半桥粒完整性保护对结肠炎结肠和直肠癌|肠道

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炎症性肠病

原文

半桥粒完整性保护对结肠炎结肠和直肠癌

阿黛尔德Arcangelis1,2,3,4,
侯赛因Hamade1,2,3,4,5,
法比安Alpy2,3,4,6,7,
Sylvain诺曼德8,
艾米莉Bruyere9,
奥利弗Lefebvre4,6,10,11,
艾格尼丝Mechine-Neuville6,12,13,
斯蒂芬妮Siebert1,2,3,4,
薇罗尼卡费1,2,3,4,
帕特里夏·理14,
帕特里斯Laquerriere4,15,
Doulaye Dembele1,2,3,4,
安妮Delanoye-Crespin8,
苏菲Rodius1,2,3,4,16,
西尔维Robine17,18,
米歇尔保证4,6,
伊莎贝尔·Seuningen9,
帕特丽夏Simon-Assmann4,6,10,11,
马赛厄斯Chamaillard8,
米歇尔Labouesse1,2,3,4,19,
伊丽莎白Georges-Labouesse1,2,3,4

¹部门的发展和干细胞,de Genetique研究所等生物Moleculaire et Cellulaire (IGBMC),斯特拉斯堡大学,Illkirch、法国
²由U964,Illkirch、法国
³CNRS UMR 7104,Illkirch、法国
⁴斯特拉斯堡大学,斯特拉斯堡、法国
⁵当前地址:f . Widjaja炎症性肠&免疫生物学研究所,基础医学系,雪松西奈山医学中心,洛杉矶美国加利佛尼亚
⁶Inserm、U1109 MNT3团队,斯特拉斯堡、法国
⁷当前地址:功能基因组学和癌症,IGBMC,Illkirch、法国
⁸CNRS Inserm,楚里尔,巴斯德研究所德里尔U1019-UMR 8204 -民事中心d 'Infection et d 'Immunite德里尔大学德里尔,里尔、法国
⁹由大学德里尔CHRU里尔,UMR-S 1172 - jean - pierre《研究中心,里尔、法国
¹⁰LabEx Medalis,斯特拉斯堡大学,斯特拉斯堡、法国
¹¹医学院学习Translationnelle斯特拉斯堡联合会(fmt),斯特拉斯堡、法国
¹²友谊医院CHRU斯特拉斯堡Hautepierre、服务d 'anatomo-pathologie,斯特拉斯堡、法国
¹³当前地址:de Pathologie,Bergonie研究所,波尔多、法国
¹⁴benoir INRA UMR1319-MICALIS研究所,大学Paris-Saclay,案例、法国
¹⁵CNRS UMR 7178,休伯特Curien Pluridisciplinaire研究所,斯特拉斯堡、法国
¹⁶当前地址:神经肿瘤学学会举办NORLUX实验室,CRP-Sante、卢森堡
¹⁷居里研究所,巴黎、法国
¹⁸CNRS UMR 144,巴黎、法国
¹⁹大学当前地址:UMR7622 ibp,皮埃尔和玛丽·居里,巴黎、法国

对应到阿黛尔德Arcangelis IGBMC 1街Laurent薯条,f - 67400 Illkirch,法国;阿黛尔在{}igbmc.fr米歇尔•Labouesse UMR7622, ibp UPMC 9法国圣伯纳德狗,f - 75005巴黎,法国;michel.labouesse在{}upmc.fr

文摘

客观的流行病学和临床数据表明,与长期患有炎症性肠病结肠炎显示更高的风险开发结直肠高档发育不良。而癌浸润和转移依赖于基底膜(BM)中断,缺乏实验证据对上皮细胞的潜在贡献/ BM锚地炎症发作和随后的肿瘤转变炎性病变。这里,我们分析的角色α6β4整合素受体在半桥粒发现附加肠道上皮细胞(iec) laminin-containing BM。

设计我们开发了新的小鼠模型诱导IEC-specific消融α6整合素在开发过程中(α6^ΔIEC)或在成人(α6^ΔIEC-TAM)。

结果引人注目的是,所有α6^ΔIEC突变小鼠自发发展长期结肠炎,退化加班为浸润癌。事件的序列导致疾病发作需要半桥粒中断,BM超然,地震由iec生产过剩,增生和增强肠道通透性。同样,IEC-specific消融α6整合素诱导成年老鼠(α6^ΔIEC-TAM)导致完全渗透结肠炎和肿瘤进展。而广谱抗生素治疗降低组织病理学和IL-1β分泌物浸润骨髓细胞,它未能减少Th1和Th17响应。有趣的是,虽然最初的肠道炎症发生独立于适应性免疫系统,tumourigenesis要求B和T淋巴细胞活化。

结论我们首次提供证据证明损失的iec / BM交互由半桥粒中断触发启动炎性病变进展到高档的发展发育不良和癌。结直肠肿瘤小鼠模型中类似IBD患者,使其极具吸引力的发现更有效的疗法。

肠道屏障功能
结肠直肠癌
炎症性肠病
整合蛋白
细胞基质的相互作用

这是一个开放的分布式条依照创作共用署名非商业性(4.0 CC通过数控)许可证,允许别人分发,混音,适应,建立这个工作非商业化,和其派生作品在不同的条款进行许可,提供了最初的工作是正确地引用和非商业使用。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl - 2015 - 310847

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视频1

本研究的意义

已知在这个问题上是什么?

损失的主要层粘连蛋白受体在半桥粒,即α6β4整合素,导致严重的皮肤屏障缺陷小鼠和人类。
全基因组关联研究暗示的潜在含义基底膜(BM)层粘连蛋白倾向IBD和结直肠癌(CRC)。层粘连蛋白的表达和分布在IBD患者和CRC改变。
众多细胞因子已被证明影响疾病进展,连同interleukin-18(地震),导致监管的杯状细胞(GCs)和维护肠道屏障功能。
肿瘤免疫监视作用被认为是在IBD患者长期广泛的结肠炎受损。

有什么新发现吗?

老鼠携带肠道上皮细胞(IEC)特殊损失α6整合素开发完全渗透结肠炎自发退化成的直肠粘膜癌是最强烈的环境压力。
结肠炎的发病之前是有缺陷的突变iec的安克雷奇大英博物馆由于失去半桥粒,导致一个强大的激活caspase-1导致地震的分泌,调节GC功能。
结肠炎是独立的T细胞和B细胞的激活,但依赖于地震-上皮分泌的增加和重要的肠道CD11b积累⁺骨髓细胞oversecrete IL-1β细菌易位的结果有缺陷的粘液屏障。广谱抗生素治疗部分改善结肠炎。
的风险发育不良导致CRC依赖于适应性免疫反应的激活。

它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?

我们的研究结果显示,上皮屏障/ BM连接起着至关重要的作用在维护肠道完整性和体内平衡,有助于形成一个高效的上皮细胞和粘液屏障。改善削弱上皮/ BM交互和恢复功能由针对上皮粘液屏障的地震/ IL-18R信号和通过饮食,减少机械应力可能代表小说在炎症性肠病的治疗途径。
我们的研究结果强调il - 1的细胞因子家族的至关重要的作用在炎性病变进展为肠癌腺癌。这项工作表明,肿瘤进展在IBD可以改善或减缓通过减少炎性环境介导的il - 1 / IL-1R与特定的药物或中和抗体。

介绍

肠道内稳态取决于细上皮之间的共生关系,免疫系统和共生的细菌存在于腔。黏液层的两极分化肠道上皮细胞,其细胞的顶面和基底膜(BM)在其基础方面,扮演着中心角色建立共生关系的屏障功能必不可少的肠道微生物群。1 - 3妥协与肠道内稳态可能导致疾病,如炎症性肠病。炎症性肠病复发缓和的疾病,它可以发展成结直肠癌(CRC)患者长期广泛的结肠炎。4 - 6免疫系统失调,黏液层变化,异常的内质网应激反应和异常信息连接与炎症性肠病的发展。1,7,8然而,如何通过整合素受体之间的相互作用介导上皮及其潜在的BM有助于保持肠道内稳态被人们忽视了。9

这些交互是半桥粒的主要球员,由在特定连接出席了基地的肠上皮细胞(iec)α6β4整合素连接大英博物馆层粘连蛋白- 332通过cytoplasmic-linker蛋白plectin角蛋白细丝。10,11有趣的是,一些BM有关的基因研究间接层粘连蛋白及其受体整合素几种肠道疾病。首先,genome-wide-association研究已经确定了LAMB1(编码层粘连蛋白β1链;协会之间的概率10⁻⁶和3×10⁻⁸),LAMC1(编码层粘连蛋白γ1链;协会概率10⁻⁷)位点易感性位点诱发炎症性肠病12,13和CRC,14分别。肠道侵蚀最重要的是,让人联想到IBD患者被发现患有皮肤疾病,是由半桥粒缺陷引起的。15相反,IBD患者可能出现牛皮癣等皮肤损伤,16皮肤炎症缺陷中观察到小鼠缺乏α6基底角质细胞整合素。17

调查的潜在作用α6β4整合素在肠道内稳态,我们生成的两个整合素的小鼠模型携带一个有针对性的删除α6基因(Itga6)在iec,命名为α6^ΔIEC线或三苯氧胺(TAM)诱导删除α6命名^ΔIEC-TAM线。引人注目的是,所有α6^ΔIEC和α6^ΔIEC-TAM变异动物开发长期广泛的结肠炎。最重要的是,炎症病变自发和逐步沦为浸润结直肠α6腺癌^ΔIEC老鼠,以及α6^ΔIEC-TAM模型。描述两种模型演示了中央保护作用保护肠上皮细胞/ BM连接的体内平衡和防止colitis-associated癌症的风险。

结果

Epithelial-specific基因消融Itga6影响肠道半桥粒

的角色来分析α6整合素在肠道内稳态,我们第一次感应完全删除Itga6在iec使用Cre-lox方法18(α6^ΔIEC;图1一个和在线补充图S1)。结果动物显示异常宽松和粘性粪便,并且经常开发了一个直肠脱垂(图1B)。这种表型与半桥粒是否改变,我们检查了β4整合素链,α6的半桥粒heterodimerising伙伴,发现链都从iec在所有阶段检查(见图1汉英和在线补充图S2A, B)。相比之下,上皮细胞整合素的表达β1,也会与其他α链heterodimerise,没有变化(见在线补充图S2C),确认缺陷在这些老鼠起源于亏损的α6β4上皮细胞整合素。

Efficient deletion of Itga6 in α6^ΔIEC mice results in compromised hemidesmosomes and epithelial fragility. (A) Strategy to generate an intestinal epithelium-specific Itga6 knockout (for details, see online supplementary figure S1A). The Itga6 floxed allele (α6 ^fl ) was obtained after insertion of two loxP cassettes (green triangles) at the Itga6 3′ end including the TM and the cytoplasmic A and B (α6A; α6B) exons. Crossing of the α6 ^fl/fl mice with the transgenic Villin-Cre line results in a truncated Itga6 copy, denoted α6^ΔIEC. (B) Morphology of the colorectal region in 15-week-old WT and α6^ΔIEC mice. White stars indicate stools. Scale bars, 5 mm. (C–H) Immunodetection of hemidesmosome markers in the colon of E16.5 embryos (C and D) and in intestinal segments of mice aged 9–16 weeks (E–H); (E) rectum; (F and G) jejunum; (H) colon; 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) marks nuclei (blue). (C and E) α6-integrin chain and (D) β4-integrin chain (green) with the mucin Muc2 (red). The remaining signal in (C and E) corresponds to α6 integrin in blood vessels, confirming the specificity of the deletion in the epithelium. (F) Plectin and (G) K8/K18 intermediate filaments (green), with collagen IV (red). (H) Laminin-γ2 chain (green). White arrows, epithelium/lamina propria interface; yellow arrowheads, hemidesmosome patches; stars, areas of epithelial detachment in mutants. Scale bars, 50 µm. (I) Histological analysis of the colon from 3-week-old mice; bracket, detached cells from the surface epithelium. Scale bar, 100 µm. (J) Scattered dot plots showing the protein concentration of epithelial cell lysates obtained from small intestinal tissue of pups aged 2 (P2) and 14 (P14) days submitted to a detachment assay; error bars, SD; *p<0.05, **p<0.01. (K) Scattered dot plots showing the plasma concentration of FITC-dextran (FD4) as a measurement of intestinal permeability in 6-week-old animals fed with FD4; error bars, SD; ****p<10⁻⁴. A, anus; C, colon; e, epithelium; lp, lamina propria; lu, lumen; m, muscle layer; mes, mesenchyme; P, prolapse; R, rectum; TM, transmembrane; w, weeks; WT, wildtype.

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图1

有效的删除Itga6在α6^ΔIEC老鼠导致妥协半桥粒和上皮脆弱。(一)生成一个肠道epithelium-specific策略Itga6击倒(详情,请参阅在线补充图S1A)。的Itga6液氧等位基因(α6^fl)插入后得到两个loxP磁带(绿色的三角形)Itga63′末端包括TM和胞质A和B(α6A;α6B)外显子。穿越的α6^{fl / fl}与转基因小鼠Villin-Cre行导致截断Itga6复制,表示α6^ΔIEC。(B)的形态结直肠地区15-week-old WTα6^ΔIEC老鼠。白色星星表示凳子。规模酒吧、5毫米。(碳氢键)的半桥粒标记Immunodetection E16.5胚胎的结肠(C和D)和肠段的老鼠年龄在9到16周(情况);(E)直肠;空肠(F和G);(H)结肠;4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)是核(蓝色)。(C和E)α6-integrin链和(D)β4-integrin链(绿色)和粘蛋白Muc2(红色)。剩余的信号(C和E)对应于α6整合素在血管中,确认删除在上皮细胞的特异性。 (F) Plectin and (G) K8/K18 intermediate filaments (green), with collagen IV (red). (H) Laminin-γ2 chain (green). White arrows, epithelium/lamina propria interface; yellow arrowheads, hemidesmosome patches; stars, areas of epithelial detachment in mutants. Scale bars, 50 µm. (I) Histological analysis of the colon from 3-week-old mice; bracket, detached cells from the surface epithelium. Scale bar, 100 µm. (J) Scattered dot plots showing the protein concentration of epithelial cell lysates obtained from small intestinal tissue of pups aged 2 (P2) and 14 (P14) days submitted to a detachment assay; error bars, SD; *p<0.05, **p<0.01. (K) Scattered dot plots showing the plasma concentration of FITC-dextran (FD4) as a measurement of intestinal permeability in 6-week-old animals fed with FD4; error bars, SD; ****p<10⁻⁴。一、肛门;C,结肠;e,上皮细胞;lp,固有层;陆,腔;米,肌肉层;mes,间质;P,脱垂;R,直肠; TM, transmembrane; w, weeks; WT, wildtype.

补充材料

[gutjnl - 2015 - 310847 - supp.pdf]

我们下一个测试Itga6半桥粒的损耗在iec大会受损组件plectin和随后的角蛋白8/18 (K8/18)。Plectin,这与β4整合蛋白胞质域,中检测出hemidesmosomal顶端膜的基底补丁和控制iec (图1在α6 F)。^ΔIEC老鼠,plectin染色强烈降低基底而不是水;损失的基底plectinα6已经观察到晚^ΔIEC胚胎(见图1F和在线补充图S2D)。此外,K8/18中间丝二聚体,通常是集中在基底plectin补丁,被广泛地分布于整个胞质(图1克)。因此,上皮细胞的形状出现不如在控件(柱状和更多的立方形的图1克)。尽管有这些强大的缺陷,上皮细胞顶端的两极化分布特征标记保留villin,微绒毛和紧密连接的结构组成部分标记cingulin / MAP115(见在线补充图S3)。因此,像在皮肤有核的I型半桥粒(包含BP180 BP230),17,月19 - 21日α6β4整合素对装配II型半桥粒至关重要(缺乏BP180和BP230)存在于肠道,但并不导致上皮细胞极性。

肠道半桥粒损失对肠道屏障功能的影响

失去α6β4整合素在皮肤上影响上皮的完整性。17,月19 - 21日突变体肠,胶原IV和plectin costaining透露,上皮细胞层往往脱离其BM和在底下的固有层(图1F, G),而不会影响hemidesmosomal的分布层粘连蛋白γ2链(图1H)。从出生后3周,在突变体肠上皮分离观察领域(见图1我在网上和补充图S4),这表明半桥粒的破坏导致上皮削弱和丧失公司锚地大英博物馆。确认这些观察中,我们使用一个修改的IEC分离方法22控制和变异上皮受到乙二胺四乙酸(EDTA)治疗和温和搅拌来评估他们的能力抵抗轻微的机械应力。上皮脆弱性是变异显著增加肠道与控制早在2天产后(P2),并成为更加突出好(图1J)。改变影响肠道渗透性IBD患者经常观察和反映上皮屏障功能障碍。23检查如果这些功能障碍发生在突变小鼠,我们量化体内肠道渗透性喂养小鼠异硫氰酸荧光素(FITC)右旋糖酐和测量FITC的血浆水平。肠道通透性是α6显著增加^ΔIEC老鼠(图1K)。因此,α6整合素损失iec削弱半桥粒形成,上皮细胞形态和肠道屏障功能。

α6^ΔIEC小鼠自发发展长期广泛的结肠炎

肠道屏障的缺陷往往会导致炎症,1我们在α6检查其潜在的发生^ΔIEC老鼠。我们观察到明显的炎症在所有突变体6到8周的年龄作为临床说明了宽松和/或血便,直肠脱垂和粘液放电相比,他们控制的同胞(见图1 b和2),肠壁增厚出现在大肠癌区域(图2B),组织学得分恶化从出生后3周(图2C)。突变体远端结肠隐窝平均两次延长(图2D, F)。早在3周的年龄,增殖率也显著增加结肠和直肠的突变体而不是空肠作为bromodeoxyuridin由染色(BrdU)合并(见图2E, G和在线补充图S5A)。这些特性(图2)认为α6^ΔIEC老鼠从断奶开始自发发展长期广泛的结肠炎。

α6^ΔIEC Mice develop colitis soon after weaning. (A) Representative images of WT and α6^ΔIEC adult colons observed by mini-endoscopy. Black arrow, lesion affecting the mutant mucosa; arrowheads, presence of abundant mucinous material in the lumen of the mutant colon. (B) Longitudinal H&E stained sections of the recto-anal region from animals aged 15 weeks. The bracket in mutants highlights the hyperplasia in mucosa and thickened muscle layers (arrowheads, ulcerated surface). Scale bars, 500 µm. (C) Histological scores displayed as scattered dot plots (error bars, SD) measured in the proximal and distal colons of WT and α6^ΔIEC mice from 2 to 9 weeks (w) of age. (D) Transverse H&E stained sections of the distal colons of WT and α6^ΔIEC mice at 4 weeks. Double arrows, crypt height. Scale bar, 50 µm. (E) Immunohistochemical BrdU detection (brown nuclei) on colon sections of 3-week-old animals; dashed lines and double arrows, area of expanded proliferation in the mutant colon. Scale bar, 50 µm. (F and G) Proliferation and crypt height measurement in colons of WT and α6^ΔIEC mice aged 2 and 3 weeks, and adult stages displayed as scattered dot plots (error bars, SD). (F) Quantification of crypt height. (G) Quantification of BrdU-positive cells. *p<0.05, **p<0.01. e, epithelium; lu, lumen; ns, not significant; w, weeks; WT, wildtype.

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图2

α6^ΔIEC开发结肠炎小鼠断奶后不久。(一)代表WT和α6的图像^ΔIEC成人冒号mini-endoscopy观察到。黑色箭头,影响突变体粘膜病变;箭头,腔中存在的大量粘液性物质的变异结肠。(B)纵向)的彩色部分recto-anal地区从动物年龄在15周。突变体的托架凸显了增生增厚在粘膜和肌肉层(箭头,溃烂面)。酒吧,规模500µm。(C)组织学评分显示为散点图(误差,SD)测量的近端和远端冒号WTα6^ΔIEC老鼠从2到9周(w)的年龄。(D)横向圆)的彩色部分远端WT和α6冒号^ΔIEC老鼠在4周。双箭头,地下室的高度。酒吧,规模50µm。布朗(E)免疫组织化学BrdU检测(核)的质询的结肠部分动物;虚线和双箭头,面积扩大突变结肠癌扩散。酒吧,规模50µm。(F和G)增殖和地下室高程测量WT和α6冒号^ΔIEC小鼠年龄2和3周,和成人阶段显示为散点图(误差,SD)。(F)量化地下室的高度。(G)量化BrdU-positive细胞。* * * p < 0.05, p < 0.01。e,上皮细胞;陆,腔;ns,不重要;w,周;WT,野生型。

在α6结肠炎严重程度^ΔIEC老鼠是独立的适应性免疫反应

研究在小鼠和人类有强烈表明,肠道炎症的结果从一个受损的肠道微生物群的先天免疫反应,导致适应性免疫系统的失调。7,8检查如果α6炎症^ΔIEC肠遵循这种模式,我们首先定义了免疫档案通过荧光激活细胞分类(流式细胞仪)的免疫细胞孤立于结肠固有层(称为固有层单核细胞)。突变小鼠CD4显示∼5倍增加⁺T淋巴细胞和几个髓细胞包括中性粒细胞,树突细胞和单核细胞(图3A、B)。值得注意的是,有一个招募Ly-6G > 40倍增加⁺/ CD11b⁺中性粒细胞在突变小鼠的结肠粘膜与控件(相比图3B)。相比之下,CD8的数量⁺T淋巴细胞和炎性单核细胞没有变化(图3A、B)。组织学分析证实存在广泛的变异免疫细胞浸润结肠/直肠脱垂(见在线领域补充图S5B C)。这些大多是确定为CD11b⁺细胞免疫染色,尽快招募4周(图3C, C′)。值得注意的是,这些细胞的招募更强在9周(图3D, D′)。

Inflammation onset in α6^ΔIEC mice is mediated by myeloid cells recruitment, independently of the adaptive immune system. (A and B) FACS analysis and quantification of immune cell subpopulations present in colonic lamina propria extracts from animals raised in conventional conditions. LPMCs originate from WT and α6^ΔIEC animals aged 9–15 weeks. Results are displayed as scattered dot plots (error bars, SD); each dot represents the number of positive cells present in the extract for each animal. (A) CD4⁺ and CD8⁺ T lymphocytes; (B) Cells of myeloid origin defined as: neutrophils, Ly-6G⁺ CD11b⁺; DC, Ly-6G⁻ CD11c⁺ MHC class II^intermediate; monocytes, Ly-6G⁻ Ly-6C⁺ MHC class II⁻; pro-inflammatory monocytes, Ly-6G⁻ Ly-6C⁺ CD11c^low MHC class II⁺ CD64⁺. (C–E) Immunodetection of CD11b⁺ cells (green) in the colon of WT and α6^ΔIEC mice aged 4 (C) and 9 (D) weeks, and of combined rag1^+/− α6^ΔIEC and rag1^−/− α6^ΔIEC animals (E). Scale bars, 100 µm. (C′–E′) Quantification of the number of CD11b⁺ infiltrating cells per mm² of colon from images illustrated in (C–E), displayed as scattered dot plots (error bars, SD). (C′) WT and α6^ΔIEC mice aged 3 and 4 weeks; (D′) 9-week-old WT and α6^ΔIEC mice; (E′) combined rag1^+/− α6^ΔIEC and rag1^−/− α6^ΔIEC; rag1 α6^ΔIEC mice were raised in SPF conditions. **p<0.01. DC, dendritic cells; e, epithelium; FACS, fluorescence activated cell sorting; Infl. Mono, pro-inflammatory monocytes; lp, lamina propria; LPMCs, lamina propria mononuclear cells; MHC, major histocompatibility complex; Mono., monocytes; Neutro., neutrophils; ns, not significant; SPF, specific pathogen-free; w, weeks.

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图3

炎症发作α6^ΔIEC老鼠是由髓细胞招聘、独立于适应性免疫系统。(A和B)流式细胞仪分析和量化的免疫细胞亚群存在于结肠固有层提取物动物在常规条件下长大。LPMCs源自WTα6^ΔIEC动物年龄在9 - 15周。结果显示为散点图(误差,SD);每个点代表阳性细胞的数量为每个动物中提取。(一)CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞;(B)骨髓来源的细胞定义为:中性粒细胞,Ly-6G⁺CD11b⁺;特区Ly-6G⁻CD11c⁺MHC II级^中间;单核细胞,Ly-6G⁻Ly-6C⁺MHC II级⁻;促炎细胞因子,Ly-6G⁻Ly-6C⁺CD11c^低MHC II级⁺CD64⁺。(汉英)Immunodetection CD11b⁺结肠细胞(绿色)的WTα6^ΔIEC小鼠4岁(C)和9 (D)周,和总和rag1^{+ /−}α6^ΔIEC和rag1^−−/α6^ΔIEC动物(E), 100年规模酒吧µm。(C′- e′)量化CD11b的数量⁺浸润细胞每毫米²从图片中所示的结肠(汉英),显示为散点图(误差,SD)。(C′) WTα6^ΔIEC老鼠3岁和4周;(D′) 9-week-old WTα6^ΔIEC老鼠;(E′)的总和rag1^{+ /−}α6^ΔIEC和rag1^−−/α6^ΔIEC;rag1α6^ΔIEC老鼠在SPF条件。* * p < 0.01。直流,树突细胞;e,上皮细胞;流式细胞仪、荧光激活细胞分类;影响力。Mono,促炎单核细胞;lp,固有层;LPMCs,固有层单核细胞;主要组织相容性复合体MHC; Mono., monocytes; Neutro., neutrophils; ns, not significant; SPF, specific pathogen-free; w, weeks.

正式评估的潜在参与T淋巴细胞和B淋巴细胞在疾病发作,我们穿过α6^ΔIEC老鼠rag1^−−/老鼠,缺乏成熟的B淋巴细胞和T淋巴细胞。24值得注意的是,组织病理学分析显示rag1^−−/α6^ΔIEC双突变小鼠炎症发展类似于单身rag1^{+ /−}α6^ΔIEC突变体,存在大量免疫浸润在结直肠粘膜(见在线补充图CD11b S5C)和高水平⁺髓系细胞(图3E, E′)。总的来说,这些结果表明,结肠炎的发病独立于T淋巴细胞和B淋巴细胞活化。

我们下一个检查是否在α6炎症^ΔIEC老鼠与MyD88通路有关,是一个主要玩家的先天免疫反应。结肠炎发生同样在两种MyD88^−−/α6^ΔIEC和MyD88^{+ /−}α6^ΔIEC变异动物表明MyD88信号在α6主要不是需要启动炎症^ΔIEC肠(见在线补充图S5D)。因此,炎症发作不涉及古典toll样受体(TLR)通路经历MyD88。

早发性结肠炎与上皮caspase-1激活和地震在α6分泌^ΔIEC老鼠

通路介导炎症进一步定义,我们下一个检查的水平特征明显的促炎细胞因子参与炎症性肠病、结肠释放的外植体培养24小时在线(见补充材料和方法)。细胞因子筛选显示IL-1β和地震水平相比,突变体是最显著的增加与控制(见图4一个和在线补充图S6A)。在八个额外的细胞因子,我们化验、IFNγIL-17α6和il - 22生成水平也增加^ΔIEC老鼠,虽然不那么突出(见在线补充图S6A, B)。

Colitis initiation in α6^ΔIEC mice is triggered by strong epithelial IL-18 secretion and colitis worsening by IL-1β hypersecretion. (A and B) Scattered dot plot quantification of IL-1β and IL-18 levels measured by ELISA starting from colon explants of WT and α6^ΔIEC mice at 9 weeks (A) and at 2, 3 or 4 weeks of age (B) (error bars, SD; ns, not significant; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001). (C) Western blot analysis performed on protein extracts obtained from an enriched epithelial fraction (enriched IECs) or from whole colon segments (total colon lysates) of 2-week-old WT and α6^ΔIEC mice. Representative blots of three independent experiments performed on at least five animals per group are illustrated. Western blot with GAPDH and β-Tubulin are presented as loading controls. Casp1, caspase-1; enriched IECs, enriched intestinal epithelial cells; GAPDH, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; w, weeks.

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图4

在α6结肠炎起始^ΔIEC老鼠引发的强烈上皮地震-分泌和结肠炎恶化IL-1β分泌过多。(A和B)散点图量化IL-1β和ELISA测得的地震水平从结肠WT和α6外植体^ΔIEC老鼠在9周(A)和2、3或4周的年龄(B) (SD误差;ns,不重要;* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001)。(C)免疫印迹分析进行蛋白质提取获得的丰富上皮分数(丰富iec)或从全结肠段(总结肠溶菌产物)枚WT和α6两星期^ΔIEC老鼠。滴代表三个独立的实验动物进行至少5每组。免疫印迹与GAPDH和β-Tubulin加载控制。Casp1 caspase-1;丰富了iec、丰富肠道上皮细胞;甘油醛3磷酸脱氢酶GAPDH;w,周。

更好地描述的事件序列发生在疾病发作,我们特别关注的时机IL-1β和地震增加相对于最早的异常在突变小鼠观察(见图2c g)。特别是,我们检查动物年龄在2 - 3周上皮屏障时,免疫系统和微生物群逐步建立。25我们观察到最初分泌的细胞因子之间有着明显的差别,因为地震已经显著增加的突变冒号在2周,而IL-1β没有检测到这个时候点(图4B)。从3周开始,两种细胞因子的分泌是α6显著增加^ΔIEC冒号(图4B)。

确定最可能的地震和IL-1β的细胞来源,我们用免疫印迹分析,筛选表达蛋白质提取物(总结肠溶菌产物)和浓缩上皮分数(丰富iec)通过刮的结直肠粘膜(见图4C和在线补充图S7)。因为细胞因子产生的活动形式(pro-IL-18和pro-IL-1β)必须由caspase-1裂解活性和分泌,我们还检查了活跃的表达caspase-1(因pro-caspase-1劈理)。表达水平的pro-IL-18, pro-IL-1β和pro-caspase-1活动形式在野生型(WT)和α6相似^ΔIEC提取,无论阶段(2或3周)或提取的源(总结肠vs丰富iec)(见图4C和在线补充图S7)。相比之下,一个强大的增加裂解的地震和裂解caspase-1α6观察^ΔIEC丰富了iec早在2周(图4C),并保持在3周(见在线补充图总共S7),但几乎没有检测到突变结肠溶菌产物。Cleaved-IL-1β没有或几乎没有检测到。

总之,我们的数据建立的地震是激活α6缺乏iec之前任何临床和组织学结肠炎的迹象,而且其上皮释放之前IL-1β的分泌。此外,自IL-1β活性形式中没有检测到突变iec,表明它可能是由免疫细胞浸润黏膜。

α6^ΔIEC冒号显示有缺陷的粘液屏障

IBD患者加剧炎症的一个因素来自黏液层中的缺陷,保护从微生物易位。3,26有趣的是,最近的数据与上皮的地震信号由杯状细胞粘液生产(GCs)和GC成熟。27

检查在α6黏液层的属性^ΔIEC老鼠,我们用高碘酸希夫/阿尔新蓝(不是/ AB)染色。我们发现不是⁺GC,面临更大的顶端显示的腔室或膜还是突变体远端结肠(见在线补充图S8A-D),也观察到在角蛋白K8-deficient老鼠。28此外,不是数量⁺GC发现底部的突变体隐窝是显著增加,而不是的平均数量⁺GC在地下室高度持平(见在线补充图S8A-D)。6周的年龄,Muc2和不是/ AB染色显示丰富的粘液分泌物呈现突变改变属性结肠内腔(见在线补充图S8E F),尽管GC /总比上皮细胞相似(59.0±4.6%为α6控制和59.7±2.7%^ΔIEC老鼠,n = 3)。在后期,通常无菌α6内黏液层出现不规则^ΔIEC老鼠(见在线补充图S8G)。阐明的潜在原因粘液缺陷,分析了离子转运体的分布SLC26A3和Na⁺/小时⁺换热器NHE3,描述为参与黏液层的形成和维护,29-31美丽的和已知的影响^−−/突变的老鼠。28我们发现SLC26A3和一定程度上的NHE3顶端α6表面不太丰富^ΔIEC冒号(见在线补充图S8H H′),为他们参与观察粘液缺陷与角蛋白分布改变。

抗生素治疗提高了疾病的严重程度

黏液层的改变可以支持一个物理交互与上皮细胞的细菌。29日,30.,32我们因此检查空间隔离的微生物群在远端结肠上皮细胞,用荧光原位杂交(鱼)来检测细菌16 s rrna,和Muc2-immunostaining描绘粘蛋白层和上皮边界。在3周的年龄,当组织缺陷和细胞因子水平已经不正常,细菌显然是物理隔绝,iec(见在线补充图S9A)。相比之下,细菌附着在突变体在老年患病的老鼠根据结肠上皮表面的细菌16 s rRNA直接接触iec(见在线补充图S9B)。

给细菌和突变iec之间的密切接触者,我们下一个评估细菌是否有一个角色在α6引发结肠炎^ΔIEC老鼠。我们9-week-old动物鸡尾酒的广谱抗生素治疗之前收集肠外植体以消耗大量细菌种类的范围。总的来说,抗生素IL-1β的水平降低到那些在未经处理的控制和减少一半观察地震(见图5一个和在线补充图S9C),并没有影响IFNγ的水平,IL-17和il - 22生成(见在线补充图S9C)。此外,抗生素改善疾病严重程度减少CD11b的数量⁺细胞渗透到突变结肠粘膜(图5B),而对CD4他们没有重大影响⁺T细胞(图5B)。因此,抗生素减少结肠炎突变结肠组织学评分(图5C)。

Colitis in α6^ΔIEC mice is partially improved by antibiotic treatment. (A–C) Scattered dot plot representations showing the quantification of cytokine levels measured by ELISA starting from colon explants (A), of the CD11b⁺ and CD4⁺ cells infiltrating the colonic mucosa (B), and of histological scores (C), in 9-week-old WT and α6^ΔIEC mice treated with antibiotics (+ATB) or not. In each scattered dot plot, error bars represent SD; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. (A) ELISA quantification of IL-1β and IL-18 levels. (B) Quantification of CD11b⁺ and CD4⁺ infiltrating cells per surface of colon. (C) Colitis histological scores established in the proximal and distal colons. +ATB, with antibiotics; ns, not significant.

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图5

结肠炎在α6^ΔIEC老鼠部分提高了抗生素治疗。(A - c)散点图表示显示细胞因子水平的量化衡量ELISA从结肠外植体(A), CD11b⁺和CD4⁺结肠粘膜的细胞浸润(B),组织学评分(C),在9-week-old WTα6^ΔIEC老鼠使用抗生素治疗(+作为)。在每一个散点图,误差表示SD;* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001。(一)ELISA量化IL-1β和地震水平。(B) CD11b量化⁺和CD4⁺每结肠表面浸润细胞。(C)结肠炎组织学得分成立于近端和远端冒号。+作为,用抗生素;ns,不重要。

总的来说,我们的结果表明,细菌在α6结肠炎恶化方面发挥作用^ΔIEC老鼠,但疾病发作之前细菌对肠道上皮细胞层。此外,抗生素治疗的事实只是部分恢复正常健康的粘膜正常的地震水平进一步支持了这种观点,即地震过程中有着重要的作用,引发炎症。

成人α6整合素损失概括结肠炎发生α6中观察到^ΔIEC动物

区分直接和间接的影响α6整合素消融,我们控制的时机Itga6通过使用TAM-inducible消融在iec Cre-ER^T2系统(α6^ΔIEC-TAM线)。188点我们和TAM治疗成年老鼠weeks-stage动物有一个完全成熟的肠道和免疫系统分析了他们2周后(图6在α6)。Immunodetectionα6β4整合素^ΔIEC-TAM冒号透露一个高效、均匀去除α6和β4信号的突变iec (图6B)。有趣的是,α6^ΔIEC-TAM突变体显示结肠直肠肿胀和稀便(图6C)和肠道通透性增加(图6α6 D)所观察到的类似^ΔIEC线。为了更好地定义如何早期分子结肠炎的迹象出现,我们研究动物在6、10、15天post-TAM管理。一天6 post-TAM突变冒号显示重要的上皮细胞分离和地震-分泌增加(见图6E和在线补充图S10A, B),在α6也观察到^ΔIEC动物(见图1我,4B和在线补充图α6 S4B C)^ΔIEC-TAM突变小鼠开始发展增生(评估增殖标记ki - 67), CD11b⁺细胞浸润和增加IL-1β分泌在10和15天post-TAM(见图6E-F′和在线补充图S10A-D),与T淋巴细胞亚群(没有区别图6G H)。按照我们之前发现的本构α6^ΔIEC模型,应用抗生素治疗之前TAM政府减少炎症的迹象(见图6E-F′和在线补充图S10),而不降低上皮分离和恢复地震-分泌(见控制水平图6E和在线补充图S10)。因此,α6^ΔIEC-TAM老鼠拟表型α6^ΔIEC线。

Colorectal inflammation occurs quickly after α6 integrin ablation in adult IECs. (A) Experimental procedure of TAM treatment (red arrows indicate the days of TAM administration) and subsequent analysis (black arrow) of WT and α6^ΔIEC-TAM mice, illustrated for the time point 15 days post-TAM administration. Animal age is indicated in weeks. (A–D and F–H) Eight-week-old WT and α6^ΔIEC-TAM mice were treated with TAM and analysed 15 days after the first TAM gavage. (B) Immunodetection of α6-integrin and β4-integrin chains (green) on colon sections of WT and α6^ΔIEC-TAM. DAPI marks nuclei (blue). Scale bars, 50 µm. (C) Morphology of the colorectal region of WT and α6^ΔIEC-TAM mice. Scale bars, 5 mm. (D) Scattered dot plots showing the plasma concentration of FITC-dextran (FD4) in WT and α6^ΔIEC-TAM mice fed with FD4; error bars, SD. (E) ELISA quantification of the levels of IL-1β and IL-18 secreted by colon explants cultured for 24 hours. Samples were analysed 6, 10 and 15 days after the first TAM gavage in WT and α6^ΔIEC-TAM mice treated with antibiotics or not. Results are displayed as scattered dot plots; error bars, SD; ns, not significant. (F and F′) Immunodetection (F) and quantification (F′) of CD11b⁺ cells (green) in the colon of 10-week-old TAM treated WT and α6^ΔIEC-TAM mice, 15 days post TAM gavage. Scale bar, 100 µm. (G and H) Quantification by FACS analysis of the immune cell subpopulations present in LPMCs of 10-week-old TAM treated WT and α6^ΔIEC-TAM mice, 15 days post TAM gavage. (G) CD4⁺ and CD8⁺ T lymphocytes; (H) Cells of myeloid origin defined as Ly-6G⁺ CD11b⁺. Results are displayed as scattered dot plots (error bars, SD); each dot represents the number of positive cells present in the extract for each animal. *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. A, anus; Asterisks (*), stools; +ATB, with antibiotics; C, colon; Ca, caecum; d, day; e, epithelium; FACS, fluorescence activated cell sorting; IECs, intestinal epithelial cells; LPMCs, lamina propria mononuclear cells; lp, lamina propria; lu, lumen; ns, not significant; R, rectum; TAM, tamoxifen; w, week.

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图6

结直肠炎症发生后迅速α6整合素在成人iec消融。(A)实验过程TAM治疗(红色箭头表示的日子TAM)和随后的分析(黑色箭头)的WT和α6^ΔIEC-TAM老鼠,说明post-TAM 15天时间点管理。动物年龄是在周。(模拟和F-H)八周大WTα6^ΔIEC-TAM老鼠接受TAM和第一TAM填喂法分析后15天。(B) Immunodetectionα6-integrin和β4-integrin链(绿色)结肠段WTα6^ΔIEC-TAM。DAPI标记核(蓝色)。酒吧、规模50µm。(C)形态学WT和α6结直肠的地区^ΔIEC-TAM老鼠。规模酒吧、5毫米。(D)散点图显示FITC-dextran的血浆浓度(FD4) WTα6^ΔIEC-TAM老鼠FD4;误差线,SD。(E) ELISA IL-1β水平的量化和地震由结肠分泌外植体培养24小时。样本分析6、10、15天之后第一个TAM在WT和α6填喂法^ΔIEC-TAM老鼠使用抗生素治疗。结果显示为散点图;误差线,SD;ns,不重要。(F和F′) Immunodetection (F)和CD11b量化(F′)⁺结肠细胞(绿色)的10周大TAM治疗WTα6^ΔIEC-TAM老鼠,TAM填喂法后15天。µm酒吧,规模100人。通过流式细胞仪分析(G和H)量化的免疫细胞亚群在LPMCs 10周大TAM治疗WTα6^ΔIEC-TAM老鼠,TAM填喂法后15天。(G) CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞;(H)骨髓来源的细胞定义为Ly-6G⁺CD11b⁺。结果显示为散点图(误差,SD);每个点代表阳性细胞的数量为每个动物中提取。* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001。一、肛门;星号(*),凳子;+作为,用抗生素;C,结肠; Ca, caecum; d, day; e, epithelium; FACS, fluorescence activated cell sorting; IECs, intestinal epithelial cells; LPMCs, lamina propria mononuclear cells; lp, lamina propria; lu, lumen; ns, not significant; R, rectum; TAM, tamoxifen; w, week.

我们下一个旨在进一步描述炎症的分子签名的损失α6β4整合素。为此,我们进行了对mrna转录组分析从直肠隔层中提取WTα6^ΔIEC-TAM老鼠post-TAM 15天治疗。微阵列数据(Affymetrix)分析了使用“创新路径分析”(IPA)帮助我们定义分子间相互作用的网络。最在α6激活网络^ΔIEC-TAM突变体包括基因编码IL-1β(见在线补充图S11A),证实了后者的主角监管电路疾病严重程度。额外的基因赋予功能相关的IL-1β-inflammatory网络编码炎性分子(IL1-RL1, CXCL5 / CXCL6和CXCR2)或细胞外基质(ECM)改造因素(如MMP10)。他们的微分表达式被RT-qPCR验证(见在线补充图S11B)。

完全结肠炎拟表型的成年人已经有完善的免疫系统,微生物群强调结肠炎的起源没有α6整合素主要是与IEC超然从大英博物馆,由于细菌分泌上皮的地震和恶化。

自发的和完全渗透α6腺癌的发展^ΔIEC老鼠需要活化的B淋巴细胞和T淋巴细胞

一些IBD动物模型可以开发腺癌,尽管发病率低,除非接受葡聚糖硫酸钠和azoxymethane。7,33相比之下,我们发现所有α6^ΔIEC小鼠自发发展结直肠腺癌1年的年龄,和没有任何进一步的化学处理。腺癌和/或高档发育不良大多位于直肠脱垂(图7),很少被发现在小肠(2 8例分析)。组织病理学分析显示不同程度的粘膜渗透(图7B)和众多ki - 67阳性细胞被入侵的腺体中观察到直肠内脱垂(图714 C)。在突变小鼠年龄在48 - 80周,都有腺癌(图7D)。有趣的是,α6^ΔIEC-TAM老鼠TAM治疗8周,分析了1年后,也更发达的腺癌/优质发育不良(5 7例分析)或者至少低品位发育不良在直肠脱垂(2/7),表明的损耗α6整合素即使诱导成熟的肠道可以触发colitis-associated致癌作用(图7D)。我们接下来使用正电子发射断层扫描(PET)扫描测试的存在转移。我们发现高代谢水平的氟脱氧葡萄糖(FDG)在整个一岁的α6大肠吸收^ΔIEC老鼠,但未能观察远处转移(图7E)。

All α6^ΔIEC mice spontaneously develop colitis-associated adenocarcinomas. (A–G) Tumour features in ≥1-year-old α6^ΔIEC mutant mice. (A) Wide-field view (top) and histological section (bottom) of a large prolapse with an infiltrating mucinous adenocarcinoma invading the submucosa and muscle layers (m). Dotted line, region comprising tumour lesions. Scale bars: 5 mm (top); 500 µm (bottom). (B) Views of prolapse-associated tumours: (left) intraepithelial adenocarcinoma and (right) highly infiltrating adenocarcinoma (dotted lines, arrows). Higher magnifications are shown in the lower panels. Scale bars: 100 µm. (C) Ki67 immunostaining (brown nuclei) on rectal sections from 1-year-old WT and α6^ΔIEC mice. Ki67⁺ cells are located at the base of the crypts (bar), and in the invading glands of the prolapse associated-adenocarcinoma (right panel, arrows). Scale bars: 100 µm. (D) Schematic representation showing the repartition of 1-year-old affected mice according to their genotype and the type of intestinal lesions they displayed; numbers mentioned in histogram columns and percentage (y-axis) of affected mice as well as the lesion types are indicated. The genotype of mice and the housing conditions (conventional (conv.) vs SPF) are indicated under the chart. (E) FDG-PET images of WT and α6^ΔIEC mice showing a significant FDG uptake in the mutant large intestine and the rectal prolapse area (arrows). (F) Section through the recto-anal region of a combined rag1^−/− α6^ΔIEC mutant showing a low grade dysplasia (dotted line, arrows). Lower panel: high magnification of the dysplasia. Scale bars: 100 µm. (G) Immunodetection of laminin γ2 chain (green) in WT rectum and α6^ΔIEC prolapse. DAPI (in blue) marks nuclei. Arrowheads, basement membrane underlying the surface epithelium. Arrows, increased deposits of laminin γ2 in the basement membrane and around tumour areas in α6^ΔIEC prolapse. Asterisks (*), invasive gland infiltrated into the sm. Scale bar: 100 µm. ADK, adenocarcinoma; Dys, low grade dysplasia; e, epithelium; FDG, fluorodeoxyglucose; Inf, inflammation; lp, lamina propria; lu, lumen; m, muscle layer; sm, submucosa; SPF, specific pathogen-free; PET, positron emission tomography.

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图7

所有α6^ΔIEC小鼠自发发展colitis-associated腺癌。(g)≥一岁的α6肿瘤特性^ΔIEC突变的老鼠。(一)广角视图(上)和组织切片(底部)的大型脱垂入侵黏膜下层、肌层浸润粘液腺癌(m),虚线区域包括肿瘤病变。规模的酒吧:5毫米(上);500µm(底部)。(B)的观点:prolapse-associated肿瘤(左)上皮内腺癌和(右)高度渗透腺癌(虚线箭头)。高的放大显示在低板。酒吧规模:100µm。布朗(C) Ki67疣状(核)从一岁的WT和α6直肠部分^ΔIEC老鼠。Ki67⁺细胞是位于底部的隐窝(bar),和入侵腺体的脱垂associated-adenocarcinoma(右面板中,箭头)。酒吧规模:100µm。(D)显示示意图表示一岁的影响老鼠的重新分配根据他们的基因型和肠道病变的类型显示;数据直方图所列和百分比(y设在)影响小鼠以及病变类型表示。老鼠的基因型和住房条件(常规(conv)对SPF)下表表示。WT和α6 (E)摄影图像^ΔIEC氟- 18 -去氧葡萄糖摄取老鼠表现出显著的突变大肠和直肠脱垂区(箭头)。(F)段通过recto-anal地区的总和rag1^−−/α6^ΔIEC突变体显示低品位发育不良(虚线箭头)。较低的面板:高放大倍数的发育不良。酒吧规模:100µm。对层粘连蛋白(G) Immunodetectionγ2链在WT直肠和α6(绿色)^ΔIEC脱垂。DAPI(蓝色)是核。箭头,底层表面上皮基底膜。箭头,存款增加层粘连蛋白γ2α6肿瘤周围的基底膜和地区^ΔIEC脱垂。星号(*)、入侵腺渗透进了sm。酒吧规模:100µm。理应,腺癌;来,低品位发育不良;e,上皮细胞;壁,氟脱氧葡萄糖;正无穷,炎症;lp,固有层;陆,腔; m, muscle layer; sm, submucosa; SPF, specific pathogen-free; PET, positron emission tomography.

正如上面报道的,自适应免疫系统并不在结肠炎的发病发挥明显的作用。定义是否激活适应性免疫系统的发展为腺癌也可能是可有可无的,我们比较单一α6^ΔIEC和rag1^−−/α6^ΔIEC双突变小鼠成长于特定的无菌(SPF)条件。的八个α6^ΔIEC动物年龄在45 - 76周,三个已经开发了一个腺癌,一个显示严重发育不良,而剩下的四个有炎症(图7D)。相比之下,没有一个50 - 64周大rag1^−−/α6^ΔIEC双突变体(6/6)开发了一个腺癌;相反,他们显示非常离散低品位发育异常病变(4/6)和慢性炎症(6/6)(图7D, F),表明T细胞和B细胞的激活的关键作用在疾病进展。

知道当地微环境的改变,特别是层粘连蛋白,可能促进肿瘤发展,WT和突变直肠组织与层粘连蛋白应用γ2,α6β4的半桥粒配体,是过表达,在CRC与不良预后相关。34大层粘连蛋白γ2存款被发现在整个tumoural区直肠内脱垂在突变小鼠信号限制在大英博物馆在隐窝的控件(上部图7G)。

最后,为了更好地理解机制肿瘤侵犯,我们定义了特定的转录组α6签名与致癌作用^ΔIEC模型通过比较基因表达在三个不同的样本:(1)adenocarcinoma-comprising区域的突变脱垂,(2)但非邻近直肠粘膜发炎和(3)直肠粘膜从WT老鼠。第一次异丙醇分析允许识别显著过表达或underexpressed基因在肿瘤领域对粘膜发炎(学生t, p值≤0.001;褶皱变化≥+ 2或≤−2)和定义最激活肿瘤的基因网络(见在线补充图S12A)。许多分子参与ECM成分和退化/改造,以及炎症组件属于这个基因网络。有趣的是,他们中的一些人已经被描述为参与大肠癌致癌作用如MMP9, MMP13或TIMP1(审查看到裁判。35)或在炎症通路(评论看到裁判。36)。此外,如前所述的炎症恶化,网络分析强调了il - 1细胞因子的重要作用和IL-1R信号,表明这种炎症签名所需肿瘤进展。

我们进一步为特征的分子签名发炎或恶性病变比较他们正常直肠粘膜通过使用第二个音标基因功能的分析,揭示了不同类别的显著影响。结果总结在网上补充表图S12B S1和。

总之,肠道炎症α6中观察到^ΔIEC小鼠上皮分离结果和地震导致有缺陷的粘液分泌障碍,独立于T淋巴细胞和B淋巴细胞的激活和MyD88信号。此外,我们的研究结果表明,肠道tumourigenesis可能造成连续il - 1信号一起BM改造和B细胞和T细胞活化。

讨论

第一次我们报告的关键生理保护作用α6 integrin-mediated信号在iec对肠道炎症和tumourigenesis老鼠。我们的数据表明,一系列事件导致肠道epithelial-specific后炎症Itga6消融在开发或诱导成人,首先意味着半桥粒破坏导致IEC超然从大英博物馆和上皮削弱。反过来,这导致在受损的iec caspase-1激活和地震持续分泌。随后,粘液屏障变得相当有缺陷,促进iec的接触细菌和/或腔的组件。因此,慢性炎症是由IL-1βoversecretion和骨髓细胞积累。重要的是,相同的级联时观察到的事件Itga6删除在成人肠诱导,排除间接累积效应与发育缺陷。最后,所有α6^ΔIEC和α6^ΔIEC-TAM动物发达自发肿瘤浸润后1年没有任何进一步的化学处理。这类肿瘤的发展依赖于激活适应性免疫系统(图8)。

Model of the sequence of events leading to colorectal inflammation and carcinogenesis. Schematic drawing illustrating two IECs of the large intestine attached through α6β4 integrin to the BM via the HDs. By compelling the data obtained from α6^ΔIEC and α6^ΔIEC-TAM models, we suggest that the following sequence of events occurs. First, loss of the integrin impairs epithelial integrity causing epithelium fragility and detachment from the BM. The absence of tight anchorage to the BM results in disruption of the IFs network and impaired cell architecture. Second, epithelial damage triggers activation of caspase-1 in IECs followed by a drastic activation and secretion of IL-18. Intestinal permeability increases, and hyperplasia occurs in the epithelium (not illustrated). Third, presumably as a secondary consequence (defective cytoskeleton, changes in mucosal pH, cytokine release), the integrity and composition of the mucin layer become altered, favouring bacterial penetration and translocation. Concomitantly, altered epithelial barrier function triggers an inflammatory response, induced in part by exposure of the immune system to bacteria. Inflammation relies on engagement of the innate immune system, mostly independently of the lymphocyte-mediated immunity. It is characterised by enhanced secretion of epithelial IL-18 and immune-mediated IL-1β, and infiltration of CD11b⁺ myeloid cells into the colonic mucosa. In parallel, lymphoid cells secrete IL-17, IL-22 and IFNγ and sustain chronic inflammation over a long period. Lastly, perpetuation of long-standing colitis associated with alterations of the microbiota invariably induces the spontaneous development of adenocarcinomas in all α6^ΔIEC mutants, tumour progression being dependent on the adaptive immune system. BM, basement membrane; HDs, hemidesmosomes; IECs, intestinal epithelial cells; IFs, intermediate filaments.

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图8

模型的一系列事件导致结肠直肠炎症和致癌作用。示意图说明大肠附加的两个iec通过α6β4整合素通过HDs大英博物馆。通过令人信服的数据从α6获得^ΔIEC和α6^ΔIEC-TAM模型,我们建议以下发生的事件序列。首先,整合素的损失损害上皮完整性导致上皮细胞从大英博物馆脆弱性和超然。缺乏严格的锚地IFs的大英博物馆导致破坏网络和细胞结构受损。第二,上皮损伤激活触发器的caspase-1 iec剧烈的地震-激活和分泌,紧随其后。肠道通透性增加,增生发生在上皮(没有了)。第三,想必作为次要结果(缺陷的细胞骨架,粘膜pH值的变化,细胞因子释放),粘蛋白层的完整性和成分改变,有利于细菌渗透和易位。与此同时,上皮屏障功能改变触发炎症反应,诱导免疫系统部分接触细菌。炎症依赖于先天免疫系统的参与,主要是独立于lymphocyte-mediated免疫力。它的特点是增强分泌上皮的地震和免疫介导性IL-1βCD11b渗透⁺髓细胞进入结肠粘膜。同时,淋巴细胞分泌IL-17, il - 22生成和IFNγ维持长期慢性炎症。最后,延续长期结肠炎与变更相关的微生物群总是诱发α6腺癌的自发发展^ΔIEC突变体,肿瘤进展是依赖于适应性免疫系统。BM,基底膜;HDs、半桥粒;iec,肠道上皮细胞;IFs,中间丝。

我们建议缺陷α6整合素半桥粒功能,及其诱导机械上皮脆弱,最终负责结肠炎。随之而来的损失的β4整合素亚基,这已经被观察到Itga6淘汰赛,17,20.,37可能不平衡一些调制信号事件的整合蛋白链,38并可能因此引发caspase-1激活和地震-分泌。表达β1整合素链α6没有明显影响^ΔIEC老鼠,符合这一事实β1损耗在小肠导致更严重的表型。39我们进一步表明,缺乏稳定hemidesmosomal连接导致iec抵抗机械应力的能力降低,导致上皮分离特别是断奶的时候这样的压力大大增加由于饮食和放大的肌肉收缩的变化。机械应力的作用诱导的一种严重的肠道功能障碍已被证明在老鼠kindlin-1 integrin-associated蛋白质不足,在iec未能正确坚持大英博物馆,形成一个高效的上皮屏障,导致严重的结肠炎和围产儿死亡率。40肠道功能障碍由于α6β4整合素在肠中没有一个完整的上皮细胞分离,也在一个临床病例报道,并支持我们的研究结果。41有趣的是,它也表明,半桥粒干扰秀丽隐杆线虫表皮触发一个先天免疫反应。42

地震的激活下游的上皮脱离引起α6整合素损失发生独立的MyD88通过未知的机制。随着caspase-1被激活,我们推测,上皮分离导致机械应力损伤信号触发inflammasome的组装,这还有待确定。改变积累由于这些最初的炎症信号增加疾病严重程度有很大的影响。特别是,损伤的粘液上皮黏膜屏障和随后的接触细菌化合物会加剧结肠炎,就像观察小鼠显示缺陷由于失去核心1-derived粘液O聚糖。43粘膜α6缺陷^ΔIEC老鼠可能造成的:(1)角蛋白的异常本地化K8/18,28,44(2)离子转运蛋白的异常分布SLC26A3 NHE3,涉及粘液屏障的形成29-31和(3)增加的地震水平,控制的成熟和分泌粘液。27有趣的是,有人建议,地震控制GCs成熟的通过调节转录因子的表达Gfi1, Spdef KLF4。27

从力学上看,我们发现炎症恶化需要天生的但不适应性免疫主要是通过分泌IL-1β,浸润CD11b大概⁺髓细胞作为一个更大的细菌易位的结果。我们还表明,细菌强烈导致加剧疾病严重程度在我们的模型中,由于抗生素治疗强烈降低IL-1β分泌水平,和部分的地震。突变α6^ΔIEC老鼠也显示增强和antibiotic-insensitive IL-17, il - 22生成和IFNγ水平,这可能导致炎症和腺癌形成晚些时候,因为IL-17和il - 22生成参与了肿瘤进展。45-47

α6最显著的特征^ΔIEC模型是结直肠的自发发展腺癌,没有观察到与完整的外显率发生前所述肠道炎症的小鼠模型。33出乎意料,IBD-like表型观察小鼠缺乏keratin-8(美丽),另一个关键组成部分肠道半桥粒,依赖于T淋巴细胞而非髓细胞,但不足以导致癌的发展。28,48,49后者的研究结果表明,半桥粒不是K8同样影响的函数^−−/和α6^ΔIEC模型。K8结肠不足,β4整合蛋白过表达,导致生存的激活信号由粘着斑激酶(FAK)磷酸化,表明半桥粒仍然至少部分功能。50相比之下,半桥粒完全中断的肠Itga6有缺陷的老鼠,这可能导致一个改变和角蛋白的信号级联网络。

基于α6 tumourigenesis观察^ΔIEC老鼠,α6β4整合素可以归类为肿瘤抑制基因。这个结论似乎与其他结果建立α6β4整合素的行为作为一个致癌基因与ErbB2合作时在乳腺肿瘤的形成。51然而,α6β4的功能是完全依赖于组织上下文。52同样,在皮肤,α6β4整合素可以抑制或促进肿瘤增长取决于细胞是否表达Ras (V12),这是小GTPase致癌的形式。53

在未来的研究中,这将是重要的进一步评估是否微生物群失调,免疫系统的内稳态的变化或其他因素发挥普遍在肿瘤形成中的作用。除了host-microbiota交互,机械压力也可能影响过程,因为腺癌出现直肠地区主要也是最强烈的受到这种压力和与肠道微生物群的交互。有趣的是,半桥粒最近发现作为转导平台;54在这个框架中,缺乏对α6机械刺激反应^ΔIEC老鼠可能导致损害上皮内稳态。

大量的研究,主要基于转基因小鼠模型的发展,33已经进行了多年来定义colitis-associated CRC的起源。在这项研究中我们发现整合素/ BM连接的关键作用,表明除了微生物线索,生物力学因素导致肠道内稳态。α6利益的关键^ΔIEC线是它概括的大多数事件发生期间colitis-associated致癌作用,与所观察到的变化非常相似的在许多IBD患CRC的高危患者。此外,分子描述肿瘤带来新的有趣的领导对于理解的机制参与colitis-associated癌症的恶化。因此,α6^ΔIEC模型提供了宝贵的工具来开发新的预防/治疗治疗不可预知和无效等疾病。

材料和方法

鼠标线的一代,他们的操作和其他特定分析(抗生素治疗,上皮细胞分离试验,FITC-dextran化验,内窥镜检查、组织学分析,免疫荧光法,免疫组织化学,鱼,流式细胞仪分析,图像分析,细胞因子的测量,准备结肠蛋白质的提取和免疫印迹,RT-qPCR,转录组分析,FDG-microPET成像研究批准)以及在线统计数据介绍了本研究中使用补充材料和方法。

确认

Louvard Ferrandon感谢D, D, T Mayadas J-M Reichhart,雷纳B和L Sorokin的批判阅读手稿,技术援助的克莱因和C, C埃贝尔求助与流式细胞仪分析,jp Ghnassia anatomopathogical分析,IGBMC-histology平台技术支持,J Pontabry CD4-SLC26A3图像分析,L曹(Inviscan SAS) PET扫描图像重建,M-F咬牙切齿的细胞因子复合测量,C Thibault-Carpentier和V Alunni微阵列分析,一辆货车Es和IGBMC动物设施人员寻求帮助和建议在动物实验中,D Metzger,陈P Chambon, M, S和T佐佐木礼物的试剂和S Bour图准备帮忙。

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脚注

这项工作是一个温暖的向伊丽莎白发起这项研究和监督,直到2012年7月去世。
ADA和HH同样本研究。
贡献者EG-L构思和监督项目直到2012年中期;ADA和ML监督项目。EG-Lα6 ADA生成^ΔIEC老鼠。ADA表型特征。HHα6开发和分析^ΔIEC-TAM线,导致异丙醇的分析。FA, OL, ps和可由最初的表现型描述。SN和MC分析微生物菌群和ELISA检测。副总裁SS和S Rodius辅助ADA对各种技术方面。EB和注射了一些粘液的缺陷。AM-N anatomo-pathological进行分析。AM-N和MC的组织学评估分数。P Laquerriere进行PET扫描分析。DD Affymetrix和国际音标分析中起到了推波助澜的作用。P理意识到细菌的生物信息学分析。 ADC performed ELISA experiments. S Robine provided the Villin-Cre transgenic lines. ML and ADA wrote the manuscript, with inputs from EG-L, PSA and MC.
资金这项工作是支持的资金从CNRS Inserm和斯特拉斯堡大学,由协会倒说是关于癌症和联赛Regionale靠le癌症(EG-L),倒拉医学基金会(“纳2009运动队”MC),杜国家癌症研究所(Appel项目的形式precoces du结肠直肠癌症”EG-L和ps EG-L和MC),国家倒拉(EG-L和ML)的研究和LabEx INRT (IGBMC (UdS)。SN联赛是一个收件人的博士后奖学金靠le癌症。
相互竞争的利益没有宣布。
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