP通过限制FoxP3的存活来控制周围Treg细胞的数量+Treg细胞或通过naïve CD4 T细胞阻止FoxP3表达的不适当获取。35与这一发现一致的是，SHIP所反对的一种酶的p110亚基，PI3K，对周围Treg细胞的形成和存活至关重要。3839ship缺乏还促进脾和淋巴结中髓样免疫调节(MIR)细胞的不适当扩张。3233因此，在脾和淋巴结等主要外周淋巴组织中，ship缺乏导致免疫调节能力的深度和功能性扩张。总之，这些研究表明，肌醇磷脂信号在骨髓和淋巴免疫调节细胞群的形成、稳态和功能中起着关键作用。
SHIP通过其5 ' -肌醇磷酸酶结构域水解第二信使PI(3,4,5)P3.从而限制PI3K激活关键的下游免疫效应通路，如Akt和NF-κB。30.40ship缺陷小鼠比它们的WT和杂合子同窝小鼠更小，寿命大大缩短，存活时间超过10-12周的情况很少。3241部分原因是嗜酸性粒细胞结晶性肺炎伴有混合炎症细胞浸润，导致斑片状肺实变。41嗜酸性粒细胞结晶性肺炎是各种基因工程小鼠模型寿命缩短的一个原因。4243在ship缺乏的小鼠中，粒细胞对凋亡信号的敏感性较低，粒细胞单核细胞浸润在肝脏、肾脏、心脏、骨骼肌、胰腺淋巴结和胸腺中均可见。44缺乏ship的T细胞分化为Treg细胞的能力增加，伴随着Th17细胞分化的不足和CD4过继转移后引起结肠炎的能力降低+T细胞到T细胞缺乏的宿主。3536
虽然SHIP的表达和功能通常被认为局限于造血系统中的细胞，但最近的证据表明SHIP也在一些实质细胞类型中表达，包括成骨细胞45和内皮细胞。46事实上，我们最近确定了SHIP在血淋巴隔室外的第一个已知功能，因为SHIP是支持造血干细胞功能和骨髓(BM)龛细胞静止所必需的。45
鉴于其在免疫调节和淋巴功能中的作用，我们试图检查ship缺乏是否可能在肠粘膜表面产生后果，由于在该器官部位与共生菌群和潜在病原体密切和持续的相互作用，对免疫效应和调节过程施加了更大的压力。令人惊讶的是，我们的分析显示小肠中CD4和CD8 T细胞的缺乏，同时该部位中性粒细胞的增加。与免疫状态改变一致，我们发现回肠自发发展，其特征与乳糜泻病理学密切相似。此外，这种SHIP缺陷小鼠的cd样回肠炎的易感因子似乎在造血腔室中，而且很可能是粒细胞单核细胞，因为cd样回肠炎在照射和SHIP脾细胞重建后可转移到具有免疫能力的宿主，但在T细胞或自然杀伤(NK)细胞转移后不存在。因此，ship缺陷小鼠是第一个能够过继地将CD样疾病转移到具有免疫能力的宿主的CD动物模型。
材料和方法
老鼠
SHIP的开发与生产−−/老鼠在前面已经描述过了。在短暂的船−−/小鼠通过Cre-LoxP策略删除SHIP的启动子和第一外显子，然后回交到C57BL6/J背景。船ΔIP /ΔIP老鼠是杰弗瑞·拉维奇博士(纽约洛克菲勒大学)好心送的礼物。47MxCreSHIP液氧/液氧老鼠在前面被描述过。33小鼠腹腔注射三次625μ/剂量的聚i /C后，SHIP表达减弱。MxCreSHIP液氧/液氧最后一次注射polyI/C后4-5周处死小鼠进行组织采集。PI3K单倍不足SHIP−−/本研究分析的小鼠具有PI3K调控亚基p85突变48以及海尔加森创造的SHIP变异等．41所有小鼠在牺牲时均在6至13周龄之间。所有小鼠都被饲养在一个经过认证的隔离设施中，确认没有潜在寄生虫和微生物病原体的全面清单，包括枸橼酸杆菌属rodentium，铜绿假单胞菌，沙门氏菌spp。,perfringens梭状芽胞杆菌鼠诺如病毒(MNV)、副流感病毒I型(仙台)、冠状病毒(MHV)病毒抗体、支原体pulmonis、副粘病毒(PVM)、细小病毒(MPV、MMV)、脊髓灰质炎病毒(TMEV)、呼肠孤病毒3型(Reo)、动脉病毒(LCM)、腺病毒(MAD1、MAD2)、痘病毒(Ectro)、轮状病毒(EDIM)、乳头状病毒(Poly)和游离病毒幽门螺杆菌sp. PCR筛选。此外，使用WarthineStarry、Giemsa、Ziehle Neelsen和PAS染色法，没有在任何组织中发现微生物。
过继转移实验
从完整的股骨和胫骨中冲洗BM细胞，收集在由RPMI、3%胎牛血清(FBS)和10 mM HEPES (Invitrogen, Carlsbad, California, USA)组成的组织培养基(TM)中。脾脏用10ml注射器柱塞压碎。然后通过70毫米过滤器过滤单细胞悬浮液(BD Bioscience, San Jose, CA)，在1× RBC裂解缓冲液(eBioscience, San Diego, California, USA)中在室温下裂解5分钟。细胞离心后在1× Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(D-PBS)中重悬。C57BL/6受体在接受x射线照射器1100拉德(600+500)的分裂剂量之前，先给予抗生素水。然后将受照射者移植5×105眼眶后注射显示骨髓细胞或脾细胞。对于T细胞和NK细胞过继转移，CD3+NKp46−T和NKp46+CD3−同时从SHIP的脾脏中分离NK细胞−−/小鼠和过继转移到辐照C57BL6宿主(550 Rads)通过眶后注射。每个C57BL/6主机收到2.4×105船−−/T细胞和7.5×103.船−−/NK细胞。
组织病理学分析
尸检以系统、全面的方式进行。评估整个消化道，包括食管、胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠以及相关的肠系膜和肠系膜淋巴结，用10%中性缓冲福尔马林对消化道进行充气，并将消化道卷成段，以适应瑞士卷，放入盒装盒中进行组织学处理和显微镜评估。对皮肤、皮下、骨骼肌、腹股沟淋巴结和乳腺脂肪垫、颈部淋巴结、唾液腺、生殖道和相关腺体、肝脏、胆囊、脾脏、胰腺、肾脏和肾上腺进行评估。收集用10%中性缓冲福尔马林充气的喉、气管(附甲状腺和甲状旁腺)、心脏、胸腺和肺。10%中性缓冲福尔马林固定，脱水，石蜡包埋，3 μm切片，H&E染色。对消化道各节段的组织学切片进行掩盖、评估，并将炎症分级划分为0-6级，其中6级代表进展最严重的病变。炎症分级如下:炎症0级=无明显异常;炎症1级=固有层和/或肠内淋巴结的轻度多形核(PMN)白细胞浸润(<25 PMN/hpf);炎症2级=中度以中性粒细胞为主的固有层和/或淋巴结浸润(>25细胞/hpf);炎症3级=明显的炎症细胞浸润并延伸至肌层粘膜下方，导致黏膜及黏膜下层结构扭曲，伴隐窝增生; inflammatory grade 4=marked infiltrations with extension into the tunica muscularis; inflammatory grade 5=marked transmural leucocyte infiltrations; inflammatory grade 6=marked transmural leucocyte infiltrations with extension into the mesentery and/or other organs. In each section the presence of granuloma, crypt abscess, stricture, fissure, and whether dissemination of inflammation to other sites had occurred was noted. Inflammatory scores were compared between cohorts by one-way ANOVA. All reported p-values are two-sided with p<0.01 considered significant. The sections were scored by a single, board certified veterinary pathologist. The sections were scored by a veterinary pathologist with confirmation of scoring system and subsequent gradations by a clinical pathologist.
流式细胞术
用于小肠细胞染色的抗体包括CD3ε、CD4、CD8、CD16/32、CD62L、CD62E和Ly6G，来自BD Pharmingen (San Jose, California, USA)。样品在FACSCalibur上采集，并使用FlowJo8进行分析。在排除DAPI染料的基础上，用细胞仪采集染色数据后，从分析中排除死亡细胞。
结果
ship缺陷小鼠的回肠炎
79只6-8周龄小鼠，其中SHIP 26只−−/老鼠,26日船ΔIP /ΔIP老鼠,PI3K+ /−船−−/对26只野生型窝鼠进行了系统、全面的尸检，并对整个充气消化道进行了组织病理学检查。原发性胃肠道病变仅出现在ship缺陷小鼠回肠内，包括节段性回肠炎。根据炎症程度将病变分级为0-6级(数字1 - 6)．在评估的53只ship缺陷小鼠中，53只(6%)ship缺陷小鼠中只有3只(6%)缺乏回肠炎，而53只(94%)ship缺陷小鼠中有50只(94%)存在不同程度的回肠炎，显著高于WT同窝小鼠中无回肠炎的小鼠(p<0.001)。这两个船−−/和船舶ΔIP /ΔIP在SHIP1位点编码不同区域的外显子中存在缺失，26例SHIP中有25例(96%)发生回肠的频率相当−−/24 / 26(92%)的SHIPΔIP /ΔIP小鼠平均回肠炎炎症等级分别为4.2±2.1和4.0±2.2。PI3K中也观察到回肠炎+ /−船−−/小鼠(4级)，表明第三个独立的SHIP突变株发展为这种病理，PI3K单倍不足不能防止回肠炎的发展。PI3K+ /−船+/+和PI3K+ /−船+ /−对照组没有回肠炎(0级)的证据。所分析的所有ship缺陷小鼠回肠炎症病变均出现在胃肠道未受其他影响、未发炎的背景下。
ship缺陷小鼠的1级克罗恩病样回肠炎。早期表现为cd样疾病的ship缺陷小鼠小肠的瑞士卷纵切片，解释为1级，固有层有轻度多形核(PMN)白细胞浸润(B，箭头)。回肠嗜中性粒细胞浸润典型表现在粘膜上和淋巴结内(C-F)。相邻回肠和更近端的小肠(C，星号)不受正常绒毛黏膜结构的影响。高倍镜显示绒毛固有层(F)和下淋巴结内以嗜中性粒细胞为主的白细胞浸润，伴有组织细胞和多核巨细胞(E)。
2级小鼠的克罗恩病样回肠炎包括回肠固有层(D)和下面的淋巴结(C)的中度、混合、主要多形核白细胞浸润，伴随隐窝增生(B，上括号箭头)，有延伸、聚集和大量有丝分裂象(D)，与相邻小肠未受影响的黏膜(a，星号)相比，具有正常绒毛结构和典型隐窝深度(B，降低将箭头)。
ship缺陷小鼠的3级克罗恩病样回肠炎包括明显的、混合的、通常以多形核(PMN)为主的炎症细胞浸润回肠黏膜和黏膜下层扩张(a，括号中的箭头)、正常绒毛结构的丧失和隐窝伸长(a，箭头)。病变回肠(B, C)高倍镜显示混合的，主要是嗜中性粒细胞浸润。
4级船质缺陷小鼠克罗恩病样回肠炎包括明显的混合炎症细胞浸润，穿过黏膜、黏膜下层并进入肌膜(a、B、C、F、G)。这种炎症细胞浸润的成分不同，在受影响回肠的某些区域以多形核为主(D)，而在其他区域以单核细胞为主，存在淋巴细胞、组织细胞和大量多核巨细胞(B，E). 4级回肠炎典型的是脓疱肉芽肿性炎症细胞浸润的明显聚集物，有时呈念珠状排列(F，箭头)，导致肠壁增厚(G，箭头)和管腔狭窄。多核巨细胞(H)和脓样肉芽肿(I)常出现在受累节段，但隐窝脓肿(J，箭头)较少观察到。
ship缺陷小鼠的5级克罗恩病样回肠炎包括明显的、混合的、跨壁炎症细胞浸润，并延伸到浆膜，其中一些由于肠壁增厚和狭窄形成的炎症细胞形成裂缝，渗透并盲目终止于肌肉膜内(A;B,箭头)。
大多数船质缺陷小鼠表现为6级克罗恩病样回肠炎，包括明显的混合的跨壁炎症细胞浸润，通过回肠浆膜的裂隙延伸至肠系膜(A-C，箭头)，炎症由混合炎症细胞和成纤维细胞聚集和旋转(E)和脓性肉芽肿组成，有些伴有中央坏死(F，箭头)。
在ship缺陷的小鼠中，cd样回肠炎的最早表现为1级，包括轻度(<25 PMN/hpf)，主要是PMN白细胞浸润固有层，并经常潜伏在淋巴结下(图1)．53只ship缺陷小鼠中有9只(17%)回肠出现1级病变。这种轻度的、早期的SHIP缺陷回肠病变在其他个体SHIP中也有进展−−/和船舶ΔIP /ΔIP小鼠为中度(>25 PMN/hpf)，混合，但仍然主要是PMN白细胞浸润扩张的固有层和下层淋巴结，划分为2级，伴随的隐窝再生增生表现为IEC拥挤和隐窝深度延伸(图2)．53只ship缺陷小鼠中有2只(4%)出现2级回肠炎。3级炎症细胞浸润在肌层粘膜下混合渗透，粘膜及黏膜下层扩张，绒毛结构扭曲，隐窝增生(图3)．53只ship缺陷小鼠中有5只(9%)回肠内有3级炎症病变。
有标记的，ship缺陷小鼠回肠的混合炎症细胞浸润从黏膜、黏膜下层延伸到肌膜，被指定为4级(图4)．53只ship缺陷小鼠中有6只(11%)回肠内有4级炎症病变。4级炎症的组成各不相同，有的以PMN为主，有的以单核为主，通常是粒细胞、淋巴细胞、组织细胞和多核巨细胞的混合(图4 d, E)．炎性细胞浸润延伸至肌膜呈节段状，界限分明，随机排列或串珠状排列(图4 f)．在一些4级炎症的区域，上面的粘膜有局灶性溃疡。肉芽肿和脓性肉芽肿见于粘膜、粘膜下层和/或肌膜。部分小鼠因4级炎症而肠壁增厚，导致管腔狭窄及狭窄(图4 g)．
明显的混合炎症细胞浸润，渗透至肠壁，深入肠壁至浆膜，分级为5级(图5)，在53只ship缺陷小鼠中有5只(9%)存在。在一些病例中，5级回肠使肠壁增厚，管腔变窄，导致狭窄的形成和裂隙的发展，渗透并盲目终止于肌膜(图5 a, B)．
ship缺陷小鼠回肠可见明显混合的跨壁炎症细胞浸润，并通过裂隙通过增厚的肌膜和浆膜延伸至肠系膜(图6 a - c)被分配到6年级。更多的ship缺陷小鼠被诊断为炎症级别为6级，53只ship缺陷小鼠中有23只(43%)被诊断为回肠炎级别为6级。向肠系膜扩展的炎症包括混合炎症细胞、肉芽肿、纤维化，很少有血栓形成和血管炎(图6 d-f)．
所有1-6级ship缺陷小鼠的回肠炎均为节段性，表现为局灶性、不连续的炎症细胞浸润或回肠内的宽带炎症(图7 a - c)．回肠邻近节段和更近端的小肠或远端的大肠未受影响。在53只ship缺陷小鼠中有12只(23%)观察到狭窄(图4 g)， 53例患者中有15例(28%)出现肉芽肿(图4我53只ship缺陷小鼠中有5只(9%)出现隐窝脓肿(图4 j)．回肠幽门化生，瘘管形成，人类CD组织病理学的其他特征，在ship缺乏的小鼠中不明显。
ship缺陷小鼠克罗恩病样回肠炎的节段性包括离散的、不连续的炎症灶(A，箭头)或宽带炎症灶(B，括号中的箭头)，与相邻的未受影响的节段(C，右箭头)相比，每一节段都有黏膜和黏膜下层扩张，肌膜增厚(C，左箭头)。A, B, C，星号)，肠绒毛结构正常，肠壁厚度正常。
很少的情况下，回肠炎通过直接扩展到其他胃肠道部位，包括在两只小鼠中，回肠炎症通过肠系膜扩展到结肠壁(图8 a, B)，在第三只ship缺陷的小鼠中，炎症已经扩散到胃-食管交界处(图8 c, D)．在53只ship缺陷小鼠中，33只(62%)肠系膜排水淋巴结肿大和发炎(图8 e, F)．一个船−−/小鼠肠系膜静脉中有炎性细胞血栓和肉芽肿性肺实变，其成分与本例中的回肠炎相似，这表明血管血栓和栓子可能很少发生，而血管血栓和栓子可能通过血源途径传播炎症(图8 g-j)．这种肺实变与常规的SHIP不同−−/和船舶ΔIPΔIP小鼠嗜酸性粒细胞结晶性肺炎(图9 f)．
在一些ship缺陷小鼠中，炎症扩展到回肠以外，肠系膜混合白细胞浸润到结肠壁(a，箭头;B)，或食管和胃的交界处(C，箭头;D).排水性肠系膜淋巴结经常肿大，由混合炎症细胞和大量多核细胞组成(E, F)。很少情况下，炎性细胞血栓(T)出现在肠系膜静脉内(G, H，箭头)，栓子可能停留在肺微血管中，导致肉芽肿性肺实变，由混合炎症细胞和大量多核细胞组成(I, J，左)与邻近肺叶嗜酸性粒细胞结晶性肺炎(I, J，右)形成鲜明对比。
船质缺陷小鼠出现嗜酸性粒细胞结晶性肺炎，包括细支气管气道内的大晶体、混合炎症细胞浸润病灶(A，箭头)、细支气管上皮下纤维化(B，箭头)、细支气管上皮肥大和黏性化生(C)、大量肺泡巨噬细胞和多核细胞(D, E)以及浸润的白细胞导致斑块状肺实变(F，左)。
成年期切除SHIP表达后可导致肠肠炎
上述研究表明，回肠炎发生在种系SHIP突变小鼠中，提示这种cd样病理可能有发育起源。为了验证这种可能性，我们分析了MxCreSHIP的肠道病理液氧/液氧SHIP表达在胎儿、新生儿和青少年期正常，但在polyI/C给药后可在成年期消融。33这种方法导致SHIP缺乏的成年小鼠嗜酸性粒细胞结晶性肺炎。49本分析为12 6-8周大的MxCreSHIP液氧/液氧老鼠和十二艘船液氧/液氧对照组，男女均进行比较组织病理学分析。原发性胃肠道病变仅出现在MxCreSHIP的回肠内液氧/液氧老鼠,而船液氧/液氧小鼠在末次注射polyI/C后4 ~ 5周未受影响。12 MxCreSHIP液氧/液氧12只小鼠中只有1只(8%)没有回肠炎，而11只(92%)出现了回肠炎，平均炎症等级为3.5±1.9。相当于SHIP的回肠炎−−/和船舶ΔIP /ΔIP小鼠，MxCre SHIP flox/flox小鼠回肠为节段性，有混合炎性细胞浸润。12例MxCreSHIP中有2例(17%)肉芽肿形成明显液氧/液氧老鼠。因此，在成年小鼠中，cd样回肠在选择性缺失的情况下发生，说明SHIP的表达是维持成年回肠正常黏膜免疫稳态和调节所必需的。
缺乏ship的实质细胞不会引起回肠炎
为了评估SHIP缺乏可能改变回肠实质细胞类型(如IEC)发育或功能的可能性，我们创建了骨髓(BM)嵌合体，其中6个SHIP−−/移植4个月后用WT C57BL/ 6bm重组宿主，进行组织病理学分析。胃肠道的六个SHIP−−/用WT BM重建的宿主没有任何异常，包括在种系SHIP中观察到的cd样回肠炎的所有特征−−/和船舶ΔIP /ΔIP老鼠。我们还分析了这些重组小鼠的肺。尽管中度嗜酸性粒细胞结晶性肺炎的组分在SHIP中存在−−/宿主用WT C57BL/ 6bm重组，包括晶体形成，肺泡巨噬细胞数量增加，可见明显的髓样浸润和肺实变−−/和船舶ΔIP /ΔIP小鼠的肺中不存在SHIP−−/用WT C57BL/ 6bm重组宿主。
ship缺陷的血淋巴细胞将回肠转移到WT宿主
为了直接测试ship缺陷的血淋巴细胞是否导致了在ship缺陷菌株中观察到的回肠炎，我们采用了5×105船−−/6个WT C57BL/6宿主的脾脏细胞。1个月后对肺和肠进行病理分析。6只接受SHIP的WT小鼠中有5只出现了与种系SHIP缺陷小鼠相似的节段性回肠炎−−/脾细胞平均回肠炎评分为1.8(评分范围为0-5)。该分析表明，血淋巴样隔室的ship缺陷足以改变小肠内免疫细胞的稳态反应，从而导致cd样表型。有趣的是，过继转移facs纯化的CD3+T细胞,NK1.1+CD3−从SHIP的脾脏中制备NK细胞−−/小鼠无法将任何可检测到的回肠炎转移到WT宿主(每种细胞类型分析三个宿主)。因此，缺乏ship的T细胞或NK细胞足以转移回肠炎。我们还观察到SHIP−−/脾细胞将轻度至中度嗜酸性粒细胞结晶性肺炎转移至WT宿主，在某些情况下进展为斑片状肺实变，这在两种种系ship缺陷小鼠中均可见41和MxCreSHIP液氧/液氧小鼠进行基因消融。49
ship缺陷小肠中嗜中性粒细胞合并T细胞缺乏
我们的病理学结果和上述过继转移研究表明，在我们观察到的ship缺陷小鼠回肠炎的基础上可能存在粒细胞单核细胞谱系。为了进一步评估这种可能性，我们对ship缺陷小鼠和WT小鼠小肠中的主要免疫细胞群(包括中性粒细胞、树突状细胞、CD4/CD8 T细胞和Treg细胞)进行了多参数细胞术检测。为了支持中性粒细胞在回肠炎中的作用，我们发现SHIP小肠中中性粒细胞总数的绝对增加−−/老鼠(图10)．这适用于Ly6G的中性粒细胞+CD16/32+表型和CD62L+子集(图10 A, B)．这些回肠中性粒细胞的发现与我们上述的组织病理学研究一致。令人惊讶的是，我们发现CD4 (图11)和CD8 (图11 b)缺乏ship的小肠中存在T细胞。当与上述T细胞过继转移研究相结合时，这些发现表明，在ship缺陷小鼠中观察到的cd样回肠炎不是由ship缺陷T细胞的自身免疫攻击引起的。分析CD11c+CD11b+成熟的树突状细胞和CD4+CD25+Treg细胞在这些免疫细胞数量上与SHIP无显著差异−−/和WT小肠。
ship缺陷小肠中性粒细胞增多。CD16/32的FACS检测+Ly6G+嗜中性粒细胞(A)及其CD62L/E表面染色(B)在ship缺陷小鼠和野生型(WT)窝鼠小肠中。(C) CD16/32绝对总数+Ly6G+中性粒细胞和CD62L+结果表明，ship缺陷小鼠和WT小鼠小肠中中性粒细胞增多。* * * p < 0.001。
ship缺陷小肠中存在严重的T细胞缺陷。流式细胞仪检测CD3+CD4+(一)和CD3+CD8+(B) ship缺陷小鼠及其野生型(WT)同胎小鼠小肠中的T细胞。(C)显示的ship缺陷小鼠和WT小鼠小肠中CD4和CD8 T细胞绝对数量。* * p < 0.01。
讨论
乳糜泻的病理始于中性粒细胞浸润的多发性甲口溃疡的形成，然后发展并合并成界限分明的、区域性的、透壁炎症，并形成狭窄、裂隙和瘘管。1 - 4我们发现SHIP1位点的突变导致类似的以中性粒细胞为主的回肠炎。尽管在本文描述的ship缺陷小鼠中缺乏乳糜泻的病理元素，包括多发性虫状溃疡、幽门腺化生、肉芽组织和瘘管形成的发展，但存在许多乳糜泻的组织病理学特征。缺乏SHIP的回肠炎并不是由缺乏SHIP实质成分的明显功能障碍如SHIP重建引起的−−/具有ship活性血淋巴细胞的宿主可阻止回肠炎的发展。然而，这些宿主仍然保留嗜酸性粒细胞性结晶性肺炎的一些方面，表明SHIP−−/实质成分可能有助于在种系ship缺陷小鼠中发现的肺病理。相反，我们发现来自脾脏的ship缺陷血淋巴细胞转移足以在免疫能力强的宿主中引发cd样回肠炎。能够进行细胞介导免疫攻击的T细胞和NK细胞的转移不会引起这种cd样回肠炎。这些发现表明，一个缺乏ship的髓系细胞可能促进发生在ship缺乏小鼠中的cd样肠炎。在ship缺陷小鼠中，粒细胞对凋亡信号的敏感性较低，在ship缺陷小鼠的各种组织中均可见粒细胞单核细胞浸润，44单核吞噬细胞是维持肠道内稳态所必需的。50
嗜酸性粒细胞结晶性肺炎的组分在SHIP中的保留−−/用WT BM重组的宿主表明这种肺病理的各个方面是实质的，细胞自主起源。质谱分析已确定Ym1为该肺炎的主要结晶蛋白，可能由激活的肺泡巨噬细胞分泌，并被认为参与嗜酸性粒细胞募集、免疫激活和组织修复。34然而，由于接受异基因骨髓移植的ship缺陷小鼠有正常的寿命，32这些保留的肺病理特征显然不足以进展到发生在种系、ship缺陷小鼠中的致命肺实变。41此外，根据目前的观察，cd样肠炎应该被包括在导致种系ship缺陷小鼠发病率和死亡率的病理中。
无肠道病理的SHIP−−/用WT BM重建的宿主表明，ship缺陷不会导致导致回肠炎的IEC功能屏障缺陷。相反，cd样表型可以通过ship缺陷的造血细胞转移到具有免疫能力的宿主，这表明ship缺陷的回肠炎是由于先天免疫功能(如粒细胞-单核细胞反应)调节的改变，T细胞介导的粘膜屏障功能的失败或这些潜在改变的组合。ship缺陷小鼠的回肠炎可能是由于黏膜T细胞功能的缺陷，使得粒细胞单核细胞对共生生物和腔内抗原产生不适当的反应，最终导致在ship缺陷小鼠回肠中观察到的炎症状态。
虽然SAMP1/Yit鼠标24和肿瘤坏死因子∆是鼠标25目前的ship缺陷小鼠是独特的，因为它明显通过干扰可转移到WT宿主的免疫细胞群重现CD表型。有许多可能的候选肠炎诱导细胞。由于我们观察到大多数ship缺陷小鼠回肠固有层远端有嗜中性粒细胞浸润，我们推测嗜中性粒细胞对回肠腔内共栖菌群的不适当反应可能是免疫攻击的基础或触发因素。SHIP在预防中性粒细胞增多中起着关键作用，因为SHIP在外周血中粒细胞数量显著增加−−/老鼠41以及用SHIP1选择性抑制剂3AC治疗的小鼠。49SHIP的效应函数不恰当−−/到目前为止，尚未检测到在器官部位的中性粒细胞，因此我们的发现首次表明了在ship缺陷的宿主中中性粒细胞介导的组织损伤。相反，肠炎似乎不太可能是由于小肠中不适当的T细胞攻击引起的，因为ship缺乏导致小肠中CD4和CD8 T细胞数量的严重局部缺陷，而正常数量的Treg细胞仍然存在于该部位。
上述cd样病理表现在两种SHIP的回肠中均可常规观察到−−/菌株3141和这艘船ΔIPΔIP应变47SHIP1基因的不同突变表明这是一种高度渗透的表现型。此外，因为表型发生在SHIP中ΔIPΔIP只有编码SHIP外显子的肌醇磷酸酶结构域的菌株，我们得出的结论是，表型依赖于SHIP酶活性的丧失。SHIP通过其5 ' -肌醇磷酸酶结构域水解第二信使PI(3,4,5)P3.从而限制了由Akt和NF-κB促进的关键下游生存和效应通路的PI3K激活。30.40然而，最近的研究表明SHIP，通过PI(3,4)P的生成2，也可以通过增加Akt的活化来促进细胞存活，49结果表明，Akt与SHIP产物PI(3,4)P结合，且被PI(3,4)P更有效激活2，比它的底物PI(3,4,5)P3.．51女子等发现SHIP还可以通过合成PI(3,4)P促进免疫效应功能2．52目前尚不清楚ship缺乏是否由于免疫细胞缺乏抑制性或激活性信号而引起回肠炎。这可能取决于细胞环境。例如，人们可以设想，通过PI(3,4)P的产生，SHIP可能是T细胞在粘膜的有效运输和存活所必需的2而是通过减小(3,4,5)P3.在中性粒细胞中，SHIP也限制了它们在这个肠道部位的数量和功能。使用SHIP进行未来谱系特异性SHIP烧蚀研究液氧/液氧在这些模型中，小鼠和适当的Cre转基因结合生化分析PI3K效应通路可能阐明SHIP在维持回肠正常免疫功能/调节中的作用的分子机制。
对小鼠的遗传分析和全基因组关联研究已导致识别可诱发乳糜泻的突变，其发生概率和发病时间各不相同。我们的分析表明，在实验室小鼠中，SHIP是CD样病理的一个强大的遗传决定因素，这表明通过对CD患者中SHIP表达和功能的仔细检查，也可能发现类似的情况。最近的研究表明，位于2q37的2号染色体多态性与IBD的显著增加和早发有关，这为SHIP1在人类IBD中的作用提供了令人兴奋的证据。53SHIP1位点也存在于人类2号染色体的2q37区域。这种潜在的联系值得用最近开发的测定SHIP1活性的荧光分析法来比较IBD患者和正常对照组的SHIP酶活性。49未来对造成ship缺陷小鼠回肠炎的细胞和分子机制的研究也可能为免疫改变如何促进IBD提供见解。
参考文献
脚注
相关的文章225664．
WGK和MYP贡献相等。
资金这项工作得到了美国国立卫生研究院(RO1 HL72523, R01 HL085580)和佩吉·阿诺德蝴蝶跑步项目的部分资助。WGK是儿童肿瘤研究的墨菲家族教授，也是纽约州立大学帝国学者。
相互竞争的利益一个也没有。
来源和同行评审不是委托;外部同行评议。