你在这里gydF4y2Ba

条文本gydF4y2Ba

菜单条gydF4y2Ba
结肠gydF4y2Ba
原文gydF4y2Ba
开发一种增强的人胃肠上皮培养系统，以促进基于患者的检测gydF4y2Ba
免费的gydF4y2Ba
  1. 凯莉·L·凡杜森gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  2. 杰弗里·M·马林肖gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  3. Nurmohammad谢赫gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  4. )的三好gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  5. 克拉拉的月亮gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  6. 菲利普一世·塔尔gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  7. Matthew A CiorbagydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  8. 塞笛厄斯·S·斯塔彭贝克gydF4y2Ba1gydF4y2Ba
  1. 1gydF4y2Ba病理与免疫学系“，gydF4y2Ba，gydF4y2Ba华盛顿大学医学院gydF4y2Ba，gydF4y2Ba密苏里州圣路易斯gydF4y2Ba美国gydF4y2Ba
  2. 2gydF4y2Ba内科消化科“，gydF4y2Ba，gydF4y2Ba华盛顿大学医学院gydF4y2Ba，gydF4y2Ba密苏里州圣路易斯gydF4y2Ba美国gydF4y2Ba
  3. 3.gydF4y2Ba儿科消化、肝、营养科gydF4y2Ba，gydF4y2Ba华盛顿大学医学院gydF4y2Ba，gydF4y2Ba密苏里州圣路易斯gydF4y2Ba美国gydF4y2Ba
  4. 4gydF4y2Ba分子微生物学系gydF4y2Ba，gydF4y2Ba华盛顿大学医学院gydF4y2Ba，gydF4y2Ba密苏里州圣路易斯gydF4y2Ba美国gydF4y2Ba
  1. 对应到gydF4y2BaThaddeus S Stappenbeck博士，华盛顿大学医学院病理与免疫学系，660 S. Euclid, Box 8118, St. Louis, MO 63110;gydF4y2Bastappenb在}{pathology.wustl.edugydF4y2Ba和Matthew A Ciorba博士，华盛顿大学医学院消化内科，660 S. Euclid, Box 8124, St. Louis, MO 63110;mciorba@dom.wustl.edugydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

客观的gydF4y2Ba人类肠上皮细胞的培养技术正在迅速发展。一个令人兴奋的可能性是，这个系统可以作为个体化医疗和研究的平台。然而，为了实现这一目标，必须加强人类上皮细胞培养，以便个体活检可以在短时间内用于重复生成细胞系，以便进行多种功能分析(即屏障功能和宿主-微生物相互作用)。gydF4y2Ba

设计gydF4y2Ba我们从常规上下内窥镜检查过程中采集的患者活组织切片中创建了一大组人胃肠上皮细胞系(n=65)。使用含有生长关键因子(Wnt3a、R-spondin和Noggin)的高浓度条件培养基快速扩增增殖干细胞/祖细胞。结合较低的条件介质浓度和Notch抑制被用来分化这些细胞进行额外的实验。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba我们在培养2周内从所有可接近的组织部位获得上皮细胞。肠细胞系干细胞标记物富集，并迅速生长为球体，每3天需要以1:3-1:4的速度传代。在分化条件下，肠上皮小球表现出成熟上皮谱系的区域特异性发育。当生长在Transwell膜上时，这些细胞形成了功能性的极化单层，被分泌黏液层覆盖。利用二维培养，这些细胞也表现出新的粘附表型与各种致病菌株gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba该培养系统将促进个体间的研究，人体肠上皮细胞的功能研究，包括宿主-微生物相互作用。gydF4y2Ba

  • 上皮细胞gydF4y2Ba
  • 大肠杆菌gydF4y2Ba
  • 肠上皮细胞gydF4y2Ba
  • 细胞生物学gydF4y2Ba
  • 分化gydF4y2Ba

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2013-306651gydF4y2Ba

数据来自Altmetric.comgydF4y2Ba

    请求的权限gydF4y2Ba

    如果您希望重用本文的任何或全部内容，请使用下面的链接，该链接将带您到版权清除中心的RightsLink服务。您将能够快速获得价格和即时许可，以多种不同的方式重用内容。gydF4y2Ba

    本研究的意义gydF4y2Ba

    关于这个问题我们已经知道了什么?gydF4y2Ba

    • 含有Wnt3a、R-spondin 3和Noggin的条件培养基支持小鼠肠上皮球形细胞的生长，这些球形细胞富含干细胞。gydF4y2Ba

    • 原理验证方法已经证明了人肠上皮细胞作为类器官的生长。gydF4y2Ba

    • 将人类肠道上皮球形培养方法应用于个体患者的研究引起了人们极大的兴趣。gydF4y2Ba

    新的发现是什么?gydF4y2Ba

    • 球体线可以在短短2周内从健康患者和炎症疾病患者的活检材料中重复形成。gydF4y2Ba

    • 对于所有区域和供体，产生上皮系的方法是相同的。gydF4y2Ba

    • 所有培养均表现出强劲的生长和区域特异性分化。gydF4y2Ba

    • 与通常用作宿主-病原体相互作用系统的永生化细胞相比，特定病原体与原代结肠上皮细胞的粘附是意外的和增强的。gydF4y2Ba

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?gydF4y2Ba

    • 这种强大的和可复制的人肠上皮细胞培养系统提供了一个新的平台，以创建个体特异性的分析和询问宿主-病原体的相互作用。gydF4y2Ba

    简介gydF4y2Ba

    肠上皮具有独特的适应能力，可执行多种稳态功能，包括屏障的形成和维持、营养物质的消化和吸收、微生物组的调节和参与宿主免疫反应。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba这些功能的紊乱与胃肠道疾病有关，包括感染和IBD。由于上皮细胞和邻近细胞(包括间质细胞和造血细胞以及常驻和短暂肠道微生物)之间的复杂相互作用，在体内模型中很难解剖上皮细胞的内在作用。为了提高我们对上皮细胞在健康和疾病中的功能的理解，体外研究非转化上皮细胞的方法是至关重要的。gydF4y2Ba

    近年来，小鼠和人肠道上皮细胞培养方法取得了长足的进展。gydF4y2Ba- 18gydF4y2Ba这些方法一般可以分为胚胎干细胞或诱导多能干细胞(诱导类器官培养)开始培养的方法。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba或与肠组织分离的隐窝/干细胞(类器官或球形培养)。gydF4y2Ba2 - 5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7号到9号gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14 - 16gydF4y2Ba虽然ips衍生的类器官对于研究胚胎发育很有价值，但生成成熟的、分化的肠上皮细胞所需的时间长度可能会限制它们在患者导向的实验方法中的应用。相比之下，由于球体培养的分化速度相对较快，因此特别适合于基于个体的医学。因此，开发球形培养方法来研究人肠上皮细胞功能的个体间变异(归因于遗传、年龄、性别等)引起了极大的兴趣。这将允许使用个体自身的肠上皮细胞来筛选新的疗法，确定宿主-微生物/宿主-病原体的相互作用，并进行临床测试以确定特定疗法的疗效。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba球形培养面临的其他挑战包括从内镜活检中重复分离和培养材料的能力，降低与当前方法相关的技术复杂性和成本，以及以与患者护理相称的稳健和及时方式培养这些细胞的能力。gydF4y2Ba

    基于诱导多能干细胞的培养方法和基于球形的培养方法都使用含有典型Wnt配体、R-spondin和Noggin的培养基，这些都是支持肠上皮干细胞生长的关键因素。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba由于将这些成分作为重组因子添加到培养基中的成本非常高，因此已经采用了其他策略来递送这些因子，例如上皮下肌成纤维细胞喂养细胞gydF4y2Ba5gydF4y2Ba或者条件介质。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba我们设计了一种能够分泌Wnt3a、R-spondin 3和Noggin (L-WRN)的l细胞系，从而创建了一种具有成本效益的条件培养基(L-WRN CM)，可以收集并用于有效地将这些关键生长因子输送到培养的上皮细胞。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2BaL-WRN CM支持小鼠肠上皮球体的稳健生长，这些球体高度富集干细胞。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba在这里，我们克服了与开发人类肠道球形培养方案相关的挑战，通过将我们的小鼠方法适应于人类胃肠道上皮细胞的培养。gydF4y2Ba

    材料与方法gydF4y2Ba

    人体组织样本采集及球形培养gydF4y2Ba

    活检组织是在华盛顿大学医学院与华盛顿大学消化疾病研究核心中心(DDRCC)生物标本核心合作进行的常规内窥镜检查中获得的。使用标准内镜活检钳(Radial Jaw 4 Large Capacity Jaw O.D 2.4 mm, Boston Scientific, Natick, Massachusetts, USA)收集活检，并立即置于5 mL冰水清洗介质中(DMEM/F12 with HEPES (Sigma D6421)，补充10%胎牛血清(Sigma)， 2 mm l -谷氨酰胺，100单位/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素(Sigma))。这项研究得到了华盛顿大学医学院机构审查委员会的批准。获得所有捐赠者的书面知情同意。gydF4y2Ba

    建立和维持人类球形培养的程序是基于我们以前的出版物gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba与在线补充方法提供的额外详细信息。简而言之，为了分离隐巢/腺体单位，活检组织用细剪刀切碎，并在1ml胶原酶溶液(2 mg/mL胶原酶I型(Invitrogen, Grand Island, New York, USA)和50 μg/mL庆大霉素(Invitrogen)在洗涤介质中消化)中消化20-30分钟，每5-10分钟移液一次。隐窝/腺体通过70 μ m过滤器过滤，与9 mL冰水洗涤介质孵育，并通过20-50离心制成颗粒gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟。通常，第二次孵育用5毫升洗涤介质，然后以50-150离心gydF4y2BaggydF4y2Ba实验持续5分钟。然后将球化的隐窝/腺体悬浮在1 mL的洗涤介质中，转移到1.5 mL的试管中，在200℃离心制成球化gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟。用移液管小心地除去上清，并将颗粒悬浮在Matrigel (BD Biosciences, San Jose, California, USA;15µL /)。将基质凝胶混合物镀于24孔组织培养板上。将平板倒置(防止上皮细胞附着在塑料上)，并在37°C下孵育，以聚合Matrigel和400 μ L的50% L- wrn CM，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2BaL-WRN CM和新鲜原代培养基(高级DMEM/F-12 (Invitrogen)，添加20%胎牛血清，2 mM l -谷氨酰胺，100单位/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素)，添加10µM Y-27632 (ROCK抑制剂;Tocris Bioscience, R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA)和10µM SB 431542 (TGFBR1抑制剂;Tocris Bioscience, R&D Systems)被添加到每口井中。用原代培养基进一步稀释可获得较低比例的L-WRN CM。分化介质(含或不含5 μ M DAPT (EMD Millipore))包括Y-27632，但不含SB 431542。实验使用在线补充表S1中加粗的圆球线，在第6-40段。用固定在相位显微镜(Fisher Scientific)上的瞳孔凸轮(Ken-a-Vision，堪萨斯城，密苏里州，美国)对活体球体进行成像。用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)细胞增殖测定试剂盒(ATCC, Manassas, Virginia, USA)测定细胞生长。gydF4y2Ba

    基因表达分析gydF4y2Ba

    RNA用NucleoSpin RNA II试剂盒(machery - nagel, Bethlehem, Pennsylvania, USA)分离，其中包括DNase处理。逆转录酶反应(50µL)使用1µg RNA和Iscript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad, Hercules, California, USA)。真核定量PCR (qPCR)反应采用SYBR Advantage qPCR Premix (Clontech, Mountain View, California, USA)和在线补充表S2中的引物进行。每个样品重复三次测定表达水平，并归一化为甘油醛3-磷酸脱氢酶(gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba)，在所有样本中表达水平相似。gydF4y2Ba

    原代上皮细胞单层分析gydF4y2Ba

    Transwell培养方法改编自我们最近发表的小鼠结肠球状体培养方法。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba人体球体(每个Transwell 24孔板的约1孔)被解离，通过40 μ m过滤器过滤，种子到Transwell膜(Fisher Scientific, CoStar 3470)上，涂有0.1%的明胶(早期实验)或在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中1:40稀释的Matrigel(后期实验)，并提供5%的L-WRN CM (10 μ m Y-27632包含O/N，然后在日常介质更换期间去除)。经上皮阻力(TER)测量gydF4y2Ba19gydF4y2Ba黏液层分析gydF4y2Ba21gydF4y2Ba如前所述。采用Zeiss LSM510 Meta激光扫描共聚焦显微镜(Carl Zeiss Inc, Thornwood, New York, USA)，配备Argon (Ex. 488 Em. BP 505-530)和HeNe1 (Ex. 543 Em. BP 560-615)激光，63× 1.4数值孔径Zeiss Plan Apochromat油物镜和LSM软件生成Z-stack图像(1.1 μ m，最佳间隔为0.55 μ m)。用表达增强绿色荧光蛋白(EGFP)的重组慢病毒感染直肠和回肠球形线gydF4y2BahPGKgydF4y2Ba启动子gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba使用所描述的协议。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba

    细菌粘附测定gydF4y2Ba

    在玻璃载玻片上生长的上皮细胞(Lab-Tek;用PBS稀释的1:40 Matrigel包被)在无抗生素的培养基中洗涤，然后用0.3 mL的培养液孵育gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba-包含媒体(∼10gydF4y2Ba9gydF4y2Ba菌落形成单位/mL) 1小时(37°C, 5% COgydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，用培养基清洗三次以去除不粘附的细菌，然后放回培养箱。3小时后，用冰冷的PBS冲洗细胞5次(以进一步去除非粘附细菌)，固定/染色(冷甲醇/0.5%结晶紫)或裂解以分离gDNA (DNeasy组织试剂盒;试剂盒)。定性粘附试验重复进行(n= 2-4次试验/人细胞系)。qPCR方法采用人进行gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba和细菌gydF4y2BamalBgydF4y2Ba引物(见在线补充表S2) (n=4次测定/gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba菌株/人类细胞系)。每种野生型的相对粘附指数(RAI)gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba是gydF4y2BamalBgydF4y2Ba到GAPDH，再除以这个比例，得到非粘附菌株ORN172。gydF4y2Ba

    统计分析gydF4y2Ba

    使用Prism GraphPad V.6软件进行Student 's t检验或单向方差分析(ANOVA)，然后进行Dunnett 's多重比较或Tukey后验，如图图例所示。p值<0.05为显著。gydF4y2Ba

    结果gydF4y2Ba

    通过内镜活检建立胃肠道上皮球形培养gydF4y2Ba

    为了从个体患者身上重复培养肠上皮细胞，我们采用了为小鼠肠上皮细胞开发的系统。为了启动培养，从活检标本(4 - 18mm)中通过胶原酶消化分离肠隐窝gydF4y2Ba2gydF4y2Ba每一个;每个培养2-3个活检)在常规内窥镜检查中采集(gydF4y2Ba图1gydF4y2BaA).将分离的隐窝嵌入基底膜基质(Matrigel)中，并在L-WRN CM和新鲜原代培养基(此处称为50% L-WRN CM)的50/50混合物中培养。我们发现ROCK (Y-27632)和TGFBR1 (SB 431542)抑制剂是维持人类肠上皮细胞培养>3传代所必需的(见在线补充图S1)，这是我们对小鼠培养系统的修改。在24小时内，形成了小球体gydF4y2Ba22gydF4y2Ba（gydF4y2Ba图1gydF4y2BaA)。通常情况下，培养物可以在4-6次传代(15-25天)内充分扩展以制备冷冻原液(10瓶/行)(见在线补充图S2)。gydF4y2Ba

    Establishment of human epithelial spheroid cultures from multiple regions of the gastrointestinal tract. (A) Representative images showing the procedure for establishment of intestinal spheroid culture. Ruler lines above biopsy samples indicate 1 mm. Bars, 100 µm. (B) Diagram illustrating the numbers of spheroid and gastric lines established to date. The first number reports the total number of lines established from the indicated region, and the number in parenthesis indicates the number of those lines established from patients with IBD.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1gydF4y2Ba
    图1gydF4y2Ba

    从胃肠道多个区域建立人上皮球形培养。(A)肠球形培养建立过程的代表性图像。活检样本上方的标尺线为1毫米。bar, 100µm。(B)图示迄今为止建立的球形和胃线的数量。第一个数字报告了从指定区域建立的线的总数，括号中的数字表示从IBD患者建立的线的数量。gydF4y2Ba

    这种建立人类肠道球面线的方法对所有内窥镜可及的胃肠道部位都是成功的，包括健康或患有炎症的个体(如Barrett 's食管和IBD;gydF4y2Ba图1gydF4y2BaB).我们还从包括回肠新末端(肠切除手术后)和回肠袋-肛门吻合术回肠袋部分的组织部位建立了既往接受肠道手术的患者的上皮系。到目前为止，我们从47个个体(包括25个IBD患者)中生成了65个人类球体系(见gydF4y2Ba图1gydF4y2BaB和在线补充表S1)。因此，该培养系统可以支持来自胃肠道多个部位以及来自有或没有疾病的患者的上皮细胞的生长。gydF4y2Ba

    人直肠和回肠上皮球状体的强劲生长gydF4y2Ba

    无论供体状况如何(健康对照或IBD)， 50% L-WRN CM的直肠和回肠球状体迅速增长(gydF4y2Ba图2gydF4y2BaA、B)。在2天的时间内，直肠和回肠球体显示出细胞数量的强劲增长(分别增加2.4倍和2.9倍;gydF4y2Ba图2gydF4y2BaB).这一结果表明，在50% L-WRN CM中生长的球状体富集为高度增殖的茎和/或祖细胞群。因此，直肠和回肠细胞系大量表达富含亮氨酸的重复G蛋白偶联受体5 (gydF4y2BaLGR5就gydF4y2Ba)，这是小鼠肠道中公认的干细胞标记物gydF4y2Ba23gydF4y2Ba（gydF4y2Ba图2gydF4y2BaC).椭球线表达相似水平的绒毛蛋白1 (gydF4y2BaVIL1gydF4y2Ba)，显示它们保留了肠上皮的特性(gydF4y2Ba图2gydF4y2BaC).波形蛋白的表达(gydF4y2BaVIMgydF4y2Ba)在传代7(该标记分析的最早传代)后的任何系中均未检测到，证实间充质细胞在初始传代中已被消除(gydF4y2Ba图2gydF4y2BaC).因此，与其他含有间充质细胞的培养技术相比，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba该系统允许对分离的上皮细胞进行研究。gydF4y2Ba

    Robust growth of cultured intestinal spheroids in conditioned medium containing Wnt3a, R-spondin 3 and Noggin. (A) Representative images demonstrating the qualitative growth of an individual spheroid imaged daily over a 3-day period. Bars, 100 µm. (B) Spheroids were seeded (day 0) into 96-well format and growth was assessed at 24 h intervals by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay on days 1, 2 and 3. The reduction of MTT (yellow colour) to formazan (purple colour) by metabolically active cells was measured by absorbance at 595 nm with a plate reader. The background subtracted results for three rectal (gray bars) and three ileal (red bars) cell lines are presented as fold change (mean±SEM) compared with day 1 for each region (n=9 per line at each time point). ***p=0.004 by Student’s t test. (C) qPCR gene expression analysis for (A) LGR5, (B) VIL1 and (C) VIM in rectal and ileal epithelial cell cultures. Fresh biopsy samples were used as a positive control (white bars). Data are presented as fold change relative to the biopsy samples (mean±SEM; n=3 samples per bar). n.d., not detected.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2gydF4y2Ba
    图2gydF4y2Ba

    在含有Wnt3a、R-spondin 3和Noggin的条件培养基中培养的肠道球形体的稳健生长。(A) 3天内每天成像的单个球体质的增长的代表性图像。bar, 100µm。(B)将球状体(第0天)播种到96孔格式，在第1、2和3天，每隔24小时通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT)法评估生长情况。用平板阅读器在595 nm处用吸光度法测定代谢活性细胞将MTT(黄色)还原为甲马赞(紫色)。与第1天相比，三个直肠(灰色条)和三个回肠(红色条)细胞株的背景减去结果以折叠变化(平均值±SEM)表示(每个时间点每行n=9)。***p=0.004经学生t检验。(C) qPCR基因表达分析(A)gydF4y2BaLGR5就gydF4y2Ba, (B)gydF4y2BaVIL1gydF4y2Ba和(C)gydF4y2BaVIMgydF4y2Ba直肠和回肠上皮细胞培养。新鲜活检样本作为阳性对照(白条)。数据以相对于活检样本的倍数变化(平均值±SEM;N =3个样本/ bar)。N.d，未检测到。gydF4y2Ba

    人类球体保留了特定区域的分化程序gydF4y2Ba

    由于球形培养物似乎富集了干细胞，因此确定允许分化的条件很重要。Wnt信号通路是一个完善的途径，有助于肠道干细胞的活性和维持在体内。gydF4y2Ba25 - 29gydF4y2Ba我们之前已经证明50%的L-WRN CM是我们培养系统中Wnt刺激的主要来源，其稀释会导致小鼠肠道上皮球体中Wnt信号活性的降低。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba使用人体球体也得到了类似的结果(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba此外，Notch抑制剂N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基- l-丙酰)]-(S)-苯甘氨酸t-丁基酯(DAPT)的加入，促进小鼠和人类球体的分化，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba在直肠和回肠系中迅速减少s期细胞的比例(见gydF4y2Ba图3gydF4y2BaB和在线补充图S3)。因此，通过下调Wnt和Notch信号，可以快速诱导细胞周期退出。gydF4y2Ba

    Human intestinal epithelial spheroids grown in low percentages of conditioned medium containing Wnt3a, R-spondin 3 and Noggin (L-WRN CM) exhibit decreased Wnt signalling activity. (A) Human rectal and ileal spheroids (n=3 lines per region) were cultured for 2 days in 50%, 20%, 10%, 5% or 0% L-WRN CM. Gene expression of AXIN2, LGR5, OLFM4, MKI67 and MYC was determined by qPCR (n=3 experiments per line). A dose-dependent decrease was observed for AXIN2 (canonical Wnt target), mouse intestinal stem cell markers LGR5 and olfactomedin 4 (OLFM4), and proliferative markers MKI67 and MYC. Both 0% and 5% L-WRN CM showed a significant decrease for all of these markers compared with 50% L-WRN CM. As some assays required cells with some potential to divide, we used cells grown in 5% L-WRN CM for downstream applications. Data were presented as fold change (mean±SEM) compared with 50% L-WRN CM for each experiment. *p<0.05; **p<0.01; ****p<0.0001 by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by a Dunnett's post-test with 50% L-WRN CM set as the control group: F=17.58, p<0.0001 (A, AXIN2); F=449.60, p<0.0001 (A, LGR5); F=113.70, p<0.0001 (A, OLFM4); F=56.13, p<0.0001 (A, MKI67); F=87.09, p<0.0001 (A, MYC); F=49.48, p<0.0001 (B, AXIN2); F=1570.00, p<0.0001 (B, LGR5); F=156.70, p<0.0001 (B, OLFM4); F=63.81, p<0.0001 (B, MKI67); F=125.20, p<0.0001 (B, MYC). (B) Spheroids were passaged (day 0) and allowed to recover overnight in 50% L-WRN CM. Media was replaced daily, with some cultures changed to 5% or 5% L-WRN CM plus 5 µM DAPT for the indicated number of days. On day 3, the spheroids were treated with EdU for 2 h, dissociated, stained and sorted by flow cytometry based on EdU incorporation and SYTOX AAD (DNA content marker). An average of 22.2% of rectal cells and 16.8% of ileal cells were in S-phase when grown in 50% L-WRN CM. One day of culture in 5% L-WRN CM was not sufficient to reduce the proportion of cells in S-phase; however, after 2 days, a decrease in the proportion of cells in S-phase was observed for both rectal and ileal lines. Addition of 5 µM DAPT to the 5% L-WRN CM rapidly decreased the proportion of S-phase cells within 1 day and led to greatly diminished proportions of S-phase cells (1.6–2.9%) after 2 days.**p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001 by one-way ANOVA followed by a Dunnett's post-test with 50% L-WRN CM set as the control: F=43.01, p<0.0001 (rectal); F=54.13, p<0.0001 (ileal).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3gydF4y2Ba
    图3gydF4y2Ba

    在含有Wnt3a、R-spondin 3和Noggin (L-WRN CM)的低百分比条件培养基中生长的人肠上皮球状体显示Wnt信号活性降低。(A)人直肠和回肠球形体(每个区域n=3株)在50%、20%、10%、5%或0% L-WRN CM中培养2天。基因表达gydF4y2BaAXIN2gydF4y2Ba，gydF4y2BaLGR5就gydF4y2Ba，gydF4y2BaOLFM4gydF4y2Ba，gydF4y2BaMKI67gydF4y2Ba而且gydF4y2BaMYCgydF4y2BaqPCR法测定(每系n=3次试验)。观察到剂量依赖性的减少gydF4y2BaAXIN2gydF4y2Ba(典型Wnt靶标)，小鼠肠道干细胞标记物gydF4y2BaLGR5就gydF4y2Ba嗅觉素4 (gydF4y2BaOLFM4gydF4y2Ba)和增殖标记gydF4y2BaMKI67gydF4y2Ba而且gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba．0%和5% L-WRN CM与50% L-WRN CM相比，所有这些指标均显著降低。由于一些检测需要具有一定分裂潜力的细胞，我们使用在5% L-WRN CM中培养的细胞进行下游应用。每次实验的数据以折叠变化(平均值±SEM)表示，与50% L-WRN CM相比。* p < 0.05;* * p < 0.01;通过单因素方差分析(ANOVA)， ****p<0.0001，然后以50% L-WRN CM为对照组进行Dunnett's后验:F=17.58, p<0.0001 (a，gydF4y2BaAXIN2gydF4y2Ba）;F=449.60, p<0.0001gydF4y2BaLGR5就gydF4y2Ba）;F=113.70, p<0.0001gydF4y2BaOLFM4gydF4y2Ba）;F=56.13, p<0.0001gydF4y2BaMKI67gydF4y2Ba）;F=87.09, p<0.0001gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba）;F=49.48, p<0.0001gydF4y2BaAXIN2gydF4y2Ba）;F=1570.00, p<0.0001 (gydF4y2BaLGR5就gydF4y2Ba）;F=156.70, p<0.0001 (gydF4y2BaOLFM4gydF4y2Ba）;F=63.81, p<0.0001 (gydF4y2BaMKI67gydF4y2Ba）;F=125.20, p<0.0001 (gydF4y2BaMYCgydF4y2Ba)．(B)球状体传代(第0天)，在50% L-WRN CM中过夜恢复。每天更换培养基，部分培养基改为5%或5% L-WRN CM + 5 μ M DAPT，持续指定天数。第3天，用EdU处理球体2 h，根据EdU的加入和SYTOX AAD (DNA含量标记物)进行流式细胞分离、染色和分类。在50% L-WRN CM中，平均22.2%的直肠细胞和16.8%的回肠细胞处于s期。5% L-WRN CM培养1天，不足以降低s期细胞比例;然而，2天后，直肠和回肠的s期细胞比例均有所下降。在5% L-WRN CM中添加5 μ M DAPT可在1 d内迅速降低s期细胞比例，2 d后s期细胞比例显著降低(1.6 ~ 2.9%)，**p<0.01;* * * p < 0.001;****p<0.0001，通过单因素方差分析，然后以50% L-WRN CM为对照进行Dunnett's后验:F=43.01, p<0.0001(直肠); F=54.13, p<0.0001 (ileal).

    接下来，我们检测了在50% L-WRN CM或5% L-WRN CM中生长的直肠、回肠和十二指肠球体中分化细胞标记物的mRNA表达。正如所料,gydF4y2BaLGR5就gydF4y2Ba与50% L-WRN CM相比，5% L-WRN CM加DAPT或不加DAPT培养的球体中，分化细胞标记物的表达明显降低，分化细胞标记物的表达普遍升高gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba以及在线补充数据S4和S5)。根据其体内表达模式，碳酸酐酶1 (gydF4y2BaCA1gydF4y2Ba)在直肠球状体和蔗糖异戊酸酶(gydF4y2Ba如果gydF4y2Ba)在5% L-WRN CM中与DAPT一起生长时，回肠球体特异性诱导(gydF4y2Ba图4gydF4y2BaA, B)。DAPT的加入对于诱导分泌细胞标志物的表达很重要，包括转录因子无调性同源体1 (gydF4y2BaATOH1gydF4y2Ba)和神经原素3 (gydF4y2BaNEUROG3gydF4y2Ba)、杯状细胞标记物黏蛋白2 (gydF4y2BaMUC2gydF4y2Ba)及三叶因子3 (gydF4y2BaTFF3gydF4y2Ba)和内分泌细胞标记物嗜铬粒蛋白A (gydF4y2BaCHGAgydF4y2Ba)(见gydF4y2Ba图4gydF4y2BaC和在线补充数字S4和S5)。Paneth细胞标记α-防御素5的表达(gydF4y2BaDEFA5gydF4y2Ba)(见gydF4y2Ba图4gydF4y2BaD和在线补充图S5)在50% L-WRN CM和DAPT中生长时，仅在小肠小球中强烈诱导，这与体内分布和Wnt信号在Paneth细胞形成中的关键作用一致。gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba小肠标记物的区域特异性诱导也被观察到。瞬时受体电位阳离子通道，亚家族V，成员6 (gydF4y2BaTRPV6gydF4y2Ba；钙通道)和溶质载体家族10，成员2 (gydF4y2BaSLC10A2gydF4y2Ba；胆汁酸转运蛋白)，分别优先表达于十二指肠和回肠球状体(gydF4y2Ba图4gydF4y2BaE, F)。这些数据表明，上皮细胞的区域特异性，至少部分是细胞固有的，如前所述。gydF4y2Ba32gydF4y2Ba

    Region-specific differentiation of rectal and ileal spheroids. (A–D) qPCR gene expression analysis for (A) CA1, (B) sucrase-isomaltase (SI), (C) MUC2, (D) DEFA5, (E) TRPV6 and (F) SLC10A2 in rectal (gray bars), ileal (red bars) or duodenal (blue bars) spheroids (n=3 lines per region). RNA was collected from spheroids that had been passaged, allowed to recover overnight in 50% conditioned medium containing Wnt3a, R-spondin 3 and Noggin (L-WRN CM) and then treated with 50% or 5% L-WRN CM with or without the addition of 5 µM DAPT for an additional 2 days, with media replaced daily. Data are presented as fold change relative to rectal or duodenal 50% L-WRN CM, except for DEFA5, which is presented as fold change relative to ileal 50% L-WRN CM (mean±SEM; n=3 per line). n.d., not detected. *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001 by one-way analysis of variance followed by a Tukey's post-test: F=7.23, p=0.0008 (A, rect); F=3.73, p=0.0210 (A, ile); F=3.53, p=0.0256 (B, rect); F=6.24, p=0.0019 (B, ile); F=4.99, p=0.0060 (C, rect); F=6.16, p=0.0020 (C, ile); F=9.42, p=0.0001 (D, ile); F=9.05, p=0.0002 (E, duod); F=0.67, p=0.5777 (E, ile); F=17.33, p<0.0001 (F, duod); F=4.39, p=0.0151 (F, ile).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4gydF4y2Ba
    图4gydF4y2Ba

    直肠和回肠球状体的区域特异性分化。(A) qPCR基因表达分析gydF4y2BaCA1gydF4y2Ba， (B)蔗糖异麦芽酸酶gydF4y2Ba（gydF4y2BaSI)gydF4y2Ba, (C)gydF4y2BaMUC2gydF4y2Ba, (D)gydF4y2BaDEFA5gydF4y2Ba, (E)gydF4y2BaTRPV6gydF4y2Ba和(F)gydF4y2BaSLC10A2gydF4y2Ba在直肠(灰色条)、回肠(红色条)或十二指肠(蓝色条)球体中(每个区域n=3行)。从传代后的球状体中收集RNA，在含有Wnt3a、R-spondin 3和Noggin的50%条件培养基(L-WRN CM)中恢复一夜，然后用50%或5% L-WRN CM(加或不加5µM DAPT)处理2天，每天更换培养基。数据显示为相对于直肠或十二指肠50% L-WRN CM的褶皱变化，除gydF4y2BaDEFA5gydF4y2Ba，表现为相对于回肠50% L-WRN CM的褶皱变化(mean±SEM;每行N =3)。N.d，未检测到。* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001;通过单向方差分析和Tukey后验，****p<0.0001: F=7.23, p=0.0008 (a, rect);F=3.73, p=0.0210 (A, ile);F=3.53, p=0.0256 (B，矩形);F=6.24, p=0.0019 (B, ile); F=4.99, p=0.0060 (C, rect); F=6.16, p=0.0020 (C, ile); F=9.42, p=0.0001 (D, ile); F=9.05, p=0.0002 (E, duod); F=0.67, p=0.5777 (E, ile); F=17.33, p<0.0001 (F, duod); F=4.39, p=0.0151 (F, ile).

    人原代肠上皮细胞Transwell系统的开发gydF4y2Ba

    肠上皮细胞单层的生长对于生理过程的体外研究是必要的，例如细胞运输或分泌的分析或可能用于基于患者的分析的共培养实验。用其他培养方法对原代肠上皮细胞进行Transwell检测一直很困难，可能是由于无法产生足够数量的细胞。我们最近开发了一种用小鼠结肠上皮细胞形成功能性上皮单层的方法。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba我们采用这种方法在Transwell膜上培养人肠上皮细胞(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)．在播种3天内，直肠和回肠上皮细胞都形成了极化的单层，根尖刷状边界蛋白VILLIN 1和紧密连接蛋白ZO-1的H&E染色和免疫共染色证明了这一点(gydF4y2Ba图5gydF4y2BaA, B).杯状(muc2阳性)和内分泌(chga阳性)细胞群(gydF4y2Ba图5gydF4y2BaA、B)的比例与结肠表面或回肠绒毛上皮相似，其中杯状细胞占直肠和回肠单层上皮细胞总数的8.4%和8.7%，内分泌细胞占0.4%和1.0%。UEA-1凝集素可用于区分小鼠和人潘氏细胞gydF4y2Ba33gydF4y2Ba(见网上补充图S6)。我们在回肠中观察到罕见的UEA-1反应细胞，但在直肠中没有，单分子层(gydF4y2Ba图5gydF4y2BaB和数据未显示)。gydF4y2Ba

    Dissociated spheroid cells form polarised monolayers on Transwell membranes. (A and B) Spheroids were dissociated and seeded onto coated Transwell membranes to form epithelial monolayers. After 3 days, monolayers were used for measurement of transepithelial resistance (TER) and/or fixed and paraffin-embedded. Paraffin sections from rectal (A) and ileal (B) epithelial monolayers were stained for H&E or immunostained for VIL1 and ZO-1, MUC2 or chromogranin A (CHGA) (with UEA-1 lectin for ileal cells) to visualise differentiated cell types. (a) and (b) denote insets. Bars, 10 µm. (C) TER measurements are shown as the resistance × area product (Ω cm2) for three lines per intestinal region (mean±SEM; n=4 Transwells per line). (D) Representative confocal Z-stack images of ileal monolayer (most epithelial cells are GFP-positive, green) and fluorescent beads (red). The top image is a transverse view with white dashed lines denoting the apical surface of the epithelial layer and range of suspended beads and a yellow solid line indicating the measured mucus thickness. The lower image shows a tilted view of the transverse image. Bars, 10 µm. (E) Graph of mucus thickness measurements in rectal and ileal monolayers before (−) and after (+) disruption of the mucus layer by pipetting (mean±SEM; n=4–7 Transwells per bar). **p<0.01; ***p<0.001 by Student’s t-test comparing mucus thickness before and after disruption from the same region.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5gydF4y2Ba
    图5gydF4y2Ba

    分离的球形细胞在Transwell膜上形成极化单分子层。(A和B)球状体分离并播种到包被Transwell膜上形成上皮单分子层。3天后，单层测量经上皮阻力(TER)和/或固定和石蜡包埋。直肠(A)和回肠(B)上皮单层石蜡切片进行H&E染色，或免疫染色VIL1和ZO-1、MUC2或嗜铬粒蛋白A (CHGA)(回肠细胞用UEA-1凝集素)，以显示分化的细胞类型。(a)及(b)表示插图。棒，10 μ m。(C) TER测量显示为电阻×面积积(Ω cmgydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，每个肠区3条线(平均值±SEM;n=每行4个转井)。(D)回肠单层(大多数上皮细胞为gfp阳性，绿色)和荧光珠(红色)的代表性共聚焦Z-stack图像。上图为横切面，白色虚线表示上皮层的顶端表面和悬浮珠的范围，黄色实线表示测量到的粘液厚度。下面的图像显示了横向图像的倾斜视图。棒，10 μ m。(E)移液破坏黏液层(−)前和(+)后直肠和回肠单层黏液厚度测量图(均值±SEM;n=每杆4-7个transwell)。* * p < 0.01;***p<0.001通过Student 's t检验比较同一区域破坏前后的粘液厚度。gydF4y2Ba

    我们测试了在transwell上生长的上皮细胞的屏障功能。直肠和回肠单分子膜的平均TER分别为395和400 Ω cmgydF4y2Ba2gydF4y2Ba，分别表示屏障完整性(gydF4y2Ba图5gydF4y2BaC).我们还使用最近报道的小鼠组织外植体方法演示了黏液层。gydF4y2Ba21gydF4y2Ba在这些实验中，通过慢病毒感染标记EGFP的球形细胞(见在线补充图S7)被用来生成上皮单分子层。红色荧光珠(1微米直径)允许沉淀到黏液层。用共聚焦显微镜的Z-stack成像确定上皮细胞顶端表面与悬浮在粘液中的珠子之间的距离(gydF4y2Ba图5gydF4y2BaD).我们观察到一层粘液重复地覆盖在上皮单分子层的顶端表面(直肠和回肠单分子层分别为36和26µm厚;gydF4y2Ba图5gydF4y2BaE).据报道，移液吸除小鼠组织外植体的外层黏液层。gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba36gydF4y2Ba移液管抽吸后，我们发现回肠和直肠的黏液厚度明显减少(gydF4y2Ba图5gydF4y2BaE)，表明黏液层被机械解离破坏。gydF4y2Ba

    大肠杆菌gydF4y2Ba粘附于人原代肠上皮细胞gydF4y2Ba

    为了证明用培养的肠上皮细胞进行基于宿主的测定是可行的，并提供了标准细胞系测定所不知道的数据，我们比较了各种致泻剂的粘附性gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba菌株到原代肠上皮系和HeLa细胞(目前用于该试验的常规永生化细胞系)gydF4y2Ba37gydF4y2Ba)．我们首先使用肠聚集的野生型菌株(EAggEC;042及UD792)gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba或肠致病性(EPEC;B171及E2348/69)gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba先前在海拉细胞中证实的表型(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)．这些菌株在直肠和回肠上皮细胞上都能牢固地粘附，其模式与观察到的HeLa细胞相似(即，EAggEC的粘附更弥散，而EPEC的粘附更密集)。来自不同个体的上皮系也观察到类似的粘附模式(每个区域n=3)。非粘附的实验室菌株gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaORN172,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba正如预期的那样，通过视觉评估没有粘附任何细胞系(gydF4y2Ba图6gydF4y2BaA).定量测定每种菌株的RAI(见图例)证实了EPEC和EAggEc粘附的视觉评估，直肠和回肠上皮细胞的RAI值超过ORN172高达两个数量级(gydF4y2Ba图6gydF4y2BaB).这些数据也证实，与回肠细胞相比，EAggEC UD792菌株与直肠细胞的粘附性更强。gydF4y2Ba

    Development of a bacterial adherence assay for human intestinal spheroid cells. Rectal and ileal spheroids were grown on glass chamber slides for 3 days to promote two-dimensional cell growth prior to assessment, which allows for the visualisation of adherent bacteria. For adherence assays, rectal and ileal spheroid-derived epithelial cells were incubated with the indicated strains for 1 h followed by several washes to remove non-adherent Escherichia coli. Similarly treated HeLa cells served as a positive control for adherence. (A) Visual assessment of adherence phenotype was assessed by crystal violet staining (adherent bacteria are dark purple). Clustered and scattered adherence of the O157:H7 strain was observed with spheroid-derived epithelial cells (arrows). Bar, 30 µm. (B) qPCR was used to determine the relative adherence index (RAI) for the enteroaggregative E. coli (EAggEC), enteropathogenic E. coli (EPEC) and enterohemorrhagic (EHEC) strains (mean±SEM; n=4 per strain per cell type). The RAI for each wild-type E. coli is the ratio of malB to glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase divided by this ratio for ORN172 (represented by dashed line in EHEC strain graph), which is a non-adherent control. *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001 compared with HeLa cells by one-way analysis of variance followed by a Tukey's post-test: F=4.41, p=0.0463 (EAEC042); F=26.73, p=0.0002 (UD792); F=10.66, p=0.0042 (B171); F=27.35, p=0.0001 (E2348/69); F=19.04, p=0.0006 (O157:H7).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6gydF4y2Ba
    图6gydF4y2Ba

    人肠道球形细胞细菌粘附试验的建立。在评估之前，直肠和回肠球体在玻璃载玻片上生长3天，以促进二维细胞生长，这可以使粘附细菌可视化。为了进行粘附试验，直肠和回肠球形来源的上皮细胞与指示菌株孵育1小时，然后水洗几次以去除非粘附物gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba．同样处理的HeLa细胞作为粘附性的阳性对照。(A)通过结晶紫染色对粘附表型进行视觉评估(粘附菌为深紫色)。球形上皮细胞(箭头)观察到O157:H7株聚集和分散的粘附。Bar, 30µm。(B) qPCR检测肠内聚集物的相对粘附指数(RAI)gydF4y2BaEgydF4y2Ba．杆菌gydF4y2Ba(EAggEC),致肠病的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(EPEC)和肠出血性(EHEC)菌株(平均值±SEM;每种细胞株N =4)。每种野生型的RAIgydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba是gydF4y2BamalBgydF4y2Ba对ORN172 (EHEC应变图中虚线表示)进行非粘附对照。* p < 0.05;* * p < 0.01;通过Tukey's后验进行单向方差分析，与HeLa细胞相比，***p<0.001: F=4.41, p=0.0463 (EAEC042);F=26.73, p=0.0002 (UD792);F=10.66, p=0.0042 (B171);F=27.35, p=0.0001 (E2348/69);F=19.04, p=0.0006 (O157:H7)。gydF4y2Ba

    我们接下来评估肠出血患者的依从性gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaO157:H7株86-24 (gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba而异常罕见的HeLa细胞表现出任何粘附的细菌(见gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba和在线补充图S8)，弥漫粘附gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaO157:H7在直肠和回肠上皮细胞中很容易观察到(gydF4y2Ba图6gydF4y2BaA)。这些视觉观察结果得到了我们定量分析的支持，其中直肠和回肠上皮细胞的RAI值明显高于HeLa细胞(gydF4y2Ba图6gydF4y2BaB)。gydF4y2Ba

    讨论gydF4y2Ba

    在这里，我们描述了一种具有巨大潜力的人胃肠道上皮细胞培养系统，用于患者特异性分析。该系统的主要优点包括使用内窥镜活检组织作为起始材料和球体的快速扩展，这允许在与患者护理相称的时间框架内(约2-3周)从单个患者建立线。通过消除对手术标本的要求，可以分析来自广泛患者群体的球形培养，包括健康对照或根据年龄、基因型、诊断、疾病特征等预先选择的患者。gydF4y2Ba

    这种球形培养系统的另一个优点是方案相对简单。同样的方案可用于从任何可接近的胃肠道部位建立和保持椭球线，并且不需要细胞分选方案，例如其他方案所描述的方案。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba只要活检中含有足够数量的隐窝，我们几乎100%成功地从特定患者身上建立细胞系。这种高水平的重现性是重要的，因为需要在单次内镜手术后产生球体线，以便进行个性化评估。gydF4y2Ba

    活检材料也已成功应用于外植体/器官培养系统。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45-48gydF4y2Ba培养的外植体可以研究上皮细胞和邻近细胞(如常驻免疫细胞)之间的相互作用，而球形培养可以研究上皮特异性反应。球形培养系统的一个重要优势是能够建立和存储来自特定患者的细胞系，这样随着时间的推移，可以用同一细胞系进行多次实验。事实上，我们观察到，随着时间的推移，用相同的线条重复实验会产生相似的结果。此外，培养球体的快速生长和分化能力使我们能够获得所需的临界细胞质量，以进行各种功能分析，以评估干细胞/祖细胞或分化细胞的特征。这种分析方法很容易适用于其他上皮功能的分析、体外筛选和其他基于患者的分析。gydF4y2Ba

    黏液层是隔离宿主与腔内环境的物理屏障的重要组成部分，从而提供额外的保护免受潜在病原体的侵害。gydF4y2Ba49gydF4y2Ba我们发现球形肠上皮细胞产生黏液层，可以机械分离。这种破坏在回肠黏液中比在直肠黏液中更为突出，这一发现与体内研究一致，研究表明回肠中有一层松散的黏液层，大部分可以通过移液液去除，而结肠中有一层更复杂、更有抗性的黏液层。gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba36gydF4y2Ba

    EPEC粘附在直肠上皮细胞上是出乎意料的，因为这些生物通常被认为是小肠病原体，基于广泛的细胞生物学，该生物学专注于粘附在微绒毛上时产生的附着和去除病变gydF4y2Ba50gydF4y2Ba以及EPEC与非血性腹泻的经典关联。然而，一些报道描述了感染EPEC或EAggEC的患者出现出血性腹泻，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba和EPEC在人类感染期间粘附在结肠上，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba这表明这些细菌可能在结肠病理中起着作用。此外,gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaO157:H7菌株86-24与直肠和回肠上皮细胞粘附良好，而与HeLa细胞粘附极稀形成对比。gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba我们证实了这种表型。这些数据表明，原代人上皮细胞更适合于研究致腹泻的粘附表型gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba比永生细胞系更重要。这些表型也暗示了对肠道，特别是结肠细菌粘连素受体的新研究方向。有趣的是，尽管有相当多的结肠病理gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaO157:H7人类感染，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba几乎没有直接证据表明这种病原体能够粘附在这个器官的粘膜上gydF4y2Ba55gydF4y2Ba以及对细菌与结肠的直接相互作用缺乏明确的认识。gydF4y2Ba56gydF4y2Ba我们还提出了一种新的量化方法gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba使用统一技术(通过DNA扩增细菌和宿主细胞的单位点拷贝数)来规范细菌对真核细胞的粘附。这项技术扩展了先前使用肺上皮细胞的工作gydF4y2Ba57gydF4y2Ba以及人工点算肠细胞系粘附肠道病原体的qPCR。gydF4y2Ba58gydF4y2Ba

    微生物群在克罗恩病(CD)的发病机制中起着重要作用。gydF4y2Ba59 - 61gydF4y2Ba对于肠杆菌科(包括gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba)，gydF4y2Ba62 - 64gydF4y2Ba几项研究报告了更高比例的粘附性和侵入性gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba．gydF4y2Ba65 - 68gydF4y2Ba这些发现表明，过度生长的特定细菌，如粘附侵袭gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba，可能是乳糜泻炎症的驱动因素。gydF4y2Ba62gydF4y2Ba球形培养系统的一个优点是，它允许预选具有特定基因型的供体，因此，将允许研究潜在的乳糜泻易感性基因型-表型关系，这种关系被假设为影响肠上皮细胞对微生物的感知和反应。gydF4y2Ba69gydF4y2Ba因此，我们提出，本文所述的原代肠上皮细胞培养系统将提供一个信息丰富的实验平台，以测试可能影响这些细菌定植潜力的潜在宿主间变异。gydF4y2Ba

    致谢gydF4y2Ba

    作者感谢Bill Stenson博士对手稿的评论，感谢陈建huan、Themistocles Dassopoulos、Dayna Early、Alexandra Gutierrez、Kevin Korenblat、Deborah Rubin、Shelby Sullivan、Sandeep Tripathy和Jean Wang博士对活检组织的收集。我们感谢Kelly Monroe协助患者招募和同意，Wandy Beatty协助共聚焦成像，James Nataro博士提供菌株EAEC042。gydF4y2Ba

    参考文献gydF4y2Ba

    1. ↵gydF4y2Ba
      1. MaloygydF4y2BaKJgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 帕里gydF4y2BaFgydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba炎症性肠病的肠道稳态及其破坏gydF4y2Ba．gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba2011gydF4y2Ba；gydF4y2Ba474gydF4y2Ba：gydF4y2Ba298gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba306gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
    2. ↵gydF4y2Ba
      1. 曹gydF4y2BalgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. KuratnikgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 徐gydF4y2BaWgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba肠类器官作为组织替代物的发育:细胞组成和分化的表观遗传控制gydF4y2Ba．gydF4y2Ba摩尔CarcinoggydF4y2Ba首次在线发布:2013年9月21日。doi: 10.1002 / mc.22089gydF4y2Ba
    3. ↵gydF4y2Ba
      1. 福特汉姆gydF4y2BaRPgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. YuigydF4y2Ba年代gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 汉纳gydF4y2BaNRgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba扩张胎肠祖细胞移植有助于损伤后结肠再生gydF4y2Ba．gydF4y2Ba细胞干细胞gydF4y2Ba2013gydF4y2Ba；gydF4y2Ba13gydF4y2Ba：gydF4y2Ba734gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba44gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
    4. ↵gydF4y2Ba
      1. 荣格gydF4y2BaPgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 佐藤gydF4y2BaTgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. Merlos-SuarezgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba人结肠干细胞的分离与体外扩增gydF4y2Ba．gydF4y2BaNat地中海gydF4y2Ba2011gydF4y2Ba；gydF4y2Ba17gydF4y2Ba：gydF4y2Ba1225gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba
    5. ↵gydF4y2Ba
      1. 火山泥流gydF4y2BaNgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. LeigydF4y2Ba纽约gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 王gydF4y2BaJgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba肠上皮下肌成纤维细胞支持体外和体内人小肠上皮细胞的生长gydF4y2Ba．gydF4y2Ba《公共科学图书馆•综合》gydF4y2Ba2011gydF4y2Ba；gydF4y2Ba6gydF4y2Ba：gydF4y2Bae26898gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba
    6. ↵gydF4y2Ba
      1. 麦克拉肯gydF4y2Ba千瓦gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 豪厄尔gydF4y2BaJCgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 井gydF4y2BaJMgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba体外多能干细胞生成人体肠道组织gydF4y2Ba．gydF4y2BaNat ProtocgydF4y2Ba2011gydF4y2Ba；gydF4y2Ba6gydF4y2Ba：gydF4y2Ba1920gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba8gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba
    7. ↵gydF4y2Ba
      1. 三好gydF4y2BaHgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. AjimagydF4y2BaRgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 罗gydF4y2BaCTgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2BaWnt5a增强tgf - β信号通路促进组织损伤后结肠隐窝再生gydF4y2Ba．gydF4y2Ba科学gydF4y2Ba2012gydF4y2Ba；gydF4y2Ba338gydF4y2Ba：gydF4y2Ba108gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    8. ↵gydF4y2Ba
      1. 三好gydF4y2BaHgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. StappenbeckgydF4y2BaTSgydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba胃肠道干细胞在球形培养中的体外扩增和基因修饰gydF4y2Ba．gydF4y2BaNat ProtocgydF4y2Ba2013gydF4y2Ba；gydF4y2Ba8gydF4y2Ba：gydF4y2Ba2471gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba82gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba
    9. ↵gydF4y2Ba
      1. MustatagydF4y2Ba钢筋混凝土gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 瓦西gydF4y2BaGgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. Fernandez-VallonegydF4y2BaVgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba小鼠胎儿肠上皮lgr5不依赖球形生成祖细胞的鉴定gydF4y2Ba．gydF4y2Ba细胞代表gydF4y2Ba2013gydF4y2Ba；gydF4y2Ba5gydF4y2Ba：gydF4y2Ba421gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba32gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba
    10. ↵gydF4y2Ba
      1. OotanigydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 李gydF4y2BaXgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. SangiorgigydF4y2BaEgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba在wnt依赖的干细胞生态位内持续体外肠上皮培养gydF4y2Ba．gydF4y2BaNat地中海gydF4y2Ba2009gydF4y2Ba；gydF4y2Ba15gydF4y2Ba：gydF4y2Ba701gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba6gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba
    11. ↵gydF4y2Ba
      1. 佐藤gydF4y2BaTgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 斯坦格gydF4y2Ba德gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 费gydF4y2Ba米gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba人结肠、腺瘤、腺癌和巴雷特上皮的上皮类器官长期扩张gydF4y2Ba．gydF4y2Ba胃肠病学gydF4y2Ba2011gydF4y2Ba；gydF4y2Ba141gydF4y2Ba：gydF4y2Ba1762gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba72gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
    12. ↵gydF4y2Ba
      1. 佐藤gydF4y2BaTgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 弗里斯gydF4y2BaRGgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. SnippertgydF4y2Ba沪江gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba单个Lgr5干细胞在体外构建隐窝-绒毛结构，没有间充质小生境gydF4y2Ba．gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba2009gydF4y2Ba；gydF4y2Ba459gydF4y2Ba：gydF4y2Ba262gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
    13. ↵gydF4y2Ba
      1. 斯宾塞gydF4y2Ba小gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 梅休gydF4y2BaCNgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 兰金gydF4y2BaSAgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba人多能干细胞体外定向分化肠组织gydF4y2Ba．gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba2011gydF4y2Ba；gydF4y2Ba470gydF4y2Ba：gydF4y2Ba105gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
    14. ↵gydF4y2Ba
      1. 冯·弗斯滕伯格gydF4y2BaRJgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. GulatigydF4y2Ba作为gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 巴喜gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba用CD24筛选小鼠空肠上皮细胞，得到具有肠干细胞特征的细胞群gydF4y2Ba．gydF4y2BaAm J Physiol胃肠肝脏物理gydF4y2Ba2011gydF4y2Ba；gydF4y2Ba300gydF4y2Ba：gydF4y2BaG409gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba17gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    15. ↵gydF4y2Ba
      1. 王gydF4y2BaFgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 斯科维尔gydF4y2BaDgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 他gydF4y2BaXCgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba基于表面标记物组合和集落形成试验的肠干细胞分离和鉴定gydF4y2Ba．gydF4y2Ba胃肠病学gydF4y2Ba2013gydF4y2Ba；gydF4y2Ba145gydF4y2Ba：gydF4y2Ba383gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba95gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
    16. ↵gydF4y2Ba
      1. 阴gydF4y2BaXgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 截至gydF4y2Ba高频gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 范西文gydF4y2BaJHgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2BaLgr5+肠干细胞及其子代的生态位独立高纯度培养gydF4y2Ba．gydF4y2BaNat方法gydF4y2Ba2014gydF4y2Ba；gydF4y2Ba11gydF4y2Ba：gydF4y2Ba106gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba12gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
    17. ↵gydF4y2Ba
      1. 克洛茨gydF4y2BaCgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. AebischergydF4y2BaTgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. SeebergydF4y2BaFgydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba用于原生动物寄生虫繁殖和研究宿主-寄生虫相互作用的干细胞衍生细胞培养和类器官gydF4y2Ba．gydF4y2Ba国际医学微生物学gydF4y2Ba2012gydF4y2Ba；gydF4y2Ba302gydF4y2Ba：gydF4y2Ba203gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba
    18. ↵gydF4y2Ba
      1. KuratnikgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 谷俊侠gydF4y2BaCgydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba肠道类器官作为毒理学和药理学研究的组织替代品gydF4y2Ba．gydF4y2Ba生物化学杂志gydF4y2Ba2013gydF4y2Ba；gydF4y2Ba85gydF4y2Ba：gydF4y2Ba1721gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba6gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba
    19. ↵gydF4y2Ba
      1. 月亮gydF4y2BaCgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. VandussengydF4y2Ba吉隆坡gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 三好gydF4y2BaHgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba原发性小鼠肠上皮细胞单层培养系统的开发，以评估调节IgA转胞作用的因素gydF4y2Ba．gydF4y2Ba粘膜ImmunolgydF4y2Ba2014gydF4y2Ba；gydF4y2Ba7gydF4y2Ba：gydF4y2Ba818gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba28gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba
    20. ↵gydF4y2Ba
      1. 帕特尔gydF4y2Ba乐gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 三好gydF4y2BaHgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 比提gydF4y2Ba王gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba自噬蛋白通过增强活性氧的产生来控制杯状细胞的功能gydF4y2Ba．gydF4y2BaEMBO JgydF4y2Ba2013gydF4y2Ba；gydF4y2Ba32gydF4y2Ba：gydF4y2Ba3130gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba44gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    21. ↵gydF4y2Ba
      1. ErmundgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 舒特等人gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 约翰逊gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba小鼠胃、小肠和结肠粘液的研究。I.胃肠道黏液层有不同的性质取决于位置以及在Peyer's斑块gydF4y2Ba．gydF4y2BaAm J Physiol胃肠肝脏物理gydF4y2Ba2013gydF4y2Ba；gydF4y2Ba305gydF4y2Ba：gydF4y2BaG341gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    22. ↵gydF4y2Ba
      1. StelznergydF4y2Ba米gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. HelmrathgydF4y2Ba米gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 邓恩gydF4y2BaJCgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba肠道体外培养的命名法gydF4y2Ba．gydF4y2BaAm J Physiol胃肠肝脏物理gydF4y2Ba2012gydF4y2Ba；gydF4y2Ba302gydF4y2Ba：gydF4y2BaG1359gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba63gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    23. ↵gydF4y2Ba
      1. 巴克gydF4y2BaNgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 范西文gydF4y2BaJHgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. ▪库gydF4y2BaJgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba用标记基因Lgr5鉴定小肠和结肠干细胞gydF4y2Ba．gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba2007gydF4y2Ba；gydF4y2Ba449gydF4y2Ba：gydF4y2Ba1003gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
    24. ↵gydF4y2Ba
      1. TsilingirigydF4y2BaKgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 巴博萨gydF4y2BaTgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 廓羽gydF4y2BaGgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba健康和疾病中的益生菌和生物后活性:一种新型极化体外器官培养模型的比较gydF4y2Ba．gydF4y2Ba肠道gydF4y2Ba2012gydF4y2Ba；gydF4y2Ba61gydF4y2Ba：gydF4y2Ba1007gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba15gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    25. ↵gydF4y2Ba
      1. 金gydF4y2Ba卡gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. KakitanigydF4y2Ba米gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 赵gydF4y2BaJgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba人R-spondin1对肠上皮细胞有丝分裂的影响gydF4y2Ba．gydF4y2Ba科学gydF4y2Ba2005gydF4y2Ba；gydF4y2Ba309gydF4y2Ba：gydF4y2Ba1256gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    26. ↵gydF4y2Ba
      1. KorinekgydF4y2BaVgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 巴克gydF4y2BaNgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. MoerergydF4y2BaPgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba缺乏Tcf-4的小鼠小肠上皮干细胞室的耗竭gydF4y2Ba．gydF4y2BaNat麝猫gydF4y2Ba1998gydF4y2Ba；gydF4y2Ba19gydF4y2Ba：gydF4y2Ba379gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba83gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
    27. ↵gydF4y2Ba
      1. KuhnertgydF4y2BaFgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 戴维斯gydF4y2BaCRgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 王gydF4y2BaHTgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2BaDickkopf-1的腺病毒表达揭示了Wnt信号在成人小肠和结肠增殖中的必要要求gydF4y2Ba．gydF4y2Ba美国国家科学研究院gydF4y2Ba2004gydF4y2Ba；gydF4y2Ba101gydF4y2Ba：gydF4y2Ba266gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba71gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    28. ↵gydF4y2Ba
      1. 平托gydF4y2BaDgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. GregorieffgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. BegthelgydF4y2BaHgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba典型的Wnt信号对肠上皮的稳态至关重要gydF4y2Ba．gydF4y2Ba基因开发gydF4y2Ba2003gydF4y2Ba；gydF4y2Ba17gydF4y2Ba：gydF4y2Ba1709gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    29. ↵gydF4y2Ba
      1. 范德韦特林gydF4y2Ba米gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 桑丘gydF4y2BaEgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. VerweijgydF4y2BaCgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba-连环蛋白/TCF-4复合物对结直肠癌细胞施加隐窝祖细胞表型gydF4y2Ba．gydF4y2Ba细胞gydF4y2Ba2002gydF4y2Ba；gydF4y2Ba111gydF4y2Ba：gydF4y2Ba241gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba50gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
    30. ↵gydF4y2Ba
      1. 诺亚gydF4y2BaTKgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 多纳休gydF4y2BaBgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. ShroyergydF4y2BaNFgydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba肠道发育与分化gydF4y2Ba．gydF4y2BaExp Cell ResgydF4y2Ba2011gydF4y2Ba；gydF4y2Ba317gydF4y2Ba：gydF4y2Ba2702gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba10gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
    31. ↵gydF4y2Ba
      1. StappenbeckgydF4y2BaTSgydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba潘氏细胞发育，分化和功能:新的分子线索gydF4y2Ba．gydF4y2Ba胃肠病学gydF4y2Ba2009gydF4y2Ba；gydF4y2Ba137gydF4y2Ba：gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
    32. ↵gydF4y2Ba
      1. MiddendorpgydF4y2Ba年代gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. SchneebergergydF4y2BaKgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. WiegerinckgydF4y2BaCLgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba小肠中的成体干细胞在本质上具有特定位置的功能gydF4y2Ba．gydF4y2Ba干细胞gydF4y2Ba2014gydF4y2Ba；gydF4y2Ba32gydF4y2Ba：gydF4y2Ba1083gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba91gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba
    33. ↵gydF4y2Ba
      1. 福尔克gydF4y2BaPgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 罗斯gydF4y2Ba卡gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 戈登gydF4y2Ba霁gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba凝集素是确定小鼠肠道上皮细胞谱系分化程序的敏感工具gydF4y2Ba．gydF4y2BaAm J PhysiolgydF4y2Ba1994gydF4y2Ba；gydF4y2Ba266gydF4y2Ba：gydF4y2BaG987gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba1003gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    34. ↵gydF4y2Ba
      1. AtumagydF4y2BaCgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. StrugalagydF4y2BaVgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 艾伦gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba黏液黏液凝胶层在体内的厚度及物理状态gydF4y2Ba．gydF4y2BaAm J Physiol胃肠肝脏物理gydF4y2Ba2001gydF4y2Ba；gydF4y2Ba280gydF4y2Ba：gydF4y2BaG922gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
      1. 约翰逊gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 拉赫松gydF4y2BaJMgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 汉森gydF4y2BaGCgydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba结肠的两层黏液是由MUC2黏液蛋白组织的，而外层是宿主-微生物相互作用的立法者gydF4y2Ba．gydF4y2Ba美国国家科学研究院gydF4y2Ba2011gydF4y2Ba；gydF4y2Ba108gydF4y2Ba(1)gydF4y2Ba：gydF4y2Ba4659gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba65gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    36. ↵gydF4y2Ba
      1. 约翰逊gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 菲利普森gydF4y2Ba米gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. PeterssongydF4y2BaJgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba结肠内两层Muc2黏液依赖黏液层的内部没有细菌gydF4y2Ba．gydF4y2Ba美国国家科学研究院gydF4y2Ba2008gydF4y2Ba；gydF4y2Ba105gydF4y2Ba：gydF4y2Ba15064gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    37. ↵gydF4y2Ba
      1. NatarogydF4y2Ba摩根大通gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 燕麦饼干gydF4y2Ba简森-巴顿gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba致腹泻的大肠杆菌gydF4y2Ba．gydF4y2Ba临床微生物学RevgydF4y2Ba1998gydF4y2Ba；gydF4y2Ba11gydF4y2Ba：gydF4y2Ba142gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba201gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    38. ↵gydF4y2Ba
      1. DennogydF4y2BaDMgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 谢赫gydF4y2BaNgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 斯塔普gydF4y2Ba小gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba小儿急诊科腹泻病因:病例对照研究gydF4y2Ba．gydF4y2Ba临床感染病gydF4y2Ba2012gydF4y2Ba；gydF4y2Ba55gydF4y2Ba：gydF4y2Ba897gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba904gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    39. ↵gydF4y2Ba
      1. NatarogydF4y2Ba摩根大通gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 邓gydF4y2BaYgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. CooksongydF4y2Ba年代gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba志愿者肠道聚集性大肠杆菌毒力的异质性gydF4y2Ba．gydF4y2BaJ感染病gydF4y2Ba1995gydF4y2Ba；gydF4y2Ba171gydF4y2Ba：gydF4y2Ba465gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba8gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    40. ↵gydF4y2Ba
      1. 莱文gydF4y2Ba毫米gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. BergquistgydF4y2BaEJgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 纳gydF4y2Ba博士gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba大肠杆菌菌株引起腹泻，但不产生热不稳定或热稳定的肠毒素，是非侵入性的gydF4y2Ba．gydF4y2Ba《柳叶刀》gydF4y2Ba1978gydF4y2Ba；gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：gydF4y2Ba1119gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba22gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
    41. ↵gydF4y2Ba
      1. 莱利gydF4y2BaLWgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. JuniogydF4y2BaLNgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. LibaekgydF4y2Ba磅gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba脂多糖o抗原多糖在肠致病性大肠杆菌中的质粒编码表达gydF4y2Ba．gydF4y2Ba感染ImmungydF4y2Ba1987gydF4y2Ba；gydF4y2Ba55gydF4y2Ba：gydF4y2Ba2052gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba6gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    42. ↵gydF4y2Ba
      1. 伍德奥gydF4y2BaLDgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 罗素gydF4y2BaPWgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 哈里斯gydF4y2BaSLgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba利用染色体lacUV5启动子在大肠杆菌中快速、同步、稳定地诱导1型尿裂gydF4y2Ba．gydF4y2BaJ BacteriolgydF4y2Ba1993gydF4y2Ba；gydF4y2Ba175gydF4y2Ba：gydF4y2Ba2770gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba8gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    43. ↵gydF4y2Ba
      1. 舱底水gydF4y2Ba党卫军gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 不同gydF4y2BaJCgydF4y2Ba小gydF4y2Ba．gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 道尔gydF4y2Ba科幻小说gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba大肠杆菌O157:H7 O侧链在粘附中的作用和rfb位点的分析gydF4y2Ba．gydF4y2Ba感染ImmungydF4y2Ba1996gydF4y2Ba；gydF4y2Ba64gydF4y2Ba：gydF4y2Ba4795gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba801gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    44. ↵gydF4y2Ba
      1. 塔尔gydF4y2BaπgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 舱底水gydF4y2Ba党卫军gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 不同gydF4y2BaJCgydF4y2Ba小gydF4y2Ba．gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2BaIha:一种新的大肠杆菌O157:H7粘附赋予分子编码在最近获得的保守结构染色体岛上gydF4y2Ba．gydF4y2Ba感染ImmungydF4y2Ba2000gydF4y2Ba；gydF4y2Ba68gydF4y2Ba：gydF4y2Ba1400gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    45. ↵gydF4y2Ba
      1. 押尼珥gydF4y2Ba老gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. GuenthnergydF4y2Ba个人电脑gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. GuarnergydF4y2BaJgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba人结直肠外植体培养评价外用杀菌剂预防HIV感染gydF4y2Ba．gydF4y2BaJ感染病gydF4y2Ba2005gydF4y2Ba；gydF4y2Ba192gydF4y2Ba：gydF4y2Ba1545gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba56gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    46. ↵gydF4y2Ba
      1. AutrupgydF4y2BaHgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 巴雷特gydF4y2Ba拉gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 杰克逊gydF4y2Ba菲gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba人结肠的外植体培养gydF4y2Ba．gydF4y2Ba胃肠病学gydF4y2Ba1978gydF4y2Ba；gydF4y2Ba74gydF4y2Ba：gydF4y2Ba1248gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba57gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
    47. ↵gydF4y2Ba
      1. LosonskygydF4y2Ba遗传算法gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. FantrygydF4y2BaGTgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. ReymanngydF4y2Ba米gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba用于测量粘膜抗体产生的胃肠外植体系统的验证gydF4y2Ba．gydF4y2Ba临床诊断实验室免疫gydF4y2Ba1999gydF4y2Ba；gydF4y2Ba6gydF4y2Ba：gydF4y2Ba803gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba
    48. ↵gydF4y2Ba
      1. NicotragydF4y2Ba噢gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. VugydF4y2Ba米gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 哈维gydF4y2Ba废话gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba前列腺素乙醇酰胺减轻人外植体结肠炎模型损伤gydF4y2Ba．gydF4y2Ba前列腺素其他脂质介质gydF4y2Ba2013gydF4y2Ba；gydF4y2Ba100 - 101gydF4y2Ba：gydF4y2Ba22gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba
    49. ↵gydF4y2Ba
      1. McGuckingydF4y2Ba妈gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 林登gydF4y2BaSKgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 萨顿gydF4y2BaPgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba黏蛋白动力学与肠道病原体gydF4y2Ba．gydF4y2BaNat Rev微生物gydF4y2Ba2011gydF4y2Ba；gydF4y2Ba9gydF4y2Ba：gydF4y2Ba265gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba78gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba
    50. ↵gydF4y2Ba
      1. 迪安gydF4y2BaPgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 肯尼gydF4y2BaBgydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba肠致病性大肠杆菌的效应库:聚集在宿主细胞上gydF4y2Ba．gydF4y2BaCurr Opin微生物gydF4y2Ba2009gydF4y2Ba；gydF4y2Ba12gydF4y2Ba：gydF4y2Ba101gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
    51. ↵gydF4y2Ba
      1. BoketegydF4y2BaTNgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. WhittamgydF4y2BaTSgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 威尔逊gydF4y2Ba类风湿性关节炎gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba从西雅图儿童分离的具有肠道致病特征的大肠埃希菌的遗传和表型分析gydF4y2Ba．gydF4y2BaJ感染病gydF4y2Ba1997gydF4y2Ba；gydF4y2Ba175gydF4y2Ba：gydF4y2Ba1382gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    52. ↵gydF4y2Ba
      1. RothbaumgydF4y2BaRgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 麦克亚当斯gydF4y2BaAJgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. GiannellagydF4y2BaRgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba肠细胞粘附大肠杆菌的临床病理研究:婴儿腹泻的一个原因gydF4y2Ba．gydF4y2Ba胃肠病学gydF4y2Ba1982gydF4y2Ba；gydF4y2Ba83gydF4y2Ba：gydF4y2Ba441gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba54gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
    53. ↵gydF4y2Ba
      1. RothbaumgydF4y2BaRJgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 你的gydF4y2BaJCgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. SaalfieldgydF4y2BaKgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba婴儿肠道致病性大肠杆菌感染的超微结构研究gydF4y2Ba．gydF4y2BaUltrastruct分册gydF4y2Ba1983gydF4y2Ba；gydF4y2Ba4gydF4y2Ba：gydF4y2Ba291gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba304gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba
    54. ↵gydF4y2Ba
      1. 格里芬gydF4y2Ba点gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 奥姆斯戴德gydF4y2Ba信用证gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 佩特拉gydF4y2Ba再保险gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba大肠杆菌O157: h7相关结肠炎。11例临床及组织学研究gydF4y2Ba．gydF4y2Ba胃肠病学gydF4y2Ba1990gydF4y2Ba；gydF4y2Ba99gydF4y2Ba：gydF4y2Ba142gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
    55. ↵gydF4y2Ba
      1. 凯利gydF4y2BaJgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. OryshakgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. WenetsekgydF4y2Ba米gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba大肠埃希菌O157:H7感染的结肠病理gydF4y2Ba．gydF4y2BaAm J Surg PatholgydF4y2Ba1990gydF4y2Ba；gydF4y2Ba14gydF4y2Ba：gydF4y2Ba87gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba92gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
    56. ↵gydF4y2Ba
      1. 菲利普斯gydF4y2Ba广告gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. NavabpourgydF4y2Ba年代gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 希克斯gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba肠出血性大肠杆菌O157:H7靶向人的Peyer's斑块，并在人和牛肠道中引起附着/消除病变gydF4y2Ba．gydF4y2Ba肠道gydF4y2Ba2000gydF4y2Ba；gydF4y2Ba47gydF4y2Ba：gydF4y2Ba377gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba81gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    57. ↵gydF4y2Ba
      1. 莱特gydF4y2BaCgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 赫伯特gydF4y2BaGgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 皮尔金顿gydF4y2BaRgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2BaReal-time PCR方法定量测定附着在肺上皮细胞上的冠状伯克霍尔德菌复合体及其抑制作用gydF4y2Ba．gydF4y2Ba莱特应用微生物gydF4y2Ba2010gydF4y2Ba；gydF4y2Ba50gydF4y2Ba：gydF4y2Ba500gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba6gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba
    58. ↵gydF4y2Ba
      1. 烛光gydF4y2Ba米gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. SeiboldgydF4y2BaGgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 维塔利gydF4y2BaBgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba细菌粘附Caco-2细胞的实时PCR定量:双歧杆菌与肠道病原体之间的竞争gydF4y2Ba．gydF4y2BaRes MicrobiolgydF4y2Ba2005gydF4y2Ba；gydF4y2Ba156gydF4y2Ba：gydF4y2Ba887gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba95gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
    59. ↵gydF4y2Ba
      1. Darfeuille-MichaudgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba粘附-侵袭性大肠杆菌:一种与克罗恩病相关的假定的新大肠杆菌病型gydF4y2Ba．gydF4y2Ba国际医学微生物学gydF4y2Ba2002gydF4y2Ba；gydF4y2Ba292gydF4y2Ba：gydF4y2Ba185gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba93gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
    60. ↵gydF4y2Ba
      1. 卡泽尔gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. ZeissiggydF4y2Ba年代gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 布隆伯格gydF4y2BaRSgydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba炎症性肠病gydF4y2Ba．gydF4y2Ba免疫年鉴gydF4y2Ba2010gydF4y2Ba；gydF4y2Ba28gydF4y2Ba：gydF4y2Ba573gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba621gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
    61. ↵gydF4y2Ba
      1. 主gydF4y2BaPgydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba炎症性肠病中的菌群gydF4y2Ba．gydF4y2Ba挖说gydF4y2Ba2009gydF4y2Ba；gydF4y2Ba27gydF4y2Ba(1)gydF4y2Ba：gydF4y2Ba99gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba103gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba
    62. ↵gydF4y2Ba
      1. BaumgartgydF4y2Ba米gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 多根gydF4y2BaBgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. RishniwgydF4y2Ba米gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba回肠粘膜独立培养分析显示，在克罗恩病累及回肠的侵袭性大肠埃希菌相对于梭状芽孢杆菌的耗竭有选择性增加gydF4y2Ba．gydF4y2BaISME JgydF4y2Ba2007gydF4y2Ba；gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：gydF4y2Ba403gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba18gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
    63. ↵gydF4y2Ba
      1. 弗兰克gydF4y2BaDNgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 圣阿曼达gydF4y2Ba艾尔gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 费尔德曼gydF4y2Ba类风湿性关节炎gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba人类炎症性肠病中微生物群落失衡的分子系统发育特征gydF4y2Ba．gydF4y2Ba美国国家科学研究院gydF4y2Ba2007gydF4y2Ba；gydF4y2Ba104gydF4y2Ba：gydF4y2Ba13780gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    64. ↵gydF4y2Ba
      1. Martinez-MedinagydF4y2Ba米gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. AldeguergydF4y2BaXgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. Gonzalez-HuixgydF4y2BaFgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳显示克罗恩病患者回结肠黏膜微生物群组成异常gydF4y2Ba．gydF4y2Ba肠炎gydF4y2Ba2006gydF4y2Ba；gydF4y2Ba12gydF4y2Ba：gydF4y2Ba1136gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba45gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
    65. ↵gydF4y2Ba
      1. BoudeaugydF4y2BaJgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 格拉瑟gydF4y2Ba艾尔gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. MasseretgydF4y2BaEgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba从克罗恩病患者回肠粘膜分离出的大肠埃希菌的侵袭能力gydF4y2Ba．gydF4y2Ba感染ImmungydF4y2Ba1999gydF4y2Ba；gydF4y2Ba67gydF4y2Ba：gydF4y2Ba4499gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba509gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    66. ↵gydF4y2Ba
      1. 伯克gydF4y2Ba达gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 轴突gydF4y2Ba在gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba炎症性肠病和感染性腹泻中的黏附性大肠杆菌gydF4y2Ba．gydF4y2BaBMJgydF4y2Ba1988gydF4y2Ba；gydF4y2Ba297gydF4y2Ba：gydF4y2Ba102gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    67. ↵gydF4y2Ba
      1. Darfeuille-MichaudgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. 中性粒细胞gydF4y2BaCgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. BarnichgydF4y2BaNgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      4. 等gydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba克罗恩病患者回肠黏膜中粘附大肠杆菌菌株的存在gydF4y2Ba．gydF4y2Ba胃肠病学gydF4y2Ba1998gydF4y2Ba；gydF4y2Ba115gydF4y2Ba：gydF4y2Ba1405gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
    68. ↵gydF4y2Ba
      1. GiaffergydF4y2BaMHgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. HoldsworthgydF4y2BaCDgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 杜尔登gydF4y2BaBIgydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba从炎症性肠病患者分离的大肠杆菌菌株的毒力特性gydF4y2Ba．gydF4y2Ba肠道gydF4y2Ba1992gydF4y2Ba；gydF4y2Ba33gydF4y2Ba：gydF4y2Ba646gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba50gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
    69. ↵gydF4y2Ba
      1. 豪尔gydF4y2BaBgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      2. GardetgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
      3. 泽维尔gydF4y2BaRJgydF4y2Ba
      ．gydF4y2Ba炎症性肠病的遗传学和发病机制gydF4y2Ba．gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba2011gydF4y2Ba；gydF4y2Ba474gydF4y2Ba：gydF4y2Ba307gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba17gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba

    补充材料gydF4y2Ba

    • 补充数据gydF4y2Ba

      此网页文件由BMJ出版集团从作者提供的电子文件制作而成，并没有对内容进行编辑。gydF4y2Ba

      本数据补充文件:gydF4y2Ba

    脚注gydF4y2Ba

    • 贡献者gydF4y2BaKLV、HM、CM、NS、PIT、MAC和TSS对研究概念和设计做出了贡献。JMM和MAC对内窥镜检查程序和临床记录做出了贡献。KLV和JMM有助于细胞系的建立。KLV进行上皮细胞实验。NS执行gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba化验的坚持。KLV、HM、NS、PIT、MAC和TSS有助于数据的分析和解释。KLV和TSS起草了手稿。所有作者都对手稿进行了批判性的修改。MAC和TSS获得了资金并监督了这项研究。gydF4y2Ba

    • 资金gydF4y2Ba这项工作得到了NIH的支持(授予DK071619, DK089016, DK100737, DK90251和DK102557;粘膜免疫研究小组转化试点项目和青年研究者试点奖，家长资助AI095550)和美国克罗恩病和结肠炎基金会(CCFA)遗传学和微生物组财团。KLV由NIH培训补助金(T32 AI007163)和CCFA研究奖学金资助。华盛顿大学消化系统疾病研究核心中心由美国国家糖尿病、消化系统和肾脏疾病研究所(NIDDK) (P30DK052574)资助。gydF4y2Ba

    • 相互竞争的利益gydF4y2Ba一个也没有。gydF4y2Ba

    • 伦理批准gydF4y2Ba华盛顿大学医学院机构审查委员会。gydF4y2Ba

    • 出处和同行评审gydF4y2Ba不是委托;外部同行评审。gydF4y2Ba

    相关的文章gydF4y2Ba