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结肠
原始研究
聚(I:C)激活先天适应性免疫机制暴露了预防富基质结肠癌复发的治疗脆弱性
  1. Shania M Corry1，
  2. Amy MB McCorry1，
  3. Tamsin RM Lannagan2，
  4. Niamh A Leonard3.，4，
  5. 娜塔莉·C·费舍尔1，
  6. 瑞恩·M·伯恩1，
  7. Petros Tsantoulis5，
  8. Xabier Cortes-Lavaud2，
  9. Raheleh Amirkhah1，
  10. 凯拉·L·雷德蒙1，
  11. Aoife J McCooey1，
  12. Sudhir B Malla1，
  13. 艾米丽·罗根1，
  14. 斯维特拉娜Sakhnevych1，
  15. 迈克尔·A·吉莱斯皮2，6，
  16. 马克白2，6，
  17. 苏珊·D·里奇曼7，
  18. Rene-Filip Jackstadt2，8，
  19. 安德鲁·D·坎贝尔2，
  20. 莎拉·马奎尔1，
  21. S:CORT和加速联盟，
  22. 西蒙·S·麦克达德1，
  23. 丹尼尔·B·朗利1，
  24. 莫里斯·B·劳瑞1，9，10，
  25. 海伦·G·科尔曼10，
  26. 艾玛·M·可儿1，
  27. Sabine Tejpar11，
  28. 蒂莫西·莫恩12，
  29. 西蒙·J·利德汉姆13，
  30. 唐娜·M·斯莫尔1，
  31. Aideen E Ryan3.，4，
  32. 欧文·J·桑瑟姆2，6，
  33. 马克Lawler1，
  34. 菲利普·邓恩1
  1. 1Patrick G Johnston癌症研究中心，贝尔法斯特女王大学，贝尔法斯特、英国
  2. 2英国癌症研究中心，比特森癌症研究所，格拉斯哥、英国
  3. 3.医学、护理和健康科学学院兰姆转化研究所，爱尔兰国立大学，高威、爱尔兰
  4. 4医学院药理学与治疗学学科，爱尔兰国立大学，高威、爱尔兰
  5. 5Université de Genève，日内瓦、瑞士
  6. 6癌症科学研究所，格拉斯哥大学，格拉斯哥、英国
  7. 7利兹医学研究所，利兹大学，利兹、英国
  8. 8海德堡干细胞技术和实验医学研究所(HI-STEM gGmbH)和癌症进展和转移小组，德国癌症研究中心，海德堡、德国
  9. 9细胞病理学，贝尔法斯特卫生和社会保健信托基金，贝尔法斯特、英国
  10. 10公共卫生中心，贝尔法斯特女王大学，贝尔法斯特、英国
  11. 11消化肿瘤科，Gasthuisberg大学医院，鲁汶、比利时
  12. 12肿瘤科，牛津大学，牛津大学、英国
  13. 13维康信托中心人类遗传学，牛津大学，牛津大学、英国
  1. 对应到英国贝尔法斯特女王大学帕特里克·G·约翰斯顿癌症研究中心菲利普·D·邓恩博士;p.dunne在{}qub.ac.uk

摘要

客观的在II/III期结肠癌(CC)中，基质丰富的肿瘤是预后不良的亚型，复发率高，对标准辅助化疗反应有限。

设计为了解决富间质CC患者缺乏有效治疗方案的问题，我们根据间质含量对人类肿瘤队列进行了分层，从而能够识别导致复发的生物学基础，以及在富间质肿瘤中可被临床利用的潜在治疗漏洞。在基于人类肿瘤的发现和独立临床验证之后，我们使用了一系列在体外和stroma-rich在活的有机体内测试和验证提高与减少人类肿瘤复发相关的生物学的治疗潜力的模型。

结果通过对CC的富间质/高成纤维细胞(HiFi)亚型进行分析，我们确定并验证了HiFi特异性预后特征(HPS)的临床价值，该特征基于stat1相关信号对肿瘤进行分层(High-HPS v Low-HPS=HR 0.093, CI 0.019至0.466)。使用在硅胶中，在体外而且在活的有机体内模型中，我们证明了在富含基质的CC中，HPS与离散免疫谱系中的抗原处理和呈递有关，双链RNA和病毒应答信号的下游。使用TLR3激动剂聚(I:C)处理可以提高整个HPS信号和抗原处理表型在体外而且在活的有机体内模型。在一个在活的有机体内富间质CC模型中，聚(I:C)治疗显著提高全身细胞毒性T细胞活性(p<0.05)，减少肝转移(p<0.0002)。

结论这项研究揭示了新的生物学见解，为预后最差的CC患者降低复发率提供了一种新的治疗选择。

  • 癌症
  • 结肠致癌作用
  • 结肠直肠癌
  • 辅助治疗

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2021-326183

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    本研究的意义

    关于这个问题，我们已经知道了什么?

    • 在II/III期结肠癌(CC)患者中，富含基质的肿瘤成分与不良预后相关，即使患者接受标准辅助化疗治疗，复发率约为50%。在富含基质的cc中观察到转化生长因子-β (TGF-β)信号的升高，这已被用作基于TGF-β阻断的试验的基础。

    新的发现是什么?

    • 在这项研究中，我们超越了基质来源的TGF-β和不良预后之间的既定联系，来识别、表征和治疗利用这一TGF-β高不良预后组中复发的生物学基础。这种富含基质的亚型特异性方法揭示了stat1介导的抗原处理和病毒应答信号是一种靶向治疗易感性，通过toll样受体3 (TLR3)激动剂聚(I:C)，特别是在富含基质的CC中。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 这项研究揭示了富间质肿瘤复发的生物学基础的新见解，并提供了一种新的治疗方案来降低富间质肿瘤患者的复发率，这是CC早期预后最差的亚组。

    介绍

    结直肠癌(CRC)是全球第三大最常见的癌症，每年约有130万例确诊病例。1尽管手术管理和辅助治疗方案都有所改善，但许多II期和III期结肠癌(CC)患者在手术后仍会复发;各阶段患者分别占~20%和36%。2基于潜在的转录信号，将CRC患者划分为分子亚型，揭示了四种共识分子亚型(CMS1-4)，其中基质亚型(CMS4)3.有最糟糕的预后。除了分子分型外，这些预后不良的富间质肿瘤也可以通过组织学鉴别。4 - 7基于这些证据，富间质或高成纤维细胞亚型(HiFi)在II/III期CC中是预后不良的亚组，复发率约为50%-60%。3 8重要的是，即使富间质患者在术后接受辅助治疗，这种不良预后仍然是一个问题;在短期肿瘤治疗(SCOT)临床试验中，在富间质肿瘤患者中观察到FOLFOX (bolus +氟尿嘧啶与奥沙利铂输注)和卡培他滨与奥沙利铂方案的疗效有限9在最近的一项荟萃分析中，发现辅助化疗对CMS4肿瘤无效。10

    许多研究，包括我们自己的研究，已经定义和描述了与富间质肿瘤(低间质肿瘤)相比，富间质肿瘤(低间质肿瘤)的生物学基础，后者主要由升高的转化生长因子β (TGF-β)信号或间质/CMS4生物学的其他标记物主导。11 - 14号TGF-β和基质信号级联的升高被认为是其自身的靶点，然而，没有证据表明这种生物学是导致最终复发的~ 50%-60%间质丰富肿瘤与未复发肿瘤的差异结果的主要原因。识别和理解导致疾病复发的生物学基础，特别是在富间质肿瘤中，而不仅仅是富间质肿瘤和低间质肿瘤的特征，可以用于开发新的治疗干预措施，专门针对手术后复发的富间质/CMS4肿瘤患者。

    为了阐明与富间质组织学亚型患者预后相关的生物学，我们基于复发风险将成纤维细胞分层与有监管的转录组分析相结合，以发现在富间质局限性(II/III期)CC中特定相关的生物学。为了开发这一新认识，我们进行了一系列的硅片分析，以确定潜在的分子脆弱性和治疗候选药物。通过一系列体外和体内模型，我们测试并验证了聚(I:C)作为一种亚型特异性治疗方案的功能意义和潜在临床用途，旨在防止在富基质细胞CC中发生转移性复发。

    结果

    肿瘤样本中形态分子成纤维细胞测定的预后价值

    为了测试基质基因签名和组织学之间的重叠，我们使用了患者匹配的转录数据和QuPath15来自结肠切除(FOCUS队列，n=361)和直肠预处理活检(Grampian队列;n=225)，以前在S:CORT分层CRC方案中描述16（图1一个)．我们观察到H&E数字基质评分与许多之前建立的转录特征之间存在很强的相关性，包括使用ESTIMATE的StromalScore，17癌症相关成纤维细胞(CAF)评分等18和MCPcounter的成纤维细胞评分，19单独的CAF标记ACTA2(阿尔法平滑肌肌动蛋白;αSMA)和FAP (图1 b, C)．结合ACTA2而且FAP基因表达与现有的MCP成纤维细胞特征生成单样本基因集富集分析(ssGSEA)“成纤维细胞评分”转录分类器，相关性高于其他方法(图1 c；皮尔森相关= 0.856,在线补充表1)．这种方法使我们能够使用来自没有H&E图像的队列的转录数据，理解我们的发现可以翻译为富含基质的组织学亚型，传统上可从患者匹配的H&E切片中识别。

    Development and validation of our transcriptional fibroblast score. (A) Schematic of correlation between stromal/fibroblasts scores via histology and transcriptomics. (B) H&E slide with the digital pathology stromal classifier applied to a sample with a high/low percentage stroma from the focus cohort. (C) Correlation matrix with histological stroma and transcriptional classifiers (Pearson’s correlation). (D) CMS classification according to our fibroblast score. (UNK=unknown/mixed CMS classification) (t-test). (E) Waterfall plot of fibroblast scores indicating CMS classification. High-fibroblast (HiFi) n=75 and low-fibroblast (LoFi) n=140. (F) HiFi tumours have a worse prognosis than LoFi in discovery cohort (log-rank p=0.00779) (G). Comparison of HiFi and LoFi samples revealed that previously published stromal signatures and gene sets have significantly higher expression in the HiFi samples than the LoFi (adjusted p<0.15). CC, colon cancer; CMS, consensus molecular subtypes. **** denotes p<0.0001.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    我们的转录成纤维细胞评分的发展和验证。(A)通过组织学和转录组学分析基质细胞/成纤维细胞评分之间的相关性示意图。(B)采用数字病理基质分类器的H&E幻灯片应用于重点队列中基质比例高/低的样本。(C)与组织基质和转录分类器的相关矩阵(Pearson’s Correlation)。(D)根据我们的成纤维细胞评分进行CMS分类。(UNK=未知/混合CMS分类)(t检验)。(E)成纤维细胞评分指示CMS分类的瀑布图。高成纤维细胞(HiFi) n=75，低成纤维细胞(LoFi) n=140。(F)在发现队列中，HiFi肿瘤的预后比LoFi差(log-rank p=0.00779) (G)。HiFi和LoFi样本的比较显示，先前发表的基质特征和基因集在HiFi样本中的表达明显高于LoFi(调整后的p<0.15)。CC，结肠癌; CMS, consensus molecular subtypes. **** denotes p<0.0001.

    使用来自n=215个未治疗II期CC肿瘤的发现队列的转录数据20.（在线补充表2)，与其他亚型相比，我们在CMS4肿瘤中的ssGSEA成纤维细胞评分显著更高(图1 d；t检验p均<0.0001)。由于成纤维细胞含量是一个已经确定的预后生物标志物，我们使用无复发生存期(RFS)数据和Cox建模(在线补充图1)．这导致n=215例患者分层为高成纤维细胞(HiFi;n = 75;35%的队列)和低成纤维细胞(LoFi;n = 140;65%的队列)亚组，与LoFi肿瘤相比，HiFi肿瘤分类为CMS4的比例更大(分别为69.1%和7.1%;图1 e；费雪精确检验p<2.2×10−16, (在线补充图1)．富含上皮细胞的CMS2亚型在LoFi组比HiFi组更普遍(分别为32.1%和9.3%;图1 e；费雪精确检验p=2.28×10−06, (在线补充图1)．与之前的研究一致，我们观察到，与LoFi肿瘤相比，HiFi肿瘤的预后明显更差，患者复发率分别为45.3%和27.9% (图1 f；log-rank p=0.00779, HR= 1.851, 95% CI(1.168 ~ 2.932))。与我们最初的相关分析一致(图1 c)，使用估计基因集，HiFi肿瘤的StromalScore和成纤维细胞评分也明显高于LoFi肿瘤(图1 g；调整后的p<0.15)，以及我们之前发现的与CAF浸润直接相关的基因集，21包括上皮细胞向间充质细胞的转变(图1 g)．

    许多先前确定的预后因素对HiFi肿瘤的预后没有影响

    尽管在我们发现的队列中，HiFi肿瘤的预后明显差于LoFi，但HiFi亚组的复发率仍在40%-50% (图1 f)，这意味着大约一半的II期富间质肿瘤患者仅通过手术治愈。与之前的研究一致，我们证明了TGF-β信号传导的能力，通过使用一些转录特征进行评估，可以识别富基质亚型(在线补充图2A)．然而，重要的是，当在HiFi亚型中专门评估这些特征的预后价值时，它们并没有根据复发状态对患者进行分层在线补充图2B)．评估CC和胰腺癌中先前定义的CAF亚型22 - 24未能根据复发来区分HiFi肿瘤(在线补充图2C）;CRC cafa和cafb(左上)，胰腺myCAF和iCAF(右上)，CRC差异收缩力(左下)和炎症相关成纤维细胞CD34-THY1+, CD34-THY1-和CD34+CAF(右下))。同样，基于成纤维细胞刚度相关基质指数的分层，25p53活性(标记基因组ssGSEA)，茎样标记，或根据我们的ssGSEA评分的整体成纤维细胞水平(在线补充图2D)均未能分离HiFi复发和非复发肿瘤。此外，虽然HiFi肿瘤的无监督聚类确定了两个聚类，但这些亚组没有不同的预后结果(在线补充图2E)．由于先前确定的预后因素和无监督聚类对确定复发的HiFi患者没有提供额外的临床价值，我们接下来对II期未治疗的发现队列中的肿瘤进行了有监督的分析，使用GSEA、前沿分析(LEA)和Cox生存模型，对比手术后5年内复发的HiFi患者(n=34)和从未复发的HiFi患者(n=41) (图2一个)．

    Identification of HiFi-specific prognostic biology (A) workflow summary of our supervised analyses. (B) Significant gene sets associated with good prognosis specifically within HiFi tumours from supervised GSEA analysis. (C) Leading-edge analysis (LEA) of the 10 gene sets demonstrating that, of the 71 genes, many of them overlap between the interferon response gene sets leading to identification of a seven gene HPS. (D) High expression of the HPS in HiFi tumours is associated with enriched IFN alpha and gamma response signalling in discovery cohort. (E) HPS has a strong prognostic value in HiFi tumours based on a median split in discovery cohort (log-rank p=0.0069; top). HPS has no prognostic value in the LoFi samples in discovery cohort (log-rank p=0.63215; bottom). (F) High expression of the HPS (n=26) in HIFI tumours is associated with enriched IFN alpha and gamma response signalling. (G) HPS can stratify HiFi samples into two groups in the validation cohort, one with significantly poorer RFS and another with RFS even better than the LoFi patients (log-rank p=0.00113; top). HPS has no prognostic value in the LoFi samples (log-rank p=0.46596; bottom). HiFi, high-fibroblast; LOFI, low-fibroblast; RFS, relapse-free survival.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    识别hifi特异性预后生物学(A)我们监督分析的工作流程摘要。(B)来自监督GSEA分析的HiFi肿瘤中与良好预后相关的显著基因集。(C) 10个基因集的前沿分析(LEA)显示，在71个基因中，许多基因在干扰素反应基因集之间重叠，从而识别出7个基因HPS。(D)在发现队列中，HPS在HiFi肿瘤中的高表达与丰富的IFN α和γ响应信号有关。(E)基于发现队列的中位分裂，HPS在HiFi肿瘤中具有很强的预后价值(log-rank p=0.0069;上)。在发现队列的LoFi样本中，HPS没有预后价值(log-rank p=0.63215;底部)。(F) HPS在HIFI肿瘤中的高表达(n=26)与丰富的IFN α和γ反应信号有关。(G) HPS可以在验证队列中将HiFi样本分层为两组，一组的RFS明显较低，另一组的RFS甚至优于LoFi患者(log-rank p=0.00113; top). HPS has no prognostic value in the LoFi samples (log-rank p=0.46596; bottom). HiFi, high-fibroblast; LOFI, low-fibroblast; RFS, relapse-free survival.

    干扰素相关的7个基因特征确定HiFi患者预后明显更好

    GSEA揭示了HiFi组与良好预后相关的10个显著基因集，包括干扰素α和干扰素γ反应升高(图2 b, (在线补充图2F)．LEA揭示了与HiFi肿瘤预后相关的基因集中贡献最大的特定基因，我们确定了71个由多个LEA亚组共享的基因(图2 c；左)。Cox生存分析，然后对每个个体基因进行多变量模型(调整年龄、性别、pT分期、肿瘤位置、肿瘤分化等级、淋巴血管浸润状态和粘液/非粘液亚型)，过滤出7个LEA基因(p<0.05;表1）;即Fgl2, psme1, sp110，战争，ccnd2, ccnd3, pnpt1，我们将其称为能够区分复发与非复发的hifi特异性预后特征(HPS) (图2 c；右)。我们下一步证实，使用HPS的中位分裂对HiFi患者进行分层足以代表相同的干扰素(IFN) α和IFN γ反应GSEA信号(图2 d)，然而HPS与HiFi肿瘤中的TGF-β信号水平无关(在线补充图2G)．这个HPS中值分割与接收器工作特性(AUROC)最佳截止(在线补充图3)，可以根据复发情况对HiFi肿瘤患者进行显著分层，其中低表达与降低RFS相关(图2 e；最高;log-rank p=0.0069)和HPS基因高表达患者的RFS结果与LoFi患者相似。

    查看该表:
    表1

    hifi特异性预后特征和无复发生存期

    HPS是发现队列中任一单因素的预后指标(HR 0.395, 95% CI (0.191 ~ 0.816)， Wald检验p=0.012;表1)或调整年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤分化、淋巴血管浸润情况、肿瘤亚型和淋巴结数量的多因素分析(HR 0.218, 95% CI (0.087 ~ 0.544)， Wald检验p=0.001;表1)．此外，HPS对HiFi肿瘤患者的预后价值是亚型特异性的，因为当它被用于对LoFi肿瘤患者进行分层时，没有显著的预后价值(图2 e；底;log-rank p = 0.63215)。

    为了独立验证这些发现，我们将ssGSEA成纤维细胞评分方法应用于未经治疗的II/III期CC肿瘤的独立验证队列的转录谱26(GSE39582;n = 258 (在线补充表3)．与发现队列相似，与所有其他亚型肿瘤相比，CMS4肿瘤的ssGSEA成纤维细胞评分显著更高(在线补充图4A）;t检验p < 0.0001)。与公开队列中确定的富间质群体一致(在线补充图4B)， ssGSEA成纤维细胞评分前20%的患者被归为HiFi (n=52)，其余80%归为LoFi (n=206)，其中HiFi样本大部分，但不完全是CMS4 (在线补充图4C)．相反，LoFi样本主要由富含上皮细胞的亚型组成;CMS2及CMS3 (在线补充图4C,D)．HiFi肿瘤显示出更高的StromalScore和更高的成纤维细胞评分，以及类似于发现队列的富集模式(在线补充图4E)．重要的是，与发现结果一致的是，在这个独立验证队列中，使用HPS的中位数对HiFi肿瘤进行分层(再次与AUROC最佳截断密切一致;在线补充图3)，发现低表达的患者(n=26) IFN α和IFN γ反应信号明显较低(图2 f与高表达组相比，RFS较差(n=26)(复发率分别为46.2%和7.7%;图2 g；最高;log-rank p = 0.00113)。在单因素验证队列中，HPS也是显著的预后因素(HR 0.123, 95% CI (0.027 ~ 0.550)， p=0.006;表1)和多因素分析(HR 0.093, 95% CI (0.019 ~ 0.466)， p=0.004;表1)，这相当于hps低组的复发风险是hps高组的10倍。我们确认了HPS的亚型特异性，因为它在基于结果对LoFi人群进行分层时再次没有提供临床价值(图2 g；底;log-rank p = 0.46596)。

    这个验证队列包含了我们的发现队列中没有的附加分子特征;然而，我们发现HPS与错配修复、CIMP或CIN状态之间没有显著联系，也没有突变TP53，喀斯特而且BRAF（在线补充图4F)．虽然绝大多数HiFi肿瘤是CMS4，但我们发现各种CMS的比例也没有显著差异3.结直肠固有亚型27HPS组之间的分组(在线补充图4F)，这表明我们的方法已经识别了用已建立的遗传和转录亚型分析无法识别的hifi特异性生物学。

    stat1介导的生物学定义了HiFi肿瘤的复发

    虽然我们的HPS足以根据RFS将肿瘤分为两组，但我们接下来研究了支撑HPS高和HPS低肿瘤的整体差异生物学。进行独立差异基因表达分析，发现41个基因在发现组和验证组中显著差异表达(BH校正p<0.05);在高特征表达肿瘤中，有30个上调基因和11个下调基因(图3一，表2)．

    查看该表:
    表2

    hifi特异性预后特征鉴别的差异生物学

    Validation of HiFi-specific prognostic biology and association with STAT1 (A) Heatmap displaying upregulated and downregulated genes shared by the differential comparisons between HPS expression groups in the discovery and validation cohorts (n=26 in each subgroup; 30 upregulated and 11 downregulated genes (adjusted p<0.05; table 2)). (B) String network formed by the upregulated genes form a cluster around STAT1. (C) Cumulative gene expression of STAT1 and three of its target genes (PSMB9, IRF1 and TAP1) correlated with expression of the HPS in the discovery (left) and validation cohort (right; t-test both p<0.00001). (D) Boxplots of STAT1 gene expression (left) and protein levels (right) in HiFi patients in the CPTAC cohort according to HPS groups (high n=9 and low n=9; t-tests both p<0.05). (E) Schematic depicting the STAT1, IFN and relapse characteristics associated with the HiFi-specific prognostic signature within HiFi tumours. CPTAC, Clinical Proteomic Tumour Analysis Consortium; HiFi, high-fibroblast; HPS, HiFi-specific prognostic signature.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    hfi特异性预后生物学的验证和与STAT1的关联(A)热图显示发现组和验证组中HPS表达组间差异比较共享的上调和下调基因(每个亚组n=26;上调基因30个，下调基因11个(调整后p<0.05;表2))。(B)上调基因形成的串网络在STAT1周围形成簇。(C)累积基因表达STAT1它的三个靶基因(PSMB9, IRF1而且TAP1)与发现队列(左)和验证队列(右)中HPS的表达相关;t检验p<0.00001)。(D)的箱线图STAT1根据HPS组(高n=9，低n=9;t检验均p<0.05)。(E)描述与HiFi肿瘤中HiFi特异性预后特征相关的STAT1、IFN和复发特征的示意图。临床蛋白质组学肿瘤分析协会;高保真,high-fibroblast;HPS, hfi特异性预后特征。

    使用STRING数据库(string-db.org)来识别和可视化相互作用，上调的基因在STAT1周围形成了一个网络(图3 b)．由于这些分析是基于总的基因表达水平STAT1本身;为了评估下游激活，我们接下来检查STAT1结合它的几个靶基因(STAT1, PSMB9（LMP2)，IRF1而且TAP1)在发现和验证队列中，我们观察到它们的表达与HPS之间有很强的直接正相关(图3 c；Pearson相关系数r=0.70001, r=0.65831， (在线补充图4G)．此外，另外一个独立的II/III期结肠患者队列的分层(临床蛋白质组学肿瘤分析协会，CPTAC)28通过我们的成纤维细胞评分进入HiFi和LoFi，然后使用HPS进行亚分层，验证了在HPS高表达的HiFi患者中STAT1基因和蛋白表达的显著富集(图3 d；t检验p=0.0024和p=0.018)。尽管这些信号通路可以作为肿瘤浸润水平的指标，但我们证明了基于ESTIMATE免疫评分的患者分层17无论是在发现队列还是验证队列中，当专门应用于HiFi患者时，都不足以进行预后分层(在线补充图5A）;左)，并且不一致地对齐到HPS (在线补充图5A；右)。此外，使用CIBERSORT工具比较发现组和验证组免疫细胞的相对丰度，29发现树突状细胞(dc)比例显著增加，这只在发现队列hps高的患者中明显高于hps低的患者，且在验证队列中没有重复出现(在线补充图5B）;t检验p=0.00076和p=0.51333)。

    总之，我们的hfi特异性分析发现，HPS的表达升高，根据ifn - α、ifn - γ和stat1相关的生物信号来区分原发肿瘤，与疾病复发显著相关，特别是在富基质细胞CC中(图3 e)．

    HiFi特异性stat1相关预后生物学与较高水平的免疫谱系特异性抗原处理和呈递相关

    利用从结直肠肿瘤组织(GSE39396)分离的白细胞、上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞系中提取的转录数据，30.我们确定，与其他细胞类型相比，七个HPS基因中的六个与肿瘤浸润免疫谱系高度相关(图4一)．与功能活跃的STAT1信号一致(图3 c)，我们观察到主要组织相容性(MHC) I类受体的表达增加，抗原，HLA-B而且HLA-C，与两组患者的HPS相关(在线补充图5C）;t检验p<0.05, HPS中位数上下;HLA-B在发现队列中使用的数组上不存在)。此外，抗原处理和呈递(APP)机制的适应性和先天免疫信号通路升高，以及ssGSEA基因本体论评分(图4罪犯, (在线补充图5D)都与高HPS相关。我们接下来检查了纯化免疫谱系(GSE24759)中HPS表达和APP之间的关联，31揭示了HPS表达(最初从大块肿瘤中识别;图4 c)和成熟抗原提呈细胞(APC)的APP信号(在线补充图5E；皮尔逊相关系数r=0.89974, p=1.36×10−11)．从另一个独立的CRC肿瘤队列中分离出的肿瘤浸润免疫人群，对其单细胞RNA-Seq数据进行查询，32再次证实了HPS表达的显著提高(图4 e；t检验p<0.0001)和APP信号(图4 f；t检验所有p<0.0001)在肿瘤浸润单核细胞和巨噬细胞中，并且在树突状细胞中比上皮细胞和CAF细胞中更广泛。

    CRC tumour single-cell data confirms immune-specific nature of signature. (A) Gene expression of individual genes within the HPS according to a public dataset of CRC cell lineages purified by fluorescence-activated cell sorting (FACS) (n=4 populations from n=6 patients; total n=24). (B) Enrichment for APP, adaptive and innate signalling in HPS high group compared with low in HiFi tumours from the discovery cohort (left) (red=adjusted p<0.05). Correlation between ssGSEA scores for APP and HPS gene expression in the discovery cohort (Pearson’s correlation r=0.5, p=1.4e-06; right). (C) Enrichment for APP, adaptive and innate signalling in HPS high group compared with low in HiFi tumours from the validation cohort (left). Correlation between ssGSEA scores for APP and HPS gene expression in the validation cohort (Pearson’s correlation r=0.6, p=1.5e-05; right). (D) Enrichment for APP using pairwise GSEA in HPS high group compared with low in HIFI tumours from both the discovery and validation cohorts. (E, F) Immune cell populations have significantly higher expression of the HPS (E) and GO APP ssGSEA scores (F) than epithelial cells and fibroblasts (t-test both p<2.2e-16). (G) Expression levels of HPS genes and STAT1-related targets and (H) APP ssGSEA scores in bone-marrow derived macrophages with either wild-type (WT), mutant (Y701F mut) or knockout (KO) STAT1 (n=3 for each genotype) (t-test). (I) Pairwise GSEA for GO APP, interferon alpha and gamma response in WT V STAT1 KO mouse macrophages. (n=3 per genotype). APP, antigen processing and presentation; CRC, colorectal cancer; GSEA, gene set enrichment analysis; HiFi, high-fibroblast; HPS, HiFi-specific prognostic signature; ssGSEA, single-sample GSEA.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    CRC肿瘤单细胞数据证实了免疫特异性特征。(A)根据荧光激活细胞分选(FACS)纯化的CRC细胞谱系公共数据集(n=4个群体，来自n=6例患者;总n = 24)。(B)与发现队列中HPS高组的HiFi肿瘤低组相比，HPS高组的APP、适应性和先天信号的富集(左)(红色=调整后的p<0.05)。发现队列中APP ssGSEA评分与HPS基因表达的相关性(Pearson 's Correlation r=0.5, p=1.4e-06;右)。(C)与验证队列中HPS高组的HiFi低组相比，HPS高组的APP、适应性和先天信号的富集(左)。验证队列中APP的ssGSEA评分与HPS基因表达的相关性(Pearson 's Correlation r=0.6, p=1.5e-05;右)。(D)与发现组和验证组中HIFI肿瘤的低组相比，在HPS高组中使用成对GSEA富集APP。 (E, F) Immune cell populations have significantly higher expression of the HPS (E) and GO APP ssGSEA scores (F) than epithelial cells and fibroblasts (t-test both p<2.2e-16). (G) Expression levels of HPS genes and STAT1-related targets and (H) APP ssGSEA scores in bone-marrow derived macrophages with either wild-type (WT), mutant (Y701F mut) or knockout (KO)STAT1(每种基因型n=3) (t检验)。(I) WT V STAT1 KO小鼠巨噬细胞中GO APP、干扰素α和γ反应的成对GSEA。(每个基因型n=3)。APP，抗原处理和呈递;CRC，结直肠癌;GSEA，基因集富集分析;高保真,high-fibroblast;HPS, hfi特异性预后特征;ssGSEA，单样本GSEA。

    利用从WT中分离的骨髓源性巨噬细胞(BMDM)的转录数据，Stat1Y701F(显性负)或Stat1-/-小鼠(E-MTAB-3598)，33我们证实了功能性STAT1在调节HPS和STAT1靶基因表达中的重要性(图4 g)，使用ssGSEA (图4 h；t检验)和APP, ifn - α和ifn - γ响应信号使用成对GSEA (图4我)．

    HPS信号与双链RNA和病毒反应级联有关

    转录因子(TF)活性预测，利用DoRothEA资源，识别与HiFi肿瘤中HPS相关的信号传导和表型相关的潜在调控因子(在线补充图6A)表明与STAT1, STAT2， ifn (IRF1, IRF9)和NFκB (Nfkb1, rel, rela, relb) tf (图5一个)．与此同时，我们将独创性途径分析与早期识别的HPS差异基因结合使用(图3一)来预测hifi特异性预后生物学的上游调控因子，与我们目前的发现一致，干扰素γ (IFNG)，IRF7而且STAT1均已确认(图5 b)．此外，合成双链RNA (dsRNA)病毒模拟和TLR3激动剂Poly(I:C)也被确定为与HiFi肿瘤预后相关的stat1介导的信号传导和APP表型的上游调节剂和潜在的治疗剂(图5 b)．Poly(I:C)是一种通过病毒拟态的强效免疫佐剂，可以安全地用于诱导短暂的先天免疫反应和持续的适应反应，值得注意的是，这与我们发现的与HPS (图4 - 5)．我们接下来研究了可能触发差异stat1介导的先天/适应性免疫活性和APP的上游事件，与poly(I:C)的发现一致，这些分析揭示了与病毒反应相关的信号的富集和dsRNA在非复发HiFi肿瘤中的存在，具有高HPS表达(图5汉英)．此外，这种病毒反应依赖于功能性STAT1的存在，强调了信号级联的重要性(图5 f；t检验p < 0.05)。

    IFN and APP signalling cascades are associated with a STAT1-mediated viral/dsRNA response. (A) Activity status of key TF regulons according to HPS groups in the validation cohort (n=26 in each subgroup). (B) Top upstream regulators from an ingenuity pathway analysis (IPA) of the HPS differentially expressed genes in both the discovery and validation cohorts (table 2). (C) Enrichment for multiple viral response gene sets and dsRNA response in HPS high group compared with low in HiFi tumours in the discovery cohort (red=adjusted p<0.05; left). Correlation between ssGSEA scores for viral response and HPS gene expression in the discovery cohort (Pearson’s correlation r=0.6, p=1.1e-08; right). (D) Enrichment for multiple viral response gene sets and dsRNA response in HPS high group compared with low in HiFi tumours in the validation cohort (left) (red=adjusted p<0.05). Correlation between ssGSEA scores for viral response and HPS gene expression in the validation cohort (Pearson’s correlation r=0.7, p=2.4e-08; right). (E) Enrichment for viral response using pair-wise GSEA in non-relapse versus relapse HiFi tumours from both the discovery and validation cohorts. (F) viral response ssGSEA scores in bone-marrow derived macrophages with either wild-type (WT), mutant (Y701F mut) or knockout (KO) STAT1. (n=3 for each genotype) (t-test p<0.05). (G) Schematic detailing role for viral response/dsRNA signalling in regulating STAT1-mediated signalling cascades, HPS, APP and IFN signalling in immune lineages results in a good prognosis HiFi tumour. APP, antigen processing and presentation; CRC, colorectal cancer; ds RNA, double stranded RNA; HiFi, high-fibroblast; HPS, HiFi-specific prognostic signature; ssGSEA, single-sample GSEA; TF, transcription factor.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    IFN和APP信号级联与stat1介导的病毒/dsRNA反应相关。(A)验证队列中根据HPS组(每个子组n=26)的关键TF规则的活性状态。(B)从发现和验证队列中HPS差异表达基因的独创性途径分析(IPA)中获得的上游最高调控因子(表2)．(C)与发现队列中HPS高组的HiFi肿瘤低组相比，HPS高组的多重病毒反应基因集和dsRNA反应的富集(红色=调整后的p<0.05;左)。在发现队列中，病毒应答的ssGSEA评分与HPS基因表达的相关性(Pearson 's Correlation r=0.6, p=1.1e-08;右)。(D)与验证队列中HPS高组的HiFi肿瘤低组相比，HPS高组的多重病毒反应基因集和dsRNA反应的富集(左)(红色=调整后的p<0.05)。验证队列中病毒应答的ssGSEA评分与HPS基因表达的相关性(Pearson 's Correlation r=0.7, p=2.4e-08;右)。(E)在未复发和复发的HiFi肿瘤中使用成对GSEA富集病毒反应。(F)含有野生型(WT)、突变型(Y701F mut)或敲除型(KO)的骨髓源性巨噬细胞的病毒应答ssGSEA评分STAT1．(每个基因型n=3) (t检验p<0.05)。(G)详细描述了病毒应答/dsRNA信号在调节stat1介导的信号级联、HPS、APP和IFN信号在免疫谱系中导致HiFi肿瘤良好预后中的作用。APP，抗原处理和呈递;CRC，结直肠癌;ds RNA，双链RNA;高保真,high-fibroblast;HPS, hfi特异性预后特征;ssGSEA，单样本GSEA;TF，转录因子。

    综上所述，这些数据证实了支持大量肿瘤来源的HPS的生物学与CC中肿瘤浸润专业APC中的功能性STAT1活性和APP显著相关，这可能是HiFi肿瘤子集中dsRNA和/或病毒反应的下游(图5克)．

    TLR3激动剂聚(I:C)提高了与HiFi CRC预后改善相关的机制表型

    在原代人巨噬细胞免疫谱系(GSE46599, GSE1925和GSE41295)中检测ifn - α (IFNA)， ifn - γ (IFNG)或聚(I:C)证实了它们诱导HPS基因表达的能力，同时增加的表达STAT1及其靶基因(图6)．聚(I:C)的一种治疗形式最近在一些I期临床试验中显示出良好的安全性34 35；因此，我们选择poly(I:C)进行进一步的测试。使用小鼠DC模型(GSE46478)，我们观察到聚(I:C)治疗后HPS基因和stat1相关基因的表达增加，同时显著诱导相同的STAT、IFN和NFκB调控(图6 b)、ifn - α反应、ifn - γ反应和APP与HiFi肿瘤的预后相关(图6 c)．这些结果在RAW264.7巨噬细胞模型(GSE15066;图6D和E)．

    The TLR3 agonist poly(I:C) could be a potential treatment for HiFi (A) gene expression of HPS and STAT1 targets in human macrophages from different datasets treated with interferon (IFN) alpha (left) (n=3), IFN gamma (middle) (n=6) and poly(I:C) (right) (n=4) compared with untreated control samples (n=>3). (B) gene expression of HPS and STAT1 targets (left) and TF activity (right) in dendritic cells from mice treated with poly(I:C) (n=14) or untreated. (C) pair-wise GSEA of IFN alpha and gamma response, alongside APP gene sets in dendritic cells from mice treated with poly(I:C) or untreated. (D) Gene expression of HPS and STAT1 targets (left) and TF activity (right) in raw macrophage cells treated with poly(I:C) (n=12) or untreated. (E) Pair-wise GSEA of IFN alpha and gamma response, alongside APP gene sets in RAW macrophage cells treated with poly(I:C) or untreated. (F) Flow cytometry analysis of antigen processing in a co-culture comprised of primary mouse mesenchymal stromal cells (MSCs) and the mouse macrophage cell line RAW264.7, incubated with fluorescently labelled ovalbumin protein (DQ-Ova) and treated with either poly(I:C) or control (n=3) (t-test p<0.05). (G). differentially expressed genes (logFC >2 and adjusted p<0.001) in Poly(I:C) treated vs non-treated dendritic cells creating the ‘Poly(I:C) Signature’. (H) Enrichment for Poly(I:C) Signature using pair-wise GSEA in HPS high group compared with low in HiFi tumours from both the discovery and validation cohorts. APP, antigen processing and presentation; HiFi, high-fibroblast; HPS, HiFi-specific prognostic signature; TF, transcription factor.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    与未处理的对照样本(n=>3)相比，TLR3激动剂poly(I:C)可能是一种潜在的治疗人类巨噬细胞中HPS和STAT1靶点HiFi (a)基因表达的治疗方法，来自不同的数据集，分别用干扰素(IFN) α(左)(n=3)， IFN γ(中)(n=6)和poly(I:C)(右)(n=4)处理。(B)经poly(I:C)处理(n=14)或未处理的小鼠树突状细胞中HPS和STAT1靶点的基因表达(左)和TF活性(右)。(C)使用聚(I:C)或未使用聚(I:C)的小鼠树突状细胞中IFN α和γ反应的成对GSEA，以及APP基因集。(D)经poly(I:C)处理(n=12)或未处理的原始巨噬细胞中HPS和STAT1靶点的基因表达(左)和TF活性(右)。(E)在经poly(I:C)处理或未处理的RAW巨噬细胞中，IFN α和γ反应的成对GSEA，以及APP基因集。(F)原代小鼠间充质间质细胞(MSCs)和小鼠巨噬细胞系RAW264.7共培养抗原处理的流式细胞术分析，与荧光标记的卵清蛋白(DQ-Ova)孵育，用poly(I:C)或对照(n=3)处理(t检验p<0.05)。(G). Poly(I:C)处理过的树突状细胞与未处理过的树突状细胞中差异表达的基因(logFC >2和校正p<0.001)产生“Poly(I:C)签名”。(H)在HPS高组中使用成对GSEA富集Poly(I:C)签名，而在发现组和验证组的HiFi肿瘤中使用GSEA富集Poly(I:C)签名。APP，抗原处理和呈递;高保真,high-fibroblast; HPS, HiFi-specific prognostic signature; TF, transcription factor.

    此外，为了补充这种转录信号，并验证其效用在网上测量APP，我们接下来执行在体外抗原处理的表型测量，使用荧光标记的卵蛋白(DQ-ova)在RAW264.7巨噬细胞模型中，与肿瘤条件下的原代间充质间质细胞共培养，以代表HiFi肿瘤微环境(TME)的间质环境(图6 f)．为了支持聚(I:C)在这种环境下的潜在治疗相关性，来自聚(I:C)处理的共培养物的巨噬细胞在该模型中具有显著较高的DQ-ova荧光，因此诱导抗原处理(图6 f；t检验p=0.036，(在线补充图6BC)。为了评估在免疫谱系中dsRNA/Poly(I:C)反应是否可以诱导大量肿瘤样本中与HPS相关的关键特征，我们创建了一个“Poly(I:C)签名”，从Poly(I:C)处理的dc (n=75个(人)差异表达基因(Poly(I:C))。图6 b) (logFC >2，调整后p<0.001) (图6克，(在线补充表4)。根据HiFi样本中的HPS亚群使用GSEA，在HPS高组和HPS低组(图6 h(在线补充图6D)，进一步证实了HPS的生物学基础可以通过免疫细胞中的病毒样dsrna反应进行治疗诱导。

    虽然之前的研究已经描述了聚(I:C)在肿瘤模型(主要是黑色素瘤)中的疗效，但它在cms4相关的基因工程小鼠模型(GEMM)中减少转移的能力尚未得到测试。为此，我们评估了一系列先前描述的GEMMs，以识别与HiFi转录信号和组织学相关的基因型。这些分析表明，最近开发的富基质CMS4模型;喀斯特G12D / +，Trp53fl / fl(KP)和含有NOTCH1细胞内结构域(KPN)的KP36显示明显较高的成纤维细胞评分(图7)和基质组织学(图7 b)与许多的相比Apc的模型。

    In vivo validation of poly(I:C) in HiFi model (A) CMS classification according to fibroblast score of GEMM genotypes. (A=Apc fl/fl, K=Kras G12D/+, p=p53 fl/fl and n=Notch1Tg/+) (t-test p<0.01). (B) Stromal scores from H&E slides using digital pathology applied to GEMM tissue. (C) Waterfall plot of fibroblast scores indicating CMS classification in GEMMs. (D) comparison of HiFi (n=10) and LoFi (n=10) GEMMs using previously published stromal signatures and gene sets as assessed in figure 1G. (E) Pairwise GSEA of the APP gene set in CMS4 KP compared with CMS4 KPN. (F) Intrasplenic metastasis assay with KPN models in vivo treated with poly(I:C) compared with saline control. (G) Digital pathology assessment of H&E from in vivo studies demonstrates reduced liver metastasis in mice treated with poly(I:C) (n=16) compared with saline control (n=13) (Mann-Whitney U test). (H) Flow cytometry assessment of CD3 +cell populations from liver metastases in treatment groups highlight significant elevation of CD8 +T cells alongside significant reduction in CD4 +T cells in poly(I:C) arm (n=6) compared with saline (n=5) (Mann-Whitney U test; both p<0.05). APP, antigen processing and presentation; CMS, consensus molecular subtypes; GEMM, genetically engineered mouse model; HiFi, high fibroblast; LoFi, low fibroblast. *** denotes p<0.0002, ** denotes p<0.05.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    聚(I:C)在HiFi模型中的体内验证(A) CMS根据成纤维细胞评分的GEMM基因型进行分类。(=Apcfl / flK =喀斯特G12D / +, p =p53fl / fl和n =Notch1Tg/+) (t检验p<0.01)。(B)使用数字病理学技术对GEMM组织进行H&E切片的基质评分。(C)成纤维细胞评分瀑布图，指示GEMMs中CMS的分类。(D)比较HiFi (n=10)和LoFi (n=10) GEMMs使用之前发表的基质特征和基因集评估图1 g．(E)与CMS4 KPN相比，CMS4 KP中APP基因集的成对GSEA。(F)用聚(I:C)处理的KPN模型与生理盐水对照进行脾内转移检测。(G)来自体内研究的H&E数字病理学评估显示，与生理盐水对照组(n=13)相比，聚(I:C)治疗小鼠(n=16)的肝转移减少(Mann-Whitney U检验)。(H)与生理盐水组(n=5)相比，治疗组肝转移瘤的CD3 +细胞群的流式细胞术评估显示，聚(I:C)组(n=6) CD8 +T细胞显著升高，CD4 +T细胞显著降低(Mann-Whitney U检验;p < 0.05)。APP，抗原处理和呈递;CMS，共识分子亚型;基因工程小鼠模型GEMM;HiFi，高成纤维细胞; LoFi, low fibroblast. *** denotes p<0.0002, ** denotes p<0.05.

    根据我们的发现和验证，人类队列(图1 e而且在线补充图4C)，我们发现CMS4分级和成纤维细胞评分之间有很强的关联(图7 c)．此外，对HiFi和LoFi人类肿瘤中观察到的相同信号的评估(图1 g, (在线补充图4E)揭示了与LoFi GEMMs相比，HiFi/CMS4 GEMMs中HiFi相关信号级联如EMT、肌生成和TGF-β信号的富集模式类似(图7 d)．虽然KP和KPN模型都与HiFi/CMS4分类相关，但鉴于先前报道的高转移性，KPN模型是预后不良的HiFi模型中最具代表性的。36

    与这种不良预后一致，我们观察到与CMS4 KP模型相比，CMS4 KPNs中的APP信号明显减少(图7 e；NES = 1.8)。因此，我们选择KPN模型，通过脾内注射转移试验(图7 f)．脾KPN植入后，聚(I:C)治疗(术后9 - 42天，每两周腹腔注射4mg /kg)显著降低体内肝转移负担，通过数字组织学评估(图7 g；合并体内结果Mann-Whitney U p<0.0002)。（在线补充图7A）;个体体内实验)，验证了我们的硅胶和体外分析，并支持其在此背景下的临床转化。在终点，肝转移的FLOW分析(在线补充图7B)显示，与生理盐水对照组相比，聚(I:C)处理小鼠中CD3 +CD8+细胞毒性T细胞显著升高，CD3 +CD4+T细胞显著减少(图7 h；Mann-Whitney U均p<0.05)。

    讨论

    我们和其他人之前已经证明了CRC亚型是如何严重受TME的组成影响的，以及在富含成纤维细胞、CMS4和茎样亚型中与不良预后的显著关联。37-42与富含上皮的亚型相比，富含基质的肿瘤显示与TGF-β和其他基质生物学相关的信号上调，这种信号上调通常被用作靶向这些通路作为潜在治疗方案的基本原理。虽然大量的临床前数据支持TGF-β阻断作为一个有前途的靶点，在在体外而且在活的有机体内即使在过去十年中进行了大量临床试验，研究也没有转化为对富间质肿瘤的临床疗效。43 44目前，TGF-β阻断剂与免疫治疗相结合的研究已取得重大进展，但仍有可能产生临床效益。然而，在这项研究中，我们揭示了与疾病复发相关的生物学在富间质肿瘤(TGF-β信号均匀升高)是一种恶性肿瘤不与区分富间质亚型和富上皮亚型的生物学相关，也与非分层的II/III期CC队列的一般预后因素相关。因此，我们着手确定具体支持复发的预后生物学在并利用这一新认识来确定治疗的弱点，以减少预后不良患者组的复发率。该方法揭示了免疫谱系中病毒/dsRNA反应下游stat1介导的APP信号水平升高仅与HiFi肿瘤中RFS的改善相关;在预后相对良好的LoFi组中没有提供预后价值的信号。此外，我们证明了这种生物学的治疗潜力，因为聚(I:C)治疗导致HiFi肿瘤中与良好预后相关的信号和表型的升高，最重要的是，在富间质CC小鼠模型中显著减少肝转移。这里提供的数据揭示了一种亚型特异性治疗方法，通过聚(I:C)介导，可能改善预后不良患者的预后。早期CC高成纤维细胞亚型(图8)．

    Graphical summary
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图8
    图8

    图形化的总结

    本体论/通路引导的转录分析方法具有识别与特定亚组相关的生物学上有意义的信息的优势，在我们的案例中，HiFi肿瘤的复发，而不是可能被肿瘤内异质性等问题混淆的单个基因39 45或者分析平台/方法之间的技术差异。46此外，我们的研究旨在识别与改善结果相关的升高表型及其调控因子，以提供促进这种生物学的新治疗方案;与那些依赖于试图下调或抑制生物学的方法相比，这种方法已知可以提供更多的生物学见解和更成功的治疗结果，后者可能会被脱靶效应所迷惑。47这里使用的整体发现方法，结合了生物学知识，使用的是来自印记集合的经过实验验证的签名，48表明stat1介导的病毒/dsRNA应答下游APP与HiFi肿瘤复发率降低相关，而复发率又可通过IFNA、IFNG和dsRNA TLR3激动剂poly(I:C)的治疗诱导。

    干扰素疗法已经在多种癌症类型中进行了试验，但由于剂量限制毒性，其疗效一直受到阻碍。49使用TLR激动剂的试验可以诱导IFN的产生，同时与外源IFN处理相比产生的副作用更少。49在poly(I:C)治疗后，许多人或小鼠巨噬细胞和dc显示出相同的转录信号和APP激活，区分预后良好和不良的HiFi肿瘤，并足以减少HiFi特异性小鼠模型中的转移病灶。最近的一项乳腺癌研究也表明DC亚型的预后价值依赖于肿瘤本身的亚型，因为在三阴性乳腺癌中，浆细胞样DC和cDC2细胞特异性的特征是预后的，但在管腔亚型中不是。50与此相一致的是，我们确定的与HiFi肿瘤预后相关的生物学在LoFi患者中没有预后价值。

    在复发率降低的HiFi肿瘤中观察到dsRNA和病毒应答信号的升高，这可能为这种STAT1和ifn相关生物学在不同HiFi肿瘤亚群中的差异激活状态提供了生物学解释。在最近的一项胰腺癌研究中发现，这些同样的级联反应的激活是内源性逆转录病毒转录本表达增加的下游结果。51在我们的研究中，我们强调了功能性STAT1在特定免疫谱系和与HiFi肿瘤改善预后相关的APP表型中调节这种潜在的病毒模拟信号的本质。肿瘤浸润树突状细胞的数量和功能的增加与多种癌症的预后相关，52虽然dsRNA和病毒信号可以驱动它们的激活，但我们不能排除这些dc也受到我们研究中其他未发现的tme相关因子的调控，包括细胞因子和其他可溶性因子。本文提供的数据已经揭示了HiFi肿瘤预后不良的一些关键的生物级联，然而，额外的分泌组、表观遗传学和微生物组分析将有助于识别特定免疫谱系中调节激活和存活的因素，或在树突状细胞的情况下，通过调节它们的承担、周转和树突生成的因素的量化。

    通过生长因子FLT3L的预处理，DC谱系的扩展和激活，促进了造血祖细胞中的DC承诺和随后的DC激活和生长，然后是聚(I:C)治疗，已经证明了作为一种改善黑色素瘤模型中检查点封锁反应的方法的实用性。53最近关于CC新辅助免疫肿瘤治疗(CTLA4和PD1联合阻断)的安全性和有效性的数据证实了局部结肠肿瘤新辅助治疗计划的临床前景的变化。54该临床试验的结果表明，尽管微卫星不稳定性高的肿瘤普遍表现出对治疗的病理反应，但只有27%的微卫星稳定性肿瘤有反应;一个迫切需要治疗干预的群体，可以重新启动被抑制的先天免疫系统，并最终重新启动肿瘤免疫监测。综合起来，我们的子类型特异性在网上数据，以及在体外而且在活的有机体内本研究的数据有力地支持了聚(I:C)作为新辅助治疗的一种新治疗选择的临床试验，以补充当前的辅助治疗标准，降低基质丰富的CC患者的复发率。

    总之，我们基于肿瘤的发现和验证，与在体外而且在活的有机体内模型已经确定了病毒/dsRNA反应和IFN信号的关键作用，stat1介导级联的上游，反过来驱动先天适应性免疫激活，作为富基质CRC复发的关键中介。本文提供的数据为临床检测聚(I:C)作为一种新的治疗选择，降低早期CC预后最差组的转移复发率提供了强有力的生物学基础。

    方法

    更多的方法细节可在在线补充材料1．研究综述，包括方法和标准使用在在线补充图8．使用BioRender.com设计的原理图。

    患者数据集和数据处理

    该发现的转录数据集先前用于fda批准的II期ColDx/GeneFx检测的开发，20.包括215名II期CC患者(ArrayExpress登录号E-MTAB-863)。由于这是一个已有的队列，我们没有进行样本量功率计算。临床病理信息在线补充表2)．II/III阶段未经处理的CC验证数据集(GSE39582)作为CEL文件从GEO下载，然后以与发现数据集相同的方式进行处理(详细信息见下文)在线补充方法)．临床病理信息在线补充表3．来自CPTAC的RNA-seq和无标签蛋白质组数据28结肠腺癌队列(n=100)下载自http://linkedomicsorg/cptac-colon/．使用S:CORT项目中的患者材料得到了伦理委员会的批准(REC 15/EE/0241)。GSE39396:来自6名CRC患者的荧光激活细胞(FACS)纯化细胞(CD45 +白细胞，FAP +成纤维细胞，CD31 +内皮细胞和Epcam +上皮细胞)。数据从GEO以log2 RMA归一化形式检索。

    生存分析

    所有生存分析均使用生存包(V.3.2-13)在R中进行。Kaplan-Meier曲线和Cox比例风险模型采用基因表达中值将患者分为高/低组。在发现队列中，进行单变量Cox比例风险回归分析，以确定与RFS相关的基因。根据年龄、性别、pT分期、肿瘤位置、肿瘤分化等级、肿瘤亚型(黏液/非黏液)、淋巴血管浸润和淋巴结数量等因素对可能性p<0.20的基因进行多变量Cox分析。共纳入214个样本(其中一个样本因缺乏临床病理信息而被删除)。验证数据集中的多变量分析根据年龄、性别、TNM分期和肿瘤位置进行了调整。模型中的所有变量都是不显著的(p>0.05)，使用cox的发现队列和验证队列都满足比例风险假设。zph函数。

    免疫谱系数据集

    GSE24759: 38个纯化的人类造血细胞群。31GSE46599:原代人单核细胞分化为巨噬细胞，用干扰素处理。55GSE1925:原代人单核细胞，分化为巨噬细胞，用干扰素处理。56GSE41295;原代人单核细胞分化为巨噬细胞，用聚(I:C)处理。57GSE46478:来自C57BL/6小鼠的主要dc。58GSE15066:小鼠巨噬细胞系RAW264.7被poly(I:C)刺激。59E-MTAB-3598: BMDM从WT分离，Stat1Y701F或Stat1-/-老鼠。33所有这些数据集被分解到基因水平使用相同的方法对病人数据概述在线补充方法部分。

    单细胞RNA-Seq数据的生成之前已经发表过32并在在线补充方法．

    GEMM数据集描述符和组织学

    详细资料请参阅在线补充方法．简单地说，所有的动物实验都是按照英国内政部项目许可证(70/9112)进行的，遵守reach指南，并由当地动物福利和格拉斯哥大学的伦理审查委员会进行审查。组织学评估是对先前建立和描述的队列进行的，作为acccelerator计划(https://www.beatson.gla.ac.uk/ACRCelerate/acrcelerate.html)．

    KPN脾内模型

    按照先前的描述进行脾内注射(Jackstadt等）36使用来自单个C57BL/6的肝转移器官的细胞悬液喀斯特G12D / +，Trp53fl / fl，构成激活NOTCH1 (KPN)小鼠。供体和受体小鼠性别和品系匹配。植入后9天，小鼠每两周腹腔注射聚(I:C) 4mg /kg生理盐水(n=6)或生理盐水对照(n=6;N =5用于组织处理)直到第42天取样。在不进行治疗的情况下，记录体重和肝脏重量，并量化总肝转移。用n=12聚(I:C)和n=12盐水重复研究，结果相似。

    小鼠模型组织加工

    肝转移灶活检取流式细胞术，其余固定在10%中性缓冲福尔马林中，用标准组织学处理成石蜡。切取5个m切片进行H&E染色。

    流式细胞术的样品处理和染色

    详细的协议和门控策略包含在在线补充方法，在线补充数据部分。对FlowJo V.10.7.2进行分析。根据活/死染色、单细胞和CD45 +细胞的活细胞状态对细胞进行门控。从这里，数据采样降至每个样本12 000个事件，并确定CD3+ CD4+和CD3+CD8+细胞。

    转移得分

    肝H&E切片用Aperio AT2切片扫描仪扫描20倍，导入svs文件)到QuPath v0.2.3。像素阈值(分辨率:4.02µm/px;通道:平均通道;预滤器:高斯;平滑σ: 3.0;阈值:200.0)用于量化总组织面积。在每张幻灯片上都手工标注了肝转移灶。平均组织和肝脏转移面积被用来计算每只小鼠的肿瘤负担百分比。

    数据可用性声明

    数据可在一个公共的、开放访问的存储库中获得。

    伦理语句

    病人同意发表

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    补充材料

    脚注

    • SMC、AMM和TRL是联合第一作者。

    • 推特@ShaniaMCorry， @NiamhLeonard5， @DrPipDunne

    • 贡献者研究概念与设计:SC、AmM、ML、PDD。进行实验并解释结果:SC, AmM, TL, NL, NF, RMB, PT, XL, RA, KLR, AoM, SaM, MG, MW, SDR, RJ, ADC, SaM, SiM, DL, MBL, HGC, EK, ST, TM, SJL, DS, AR, OJS, ML, PDD。数据生成:SC, AmM, TL, NL, NF, PT, XL, RA, KLR, ER, SS, SDR, DS, AR, PDD。草稿:SC, AmM, ML, PDD。审稿:所有作者。担保人:PDD。

    • 资金该研究由CRUK早期检测项目资助(A29834;PDD)，一个国际加速器奖，accelerate，由英国癌症研究中心(A26825和A28223)， FC AECC (GEACC18004TAB)和AIRC(22795)共同资助，CRUK核心基金(A21139;橙汁。A17196和A31287;CRUK Beatson研究所)、女王大学贝尔法斯特基金会赠款、CRUK贝尔法斯特实验癌症医学中心、MRC‐CRUK分层医学项目联合赠款(S:CORT;MR/M016587/1)和英国健康数据研究实质性站点赠款。我们感谢帕特里克·G·约翰斯顿癌症研究应用基因组学中心的生物信息学支持。

    • 免责声明本稿件反映作者的观点，可能不反映资助者的意见或观点。

    • 相互竞争的利益ML获得了来自辉瑞、EMF Serono和罗氏的酬金，用于与本工作无关的演讲;ML从辉瑞公司获得了不受限制的教育资助，用于与本研究无关的研究。PT从BMS、默克、罗氏、礼来和赛诺菲-安万特获得了与目前工作无关的酬金和差旅费。作者声明没有其他潜在的利益冲突。

    • 患者和公众的参与患者和/或公众未参与本研究的设计、实施、报告或传播计划。

    • 来源和同行评审不是委托;外部同行评审。

    • 代码的可用性复制所有结果的脚本和源文件将存放在我们的实验室网站(www.dunne-lab.com)上。

    • 补充材料本内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅仅是那些作者(s)和不被BMJ认可。BMJ放弃从放在内容上的任何依赖产生的所有责任和责任。如果内容包含任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且不对翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏负责。