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摘要
客观的先天免疫在胰腺导管腺癌(PDAC)这种非t细胞富集的肿瘤中起重要作用。中性粒细胞是先天性免疫系统的主要参与者。在这里，我们旨在探索PDAC中中性粒细胞的异质性和促肿瘤机制。
设计我们分析了5例PDAC患者的外周血多形核白细胞(PMNs)和肿瘤浸润免疫细胞的单细胞转录组，并进行了免疫荧光/免疫组化染色、多组学分析和分析在体外实验验证生物信息学分析的发现。
结果对肿瘤相关中性粒细胞(TANs)异质性的探索揭示了与预后不良相关的最终分化的促肿瘤亚群(TAN-1)，炎症亚群(TAN-2)，刚刚迁移到肿瘤微环境的过渡阶段人群(TAN-3)和优先表达干扰素刺激基因的亚群(TAN-4)。糖酵解信号沿中性粒细胞转变轨迹上调，TAN-1糖酵解活性亢进。通过转录组学、蛋白质组学和代谢组学的综合多组学方法验证了TANs的糖酵解开关。LDHA过表达激活糖酵解活性诱导中性粒细胞样分化HL-60 (HL-60)细胞的免疫抑制和促肿瘤功能。机制研究表明，缺氧和内质网应激下游的BHLHE40是中性粒细胞向TAN-1表型极化的关键调节因子，染色质免疫沉淀试验证实了BHLHE40对TAN-1标记基因的直接转录调控。过表达BHLHE40的dHL-60细胞具有促肿瘤和免疫抑制功能。重要的是，PDAC组织的免疫组化分析揭示了BHLHE40的不良预后价值+中性粒细胞。
结论本研究揭示的TANs的动态特性将有助于推进针对先天免疫的PDAC治疗。
- 胰腺癌
- 免疫疗法
- 葡萄糖代谢
数据可用性声明
数据可以在一个公共的、开放访问的存储库中获得。本研究产生的单细胞和批量RNA测序数据存入国家组学数据百科全书(NODE)，登录代码为OEP003254。
这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名非商业(CC BY-NC 4.0)许可证发布，该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此基础上进行构建，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是正确引用原始作品，给予适当的荣誉，任何更改都已注明，并且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．
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关于这个话题我们已经知道了什么
作为非T细胞富集的肿瘤，胰腺导管腺癌(PDAC)对当前免疫检查点阻断剂或嵌合抗原受体T的免疫治疗策略反应有限。
在PDAC肿瘤微环境中发现大量肿瘤相关中性粒细胞(TANs)浸润，并被认为是大多数实体肿瘤的重要不利预后因素。
中性粒细胞作为先天性免疫的重要参与者，通过促进细胞增殖、血管生成、组织重塑、免疫抑制和转移等途径促进肿瘤进展。
中性粒细胞是脆弱的细胞，在之前的大多数单细胞rna测序研究中未被检测到，这些研究显示了人类PDAC肿瘤微环境中主要细胞类型的综合基因表达图谱。
这项研究补充了什么
与外周血中性粒细胞相比，TANs是由异质群体组成的。
我们在PDAC肿瘤微环境中观察到四个具有不同特征的中性粒细胞亚群，首次揭示了单细胞水平的中性粒细胞异质性。
在PDAC环境中，具有糖酵解活性和促肿瘤功能的终末分化中性粒细胞亚群与患者预后较差相关。
在PDAC中，糖酵解活性沿中性粒细胞转变轨迹上调。
糖酵解开关促进中性粒细胞的免疫抑制和促肿瘤功能。
BHLHE40由缺氧和内质网应激激活，是驱动中性粒细胞向促肿瘤和免疫抑制亚型转变的关键调节因子。
这项研究如何影响研究、实践和/或政策
我们的工作提供了来自PDAC肿瘤微环境的中性粒细胞的全面图谱。
在我们的研究中，驱动中性粒细胞向促肿瘤亚型发展的分子机制将促进针对PDAC患者的促肿瘤亚簇或TANs免疫代谢的新型免疫疗法的发展，为目前主要基于细胞毒性T细胞作用的免疫疗法提供替代选择。
介绍
胰腺癌主要由胰腺导管腺癌(PDAC)组成，是最致命的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的主要原因之一，5年生存率仅为9%。1免疫检查点阻断或嵌合抗原受体T的免疫治疗策略在PDAC中疗效有限，因为高基质密度会对T细胞浸润形成物理屏障。２ ３在PDAC的免疫结构中观察到极少的抗肿瘤t细胞浸润。4在非t细胞浸润的肿瘤中，需要触发先天免疫激活，从而促进效应t细胞运输的信号，并连接到适应性免疫。5个6因此，针对先天免疫系统的治疗干预可能为目前的PDAC免疫治疗提供替代选择。
与其他实体肿瘤相似，PDAC的特点是在肿瘤微环境中广泛浸润免疫抑制细胞。3 7 8纤维炎症滤液被癌细胞培养以提供有利的微环境，支持肿瘤细胞的免疫逃逸、恶性转化和进展。3 7 8在各种类型的肿瘤浸润免疫细胞中，中性粒细胞在肿瘤进展中的重要作用在过去十年中引起了广泛的研究兴趣。9中性粒细胞是一个高度可塑性的种群，在对各种环境线索的反应中呈现异质表型。9日10n2极化的中性粒细胞代表了肿瘤微环境中的绝大多数中性粒细胞，通过促进肿瘤细胞增殖、血管生成、组织重塑、免疫抑制和转移来支持肿瘤进展。9日10肿瘤相关中性粒细胞(TANs)浸润已被认为是大多数实体性恶性肿瘤的不利预后因素。11然而，仍有证据表明中性粒细胞可以对抗肿瘤进展，因为它们对肿瘤细胞具有直接的细胞毒性12日13或者抗体依赖性细胞毒性。14因此，肿瘤中TANs的特征仍然不清楚。
在之前的一项研究中，对TCGA队列大量rna -测序(RNA-seq)数据的生物信息学分析显示，与其他癌症类型相比，TAN在PDAC中浸润相对丰富，这意味着TANs在PDAC微环境中的重要性。15然而，以往大多数使用单细胞测序方法的研究未能从PDAC组织中检测到人中性粒细胞。月16日我们假设，这是由于中性粒细胞作为具有短寿命的脆弱细胞的性质导致的系统偏向。22中性粒细胞来源颗粒的高敏感性和多种酶是其易损性的原因在体外．22因此，中性粒细胞可能无法在组织消化或单细胞捕获过程中存活。使用BD Rhapsody的基于微井的单细胞捕获方法为表征人类中性粒细胞提供了另一种选择。23日24
在这项研究中，我们成功地利用BD Rhapsody从5名PDAC患者中获得了21 972个中性粒细胞的单细胞转录组。我们探讨了PDAC微环境中TANs的异质性，并通过免疫荧光(IF)和免疫组化(IHC)对PDAC组织进行染色，进一步验证了新发现的中性粒细胞亚型的存在和临床相关性。此外，我们还发现了驱动TANs向促肿瘤表型发展的潜在机制，并确定了与中性粒细胞相关的潜在治疗靶点。
材料与方法
临床样品处理
对于外周血，采用重力沉降法耗尽红细胞，中性粒细胞用CD66b-phycoerythrin (PE)单克隆抗体(BioLegend, 305106)标记，并根据制造商的方案用抗PE珠和MACS柱(Miltenyi)分离。用Tumor Dissociation Kit (Miltenyi, 130-095-929)将PDAC肿瘤组织消化成单细胞悬液。采用CD45微珠和MACS柱(Miltenyi)分离浸润性免疫细胞，采用与外周血相同的方法分离浸润性中性粒细胞。病人登记、样本处理和纯度评估的详细信息载于在线补充方法．
单细胞rna测序和数据分析
单细胞捕获由BD Rhapsody系统完成。根据BD Rhapsody单细胞全转录组扩增工作流程制备整个转录组文库，并使用HiSeq Xten (Illumina, San Diego, California, USA)进行150 bp配对端测序。原始数据处理使用fastp过滤适配器序列和删除低质量的读取。25通过ui -tools识别Cell条码白名单。26利用STAR算法将基于umi的干净数据映射到人类参考基因组(Ensemble V.91)。27为每个样本生成UMI计数矩阵，并导入Seurat R工具包(V.3.2.3)。28聚类分析由Seurat进行，28伪时间轨迹分析采用Monocle2包(V.2.18.0)，29细胞与细胞间的通讯用CellPhoneDB进行分析30.利用单细胞调控网络推理和聚类(SCENIC)分析构建基因调控网络。31中提供了单细胞测序和数据分析的详细描述在线补充方法．
结果
来自外周血和PDAC肿瘤的中性粒细胞单细胞图
基于我们中心的PDAC队列，我们观察到PDAC组织中恶性细胞内或邻近区域有大量TANs浸润(在线补充图S1A-B)，以及伴有高中性粒细胞浸润的PDAC患者预后不良(在线补充图S1C)．为了全面编目肿瘤微环境中中性粒细胞的种群及其与其他免疫滤液的串扰，我们生成了CD66b的单细胞RNA-seq数据+外周血多形核白细胞(PMNs)和CD45+来自5名treatment-naïve PDAC患者的肿瘤浸润免疫细胞。来自健康对照组和慢性胰腺炎患者的pmn也被转录特征为对照组(图1一个，左面板和在线补充表S1)．为了验证基于单细胞RNA-seq的发现，我们收集了配对的CD66b+从24例PDAC患者的外周血和肿瘤组织中提取细胞(分别为PMNs和TANs)进行多组学分析和定量PCR(验证队列1)分析，并招募另外114例患者进行IHC、IF和空间转录组学研究(验证队列2)(图1一个，右侧面板，在线补充图S1D而且在线补充表S2)．
来自外周血和PDAC肿瘤的单细胞图谱，以及PDAC微环境中中性粒细胞和其他细胞之间的细胞-细胞通信。(A)实验流程图解，包括初级队列的单细胞测序研究，验证队列1的多组学分析和定量PCR分析，验证队列2的IHC、IF和ST研究。每个亚组的患者/健康供体数量如图所示。(B) UMAP图描述单细胞测序鉴定的主要细胞类型，包括CD66b+来自健康对照组、慢性胰腺炎患者和PDAC患者外周血的pmn和CD45+PDAC肿瘤组织的免疫滤液。(C)点图描绘了PDAC肿瘤微环境中中性粒细胞与其他细胞之间的配体-受体相互作用。平均表达式和p值由CellPhoneDB (http:// www.cellphonedb.org/)，并分别以圆圈的颜色及大小表示。(D)柱状图描述了PDAC肿瘤微环境中中性粒细胞与其他细胞之间显著配体-受体相互作用的数量。细胞类型标签为(表达配体的细胞类型)→(表达相应受体的细胞类型)。(E) PDAC组织中CD66b和CD68的IF染色。(F)基因集富集分析(GSEA)图显示TANs中TNFα和IL-1通路的富集评分。基于PDAC患者pmn和TANs的单细胞RNA测序(RNA-seq)数据进行通路富集分析。CP，慢性胰腺炎;如果,免疫荧光;包含IHC,免疫组织化学;IL,白介素; HC, healthy controls; NES, normalised enrichment score; NF-κB, nuclear factor kappa B; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma; PMNs, polymorphonuclear leucocytes; ST, spatial transcriptomics; TNF, tumour necrosis factor; UMAP, uniform manifold approximation and projection.
经过初步质量控制，我们从51 823个细胞中获得了96 692 883个独特的转录本，其中33 891个细胞来自外周血，17 932个细胞来自PDAC肿瘤组织(在线补充表S3)．在主成分分析和基于图的聚类分析之后，我们根据已知的细胞类型标记基因，确定了9个细胞簇，分别为中性粒细胞(两个簇)、巨噬细胞、肥大细胞、B细胞、浆细胞、T细胞、导管细胞和成纤维细胞(图1 b，在线补充图S2A-D，在线补充表S4)．我们发现了两种不同类型的中性粒细胞，其中中性粒细胞1在外周血中强烈富集(主要由pmn组成)，而中性粒细胞2只存在于肿瘤组织中(由TANs组成)(图1 b，在线补充图S2E)．
为了比较来自不同来源的中性粒细胞的表达谱，我们通过t-SNE分析可视化了来自每个样本的中性粒细胞的转录组，该分析将高维数据映射到二维空间，并保留了输入对象的成对相似性。32根据t-SNE图，TANs具有独特的RNA谱，而PDAC患者的pmn与健康对照组或慢性胰腺炎患者的pmn非常相似(在线补充图S3A-B)，表明中性粒细胞募集到肿瘤组织后发生了显著的转录重编程。途径富集分析显示，与健康对照/慢性胰腺炎患者相比，PDAC患者的pmn中中性粒细胞分化受到抑制，而在TANs中观察到先天免疫受到抑制，多种癌症相关信号通路激活和深刻的代谢变化(在线补充图S3C)．
细胞-细胞通讯分析显示肿瘤微环境中嗜中性粒细胞和巨噬细胞之间存在密切的串扰
为了探索肿瘤微环境中中性粒细胞和其他免疫细胞之间的串扰，我们应用了CellPhoneDB，这是一个交互式web应用程序，可以根据配体-受体信号数据库推断细胞相互作用。30.值得注意的是，与其他类型的免疫细胞相比，巨噬细胞表达的与中性粒细胞配体对应的受体数量显著增加，反之，巨噬细胞表达的与中性粒细胞表达的受体对应的配体数量也显著增加(图1 c, D)，说明肿瘤微环境中嗜中性粒细胞与巨噬细胞之间存在密切的相互作用。我们的数据表明，肿瘤相关巨噬细胞通过CCL13-CCR1, CCL3-CCR1, CCL3L3-CCR1, CXCL2-CXCR1, CXCL2-CXCR2和CXCL8-CXCR2轴吸引中性粒细胞，而巨噬细胞通过CCL3L3-CCR1轴吸引中性粒细胞(图1 c)．与趋化因子和趋化因子受体表达所暗示的相互募集一致，巨噬细胞和中性粒细胞签名在来自癌症基因组图谱-胰腺腺癌(TCGA-PAAD)队列的treatment-naïve PDAC中呈正相关(在线补充图S4A)．此外，IF染色证实了PDAC组织中嗜中性粒细胞和巨噬细胞之间的物理相似性(图1 e)．值得注意的是，巨噬细胞用促炎细胞因子白细胞介素1 (IL-1)和肿瘤坏死因子(TNF)刺激中性粒细胞(图1 c)，与PMNs相比，TANs中TNFα/核因子κB (NF-κB)和IL-1信号通路被显著激活(图1 f)．有趣的是，PDAC组织的IF染色证实了TANs中TNFα和IL-1下游的NF-κB和MAPK信号通路的激活(通过核中p65和c-JUN的存在显示)(在线补充图S4B)， qPCR分析也显示多个TNFα和IL-1靶基因表达上调(在线补充图S4C),到三十五证实了TNFα和il -1诱导的TANs激活。
来自PDAC肿瘤的tan由异质群体组成
为了进一步研究中性粒细胞的异质性，我们对PDAC患者的pmn和TANs进行了降维和聚类。未经批量效应校正的数据见在线补充图S5A，其中pmn和tan都根据它们的起源样本聚类。批效应校正后，鉴定出6个PMN亚簇和6个TAN亚簇(图2 a, B，在线补充图S5B,C，在线补充表S5,S6)，每个中性粒细胞亚簇都存在于所有PDAC患者样本中(在线补充图S5D)．由于嗜酸性粒细胞标记物Charcot-Leyden晶体半凝集素优先表达，PMN-5被排除(在线补充图S5C)．TAN-5由低质量细胞组成，也被忽略用于进一步分析(在线补充图S5E)．相关分析显示，所有PMN子簇具有相似的表达谱，而TAN子簇彼此之间差异更大(图2 c)，表明肿瘤浸润中性粒细胞是一个异质性群体，这可能是由于肿瘤微环境中不同的环境刺激反应的不同表型。
来自PDAC肿瘤的tan由异质群体组成。(A) UMAP图显示PDAC患者中pmn的亚簇。(B) UMAP图显示PDAC患者的TANs亚簇。所有来自PDAC肿瘤组织的标记为中性粒细胞的细胞都被分析为TANs，包括中性粒细胞团簇1和2图1 b．(C)每个亚簇中性粒细胞表达谱之间的Pearson相关系数。计算每个亚簇中前2000个高变异基因的平均归一化表达量，并进行Pearson相关分析。(D)显示(i) TAN-1亚簇，(ii) TAN-2亚簇，(iii) TAN-3亚簇和(iv) TAN-4亚簇标记基因的小提琴图。(E)不同中性粒细胞亚簇间通路活性的比较。这些通路与中性粒细胞功能相关。通过基因变异分析对每个细胞的通路活性进行评分。T值和p值根据线性模型计算，分析来自一个团的中性粒细胞与所有其他团的中性粒细胞之间的差异，分别用圆圈的颜色和大小表示。(F)中性粒细胞沿二维空间伪时间的轨迹。每个点对应一个单元格。 (G) Heatmap showing the dynamic changes of gene expression along pseudotime. The differentially expressed genes were clustered hierarchically into three groups, and the representative enriched pathways of each group were shown. (H) Expression of TAN-1 marker genes in neutrophil-like dHL-60 cells stimulated with THG, IL-1β, TNFα and hypoxia for 24 hours, analysed by qPCR. qPCR data were normalised to fold over β-actin (housekeeping gene), and represented as mean with SD. *P<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. dHL-60, differentiated HL-60; ER, endoplasmic reticulum; HYP, hypoxia; IL, interleukin; NF-κB, nuclear factor kappa B; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma; PMN, polymorphonuclear leucocytes; qPCR, quantitative PCR; TAN, tumour-associated neutrophils; THG, thapsigargin; TNF, tumour necrosis factor; UMAP, uniform manifold approximation and projection.
考虑到TAN的异质性，我们进一步探讨了每个TAN子簇的特征。值得注意的是，在TAN-0中没有发现聚类特异性的显著特征，因为TAN-0的标记基因在其他TAN亚聚类中也高度表达(在线补充图S5C)．TAN-1可以被识别为“促肿瘤亚群”，它高表达促血管生成因子VEGFA，36促转移因子PLAU37 38LGALS3分子具有多种促进肿瘤进展的功能，包括促进恶性细胞的增殖和干性，促进血管生成，抑制免疫监测，促进M2巨噬细胞分化和促进耐药39 40（图2 d(我))。TAN-2由炎症亚群组成，强烈表达炎症相关基因NLRP3和PDE4B，41 42中性粒细胞激活标记CD6943 44（图2 d(2))。TAN-2也强烈表达促肿瘤分子IL1RN和肾上腺髓质素(ADM) (图2 d(ii))，并被发现支持其他癌症类型的肿瘤进展。45 46在所有的TAN亚簇中，TAN-3的基因表达谱与pmn最相似(图2 c)，以及中性粒细胞跨内皮迁移相关的TAN-3高表达基因(VNN2和SELL，图2 d(3)),47 48这表明TAN-3是一个过渡阶段的中性粒细胞群体，它们刚刚迁移到肿瘤微环境中，从pmn转化为TANs。TAN-4表现出独特的转录特征，表达干扰素(IFN)刺激的基因，包括IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG15和RSAD2 (图2 d(四))。49
为了描述每个中性粒细胞亚簇的功能，我们用基因集变异分析分析了通路活性50（图2 e)．中性粒细胞的正常免疫功能，包括先天免疫反应、吞噬作用、呼吸爆发和中性粒细胞颗粒合成等相关基因在pmn中表达较高。同样，TAN-3也高表达与吞噬、呼吸爆发和中性粒细胞颗粒相关的基因，TAN-4与先天免疫反应相关。然而，与pmn相比，TAN-3和TAN-4优先表现出较高的抗原加工和呈递活性。TAN-1和TAN-2同样表达高水平的趋化因子、细胞因子和血管生成因子。TAN-2也表现出较强的炎症特征表达，与上述炎症基因表达一致。
轨迹分析显示，中性粒细胞最终分化为促肿瘤的TAN-1状态
为了进一步研究中性粒细胞从外周血到肿瘤微环境的动态过渡过程，我们应用了monocle229构建中性粒细胞状态轨迹的伪时间图。轨迹确定以pmn为起点，经过TAN-3作为pmn和TANs之间的过渡状态，然后是以TAN-0和TAN-4为特征的中间肿瘤浸润状态，最后达到TAN-2和TAN-1的最终分化状态(图2 f)．接下来，我们沿着基因轨迹分析了单细胞转录组，并鉴定出1757个表达显著变化的基因，这些基因可以归为三种表达模式:第1组包括基因沿基因轨迹表达水平下降的基因。途径富集分析表明，这些基因与IFN信号通路和先天免疫功能相关。2组基因在肿瘤浸润早期上调，参与吞噬和抗原提呈。3组基因在肿瘤微环境中晚期被激活，在缺氧、内质网(ER)应激、IL-1和TNF信号通路、糖酵解等方面富集(图2 g)．为了进一步探索这些信号通路的激活如何影响中性粒细胞表型，中性粒细胞样分化HL-60细胞(dHL-60)用内质网应激诱导物THG (THG)、促炎细胞因子IL-1β和TNFα以及缺氧处理在体外．有趣的是，我们观察到THG和缺氧都引起了TAN-1标记物表达的显著上调(图2 h)，表明内质网应激和缺氧是TAN-1极化的有力刺激因素。
TAN-1与PDAC患者预后较差相关
为了验证PDAC组织中这些新发现的TAN亚簇，我们进行了IF染色，并证实存在表达每个TAN亚簇标记基因的中性粒细胞(VEGFA, NLRP3, MME和IFIT2) (图3一)．为了进一步研究这些TAN亚型的空间分布，我们用CD66b和TAN亚型的标记基因进行免疫组化(图3 b，在线补充图S6A)．VEGFA的中位数百分比+晒得NLRP3,+黝黑色,居里夫人+TANs和IFIT2+PDAC组织中总细胞的TANs分别为2.6%、1.4%、4.7%和0.9%。值得注意的是，大部分的VEGFA+TANs靠近恶性细胞，在空间上使它们能够进行促肿瘤功能，而IFIT2+TANs常出现于纤维化间质组织(图3 b)．进一步分析临床资料显示VEGFA+TANs与后来的美国癌症联合委员会(AJCC)分期显著相关(在线补充图S6B)和较差的预后(图3 c，在线补充图S6C)。
TAN亚簇的空间分布和临床相关性。(A)中性粒细胞标记基因(CD66b)和TAN亚簇(VEGFA为TAN-1, NLRP3为TAN-2, MME为TAN-3, IFIT2为TAN-4)在PDAC组织上的IF染色。(B)连续载玻片上的代表性PDAC组织的免疫组化图像，显示中性粒细胞标记基因(CD66b)和TAN亚簇(VEGFA为TAN-1, NLRP3为TAN-2, MME为TAN-3, IFIT2为TAN-4)。经CD66b染色，中性粒细胞呈多核形态。粉色箭头显示表达TAN亚簇标记的中性粒细胞。(C)免疫组化分析中显示PDAC患者总体生存期的Kaplan-Meier生存曲线。根据VEGFA百分比将患者平均分为两组+PDAC组织中总细胞中的TANs。(D) TCGA-PAAD队列中具有标准PDAC组织学的treatment-naïve例患者的总生存期Kaplan-Meier生存曲线。根据TAN-1标记基因的表达将患者平均分为两组，通过GSVA评估每个样本中TAN-1标记基因的表达。(E) Kaplan-Meier生存曲线，显示来自Cao发表的数据集的具有标准PDAC组织学的treatment-naïve患者的总生存期等．根据TAN-1标记基因的表达将患者平均分为两组，通过GSVA评估每个样本中TAN-1标记基因的表达。GSVA，基因集变异分析;HPF，大功率场;包含IHC,免疫组织化学;如果,免疫荧光;LPF，低功率场;PDAC，胰导管腺癌;TAN，肿瘤相关中性粒细胞。
为了进一步确认基于公共数据库的TAN-1亚簇的临床相关性，我们检索了TCGA-PAAD队列的RNA-seq和临床数据，51以及曹发表的数据集等．52与我们队列的结果一致，在这两个队列中具有标准PDAC组织学的treatment-naïve患者中，TAN-1特征是不利预后的因素(图3 d e)．
代谢分析显示，糖酵解开关在TANs中，主要在TAN-1上调
考虑到上文所述的肿瘤微环境中中性粒细胞的深刻代谢重编程(在线补充图S3C)，以及代谢程序对免疫细胞功能的显著影响，53 54我们分析了每个TAN亚簇的标志性代谢特征，发现TAN-1的糖酵解和缺氧活性明显高于其他中性粒细胞亚簇(图4一，在线补充图S7A,B)，并沿中性粒细胞转变轨迹上调(图4 b)．流式细胞仪分析显示，从PDAC组织分离的表达TAN-1标记物LGALS3的中性粒细胞中，葡萄糖转运体GLUT1和糖酵解酶HK2、PFKFB3和LDHA的表达上调(图4 c，在线补充图S7C,D)．为了进一步探索TANs的代谢特征是否与其空间分布相关，我们从PDAC组织切片上的2498个点生成了空间转录组(在线补充图S7E,F)，平均每个点检测到约13 095个UMIs和3969个独特基因。有趣的是，与间质区中性粒细胞富集点相比，肿瘤区域内或邻近中性粒细胞富集点的糖酵解活性明显上调(图4 d, E)，暗示PDAC肿瘤微环境中恶性细胞诱导的中性粒细胞糖酵解开关。
代谢分析显示，糖酵解开关在TANs中，主要在TAN-1上调。(A)每个中性粒细胞亚簇中标志性糖酵解和缺氧特征的表达箱状图(左图)和特征基因平均归一化表达的热图(右图)。(B)糖酵解特征和缺氧特征沿伪时间轨迹动态表达的二维图。(C)流式细胞术分析GLUT1、HK2、PFKFB3和LDHA在LGALS3中的表达+和LGALS3−来自PDAC组织的TANs。GLUT1、HK2、PFKFB3和LDHA在LGALS3中的表达的MFI+和LGALS3−测量了4例PDAC患者肿瘤组织中的TANs，并用标准差表示为平均值。(D)肿瘤、邻近肿瘤和间质区中性粒细胞富集点的空间特征图。根据单细胞测序鉴定的中性粒细胞标记基因，采用单样本基因集富集分析(single sample gene set enrichment analysis, ssGSEA)计算各空间点的中性粒细胞特征，将中性粒细胞特征位于前10%的点(ssGSEA评分>0.53)定义为中性粒细胞富集点。(E)显示肿瘤、邻近肿瘤和间质区中性粒细胞富集点糖酵解特征的盒状图。(F-G)显示TANs中HALLMARK糖酵解途径的NES的GSEA图。根据配对CD66b的转录组学(F)和蛋白质组学(G)数据进行通路富集分析+PDAC患者的pmn和TANs。(H) PMN和TAN裂解物中糖酵解中间体的代谢组学分析。数据用标准差表示为均值。(一)糖酵解途径示意图。红色框表示与PDAC患者的PMNs相比，TANs的代谢物显著增加(p<0.05)。MFI，平均荧光强度;NES，归一化富集分数;PDAC，胰导管腺癌;PMN，多形核白细胞;TAN，肿瘤相关中性粒细胞。 *P<0.05.
为了进一步验证TANs的糖酵解开关，我们从19例PDAC患者中分离出成对的pmn和TANs (图1一个)，并应用综合多组学方法比较它们在转录组、蛋白质组和代谢组水平上的糖酵解活性。大量RNA-seq数据分析显示，PMNs和TANs之间有3920个基因表达差异(在线补充表S7)，途径富集分析验证了TANs中糖酵解的上调(图4 f而且在线补充表S8)．同样，根据基于数据独立采集质谱(DIA-MS)的定量蛋白质组学分析确定的蛋白质表达谱(在线补充表S9)，糖酵解途径在TANs中显著富集(图4 g)．中性粒细胞裂解物的代谢组学分析也揭示了TANs中几种糖酵解中间体的显著上调(图4 h,我)．
糖酵解开关增强TANs的促肿瘤功能
接下来，我们研究了糖酵解开关与中性粒细胞促肿瘤功能之间的关系。我们重点研究了糖酵解途径中的关键基因LDHA (图4一)，也是TAN-1的标记基因之一(图2 d(我))。代谢分析显示LDHA在dHL-60细胞中过表达(在线补充图S8A,B)导致葡萄糖消耗量增加(在线补充图S8C)和乳酸生成(在线补充图S8D)，证实ldha过表达的dHL-60糖酵解活性上调。PDAC肿瘤细胞(PATU-8988或Aspc-1)与ldha过表达的dHL-60共培养后增殖能力增强(在线补充图S8E-H)，揭示了中性粒细胞代谢重编程导致的促肿瘤作用。之前的研究表明，ldha相关乳酸在肿瘤微环境中的积累抑制了抗肿瘤免疫监测，55这促使我们研究LDHA过表达对中性粒细胞免疫抑制功能的影响。有趣的是，我们观察到与ldha过表达的dHL-60细胞共培养可降低CD8中IFNγ和TNFα的表达+phorbol 12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)和离子霉素刺激T细胞，以及轻微抑制T细胞增殖以响应CD3/CD28激活(在线补充图S8I,J)．
上游调控因子分析显示BHLHE40驱动中性粒细胞向促肿瘤表型转变
风景优美的31用于评估驱动TANs异质性的上游转录因子(规则)(在线补充图S9A)．我们确定了四个具有独特调控活性的TAN簇，与基于RNA谱的TAN亚簇的原始划分相关(在线补充图S9B,C)．值得注意的是，TAN-1的标记基因之一BHLHE40是TAN-1中上调最显著的转录因子之一(图5一个，在线补充图S9A)．根据SCENIC构成的基因调控网络，BHLHE40是转录因子HIF1A和XBP1的下游靶基因，BHLHE40调控TAN-1标记物VEGFA、PLAU、LGALS3、LDHA和BHLHE40的表达(自动调节)，以及TAN-2标记物PDE4B和IL1RN的表达(图5 b)，提示BHLHE40在缺氧和内质网应激诱导下，在肿瘤微环境中促进中性粒细胞向促肿瘤表型分化。
上游调控因子分析显示BHLHE40是TAN-1的关键转录因子。(A)显示BHLHE40在TANs中的表达的UMAP图(左图)和估计BHLHE40在TANs中的调控活性的曲线下面积(AUC)评分(右图)。(B)单细胞调控网络推断和聚类(SCENIC)揭示的BHLHE40代表性调控网络。(C) BHLHE40靶标在对照和过表达BHLHE40的dHL-60细胞中的表达，用qPCR分析。将每个基因的mRNA表达水平归一化，折叠在β-肌动蛋白(管家基因)之上。数据用标准差表示为均值。(D)通过染色质免疫沉淀- qpcr分析BHLHE40在dHL-60细胞中靶基因启动子区域的结合。(E) THG和/或HYP刺激对照组和BHLHE40敲除的dHL-60细胞24小时后BHLHE40靶标的表达，qPCR分析。将每个基因的mRNA表达水平归一化，折叠在β-肌动蛋白(管家基因)之上。数据用标准差表示为均值。 *P<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001. dHL-60, neutrophil-like differentiated HL-60; HYP, hypoxia; KD, knockdown; mRNA, messenger RNA; NC, negative control; OE, overexpression; THG, thapsigargin; TSS, transcription start site; qPCR, quantitative PCR; TAN, tumour-associated neutrophils; UMAP, uniform manifold approximation and projection.
为了进一步验证BHLHE40的调控作用，我们分析了BHLHE40过表达对中性粒细胞样dHL-60细胞表达谱的影响。qPCR证实BHLHE40过表达导致VEGFA、PLAU、LGALS3、LDHA和PDE4B的表达显著上调(图5 c)．染色质免疫沉淀- qpcr检测也证实BHLHE40与这些基因的启动子区域结合(图5 d)，证明BHLHE40在中性粒细胞中直接调控促肿瘤基因的转录。有趣的是，与SCENIC推测的调控网络一致，我们观察到缺氧和内质网应激显著诱导TAN-1标记物的表达，并且这两个因素有很强的协同作用，而在BHLHE40敲低的dHL-60细胞中TAN-1标记物的诱导显著降低(图5 e)，证明BHLHE40在中性粒细胞向TAN-1表型的极化中起关键作用。
接下来，我们试图探索BHLHE40对中性粒细胞促肿瘤功能的影响。有趣的是，我们观察到与过表达bhlhe40的dHL-60共培养的PDAC细胞增殖和迁移能力显著增强(图6 a, B，在线补充图S9D-F)，表明上游调节因子BHLHE40驱动中性粒细胞向促肿瘤亚型发展。此外，免疫学评价显示过表达bhlhe40的dHL-60细胞对CD8促炎细胞因子产生有抑制作用+T细胞以及淋巴细胞的增殖能力(图6 c, D)，提示BHLHE40可能是髓源性抑制细胞(MDSCs)的潜在调节因子。核bhlhe40阳性TANs经IF染色鉴定(在线补充图S9G)，免疫组化分析显示BHLHE40共定位+PDAC微环境中表达TAN-1标记基因VEGFA的中性粒细胞和中性粒细胞(图6 e)．值得注意的是，BHLHE40的浸润水平较高+中性粒细胞与预后较差相关(图6 f)，进一步证明了上游调控因子BHLHE40在TANs中的促肿瘤作用。
BHLHE40驱动中性粒细胞向促肿瘤表型转变。(A)菌落形成实验，对照和过表达bhlhe40的dHL-60细胞在上腔培养，PATU-8988细胞在下腔培养。菌落数用SD表示为均值。(B)将PATU-8988细胞与对照组和过表达bhlhe40的dHL-60细胞共培养3天，通过transwell法评估其迁移能力。迁移细胞数用标准差表示为平均值。(C) pbmc与对照组和过表达bhlhe40的dHL-60细胞共培养3天，用PMA/离子霉素刺激，并测定IFNγ的百分比+和肿瘤坏死因子α+细胞处于受刺激的CD8中+采用流式细胞术对T细胞进行分析。来自四个不同捐赠者的数据汇总在右边的面板中。(D)用CellTrace Violet染色pmcs，在没有或存在dHL-60细胞(对照或bhlhe40过表达)的情况下，用抗人CD3/CD28刺激4天，CD3增殖+流式细胞术分析淋巴细胞。3个重复培养的增殖指数用SD表示。(E)连续载玻片上CD66b(左)、BHLHE40(中)和VEGFA(右)染色的代表性PDAC组织IHC图像。CD66b染色显示中性粒细胞多核形态。粉色箭头表示表达BHLHE40或VEGFA的中性粒细胞。(F)免疫组化分析中显示PDAC患者总体生存期的Kaplan-Meier生存曲线。根据BHLHE40的百分比将患者平均分为两组+PDAC组织中总细胞中的TANs。* P < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001。中性粒细胞样分化HL-60;HPF，大功率场;干扰素干扰素;包含IHC,免疫组织化学;NC，负控;OE,超表达; PBMCs, peripheral blood mononuclear cells; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma; TAN, tumour-associated neutrophils; TNF, tumour necrosis factor.
讨论
癌症在复杂的微环境中发展，其中肿瘤相关的基质被劫持，以创造一个支持肿瘤进展的有利生态位。3.另一方面，考虑到基质细胞的功能可塑性，它们也能够在再教育中抑制肿瘤生长，56这为开发新的恶性肿瘤治疗策略提供了见解。在PDAC基因工程小鼠模型中，抑制肿瘤微环境中的中性粒细胞浸润导致肿瘤消退和延长生存期，15 57证明了TANs在支持PDAC进展中的作用，表明TANs可能是一个潜在的治疗靶点。
此前的单细胞RNA-seq研究显示了PDAC微环境中主要细胞类型的综合基因表达图谱。月16日然而，尽管PDAC中存在大量的TAN浸润并与不良预后相关，但中性粒细胞的特征研究很少。在本研究中，我们的目标是在单细胞水平上探索PDAC肿瘤微环境中的中性粒细胞异质性，以确定有助于肿瘤进展的特定亚群，并研究推动中性粒细胞走向促肿瘤表型的潜在机制。为了努力描述肿瘤微环境中中性粒细胞的重编程，基于肿瘤微环境中的中性粒细胞不断从循环中招募以响应趋化因子的事实，外周血中的对应物也被描述为对照。9中性粒细胞浸润在非癌性组织中少见。58
中性粒细胞的半衰期很短在活的有机体内(8小时)，非常脆弱在体外，22在肿瘤微环境中很难捕获和破译它们的重编程。值得注意的是，在之前使用10x Genomics Chromium平台对人类PDAC进行的大多数单细胞研究中，没有检测到中性粒细胞，月16日尽管只有一个例外，那就是斯蒂尔等成功分析了PDAC组织中表达典型标记基因的粒细胞。59另外，我们用BD Rhapsody成功获得了21 972个中性粒细胞的表达谱。同样，在一项关于前列腺癌的研究中，BD Rhapsody测序的样本中检测到了粒细胞，而10x Genomics没有获得。24因此，直接比较这两种单细胞测序平台捕获中性粒细胞的能力是有意义的。
中性粒细胞的短寿命和脆弱性也使得研究它们的功能具有挑战性在体外．在这里，我们利用了HL-60细胞系，急性早幼粒细胞白血病细胞，当用二甲基亚砜或其他几种刺激处理时，可以分化为中性粒细胞样状态。60 61这使我们能够研究中性粒细胞的促肿瘤和免疫抑制功能，并研究特定因素如何影响它们的表型和功能状态。尽管dHL-60细胞不能完全替代中性粒细胞，但我们相信该模型的实验为中性粒细胞生物学提供了新的见解。
我们的数据为中性粒细胞在PDAC微环境中过渡状态的连续性提供了证据:中性粒细胞从循环到PDAC微环境的跨内皮迁移，中性粒细胞呈现过渡状态(TAN-3)的表型，然后转向中间状态(TAN-0)，这代表了肿瘤微环境中大多数中性粒细胞没有明显的特征。一小部分中性粒细胞被IFN信号激活并获得n1样表型(TAN-4)。62年9通过肿瘤微环境中的教育，中性粒细胞逐渐转化为炎症状态(TAN-2)，导致癌症相关炎症，并最终分化为TAN-1，优先表达促肿瘤分子的“致病亚群”，与PDAC患者预后较差相关(图7)．Zilionis等破译了肺癌中性粒细胞的多样性，并报道了三个表达模块:(i)表达典型中性粒细胞标记物(S100A8和S100A9)的中性粒细胞，与我们研究中的TAN-3相似;(ii)表达炎症细胞因子和肿瘤前基因的中性粒细胞，对应于TAN-1和TAN-2;中性粒细胞显示强烈表达I型ifn反应基因，类似于TAN-4。63这两个单细胞数据集的比较表明，不同癌症类型的TAN群体结构相似。
本研究主要发现的图表摘要。ER，内质网;PDAC，胰导管腺癌;PMN，多形核白细胞;TAN，肿瘤相关中性粒细胞。
代谢状态影响免疫细胞的表型和极化已被广泛接受。53 54在本研究中，促肿瘤的TAN-1亚群表现出高度活化的糖酵解活性(图4一)，而糖酵解开关与中性粒细胞的促肿瘤功能相关(在线补充图S8)．我们的结果与“反向Warburg效应”模型一致，即非恶性基质细胞中的糖酵解会产生富含能量的代谢物，如乳酸和丙酮酸，这些代谢物可以被癌细胞作为替代TCA循环底物，促进能量的产生和肿瘤的生长。64 65糖酵解酶ldha相关乳酸除能促进恶性细胞增殖外，还可取消肿瘤免疫监测。55 66 67一致地，LDHA在dHL-60细胞中的过表达导致t细胞增殖和激活的抑制(在线补充图S8)．总的来说，糖酵解可能是一个潜在的治疗靶点，以逆转PDAC中中性粒细胞的促肿瘤和免疫抑制活性。
BHLHE40已成为免疫的关键调节因子。据报道，BHLHE40调节T细胞中细胞因子的产生，以及巨噬细胞在稳态和2型免疫中的增殖。68 69然而，对其在中性粒细胞中的作用知之甚少。在我们的研究中，BHLHE40已被确定为缺氧和内质网应激的下游靶点，这是肿瘤微环境中的两种强有力的刺激因子，促使中性粒细胞向促肿瘤的TAN-1表型转变。重要的是，我们的数据表明BHLHE40是促肿瘤中性粒细胞的关键调节因子(图6)．PMN-MDSCs被定义为具有免疫抑制功能的病理激活的中性粒细胞群体。70 71缺氧诱导的HIF1α激活和内质网应激被认为是肿瘤微环境中将中性粒细胞转化为免疫抑制PMN-MDSCs的重要调节因子。71 - 73有趣的是，我们的数据也证明了BHLHE40在调节中性粒细胞免疫抑制功能方面的重要作用(图6)，提示BHLHE40可能是PMN-MDSCs的潜在调节因子。综上所述，我们的研究揭示了BHLHE40作为PDAC中TANs治疗靶点的潜力。
总之，我们在PDAC肿瘤微环境中发现了一个促肿瘤的中性粒细胞亚簇，揭示了高糖酵解活性与TANs促肿瘤功能之间的关联，并证明了缺氧诱导和内质网应激诱导的BHLHE40激活是驱动TANs向促肿瘤表型转变的潜在机制。
数据可用性声明
数据可以在一个公共的、开放访问的存储库中获得。本研究产生的单细胞和批量RNA测序数据存入国家组学数据百科全书(NODE)，登录代码为OEP003254。
伦理语句
患者发表同意书
伦理批准
本研究由上海交通大学医学院附属瑞金医院伦理委员会批准(文献编号2021-161)。参与者在参与研究前已获得知情同意。
致谢
我们感谢NovelBio对单细胞测序的支持。我们感谢上海免疫研究所的苏冰博士和王靖博士仔细阅读了我们的手稿，并提供了有见地的建议。
参考文献
补充材料
脚注
LW、YL、YD、XT贡献均等。
贡献者LW, LJ和BS设计了研究并撰写了手稿。LW, YL, XT, MS, JQ, MX, YC, JL和PL进行了实验。LW, YD和JH进行了生物信息学分析。TY参与蛋白质组学和代谢组学分析。CWa、TW、LD参与病理工作。CWe、JZ、ZX、HC参与患者招募和样本采集。FB, XD, CP和LJ帮助优化研究和校对论文。SC和BS监督了研究并修改了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。BS, SC和LJ作为担保人对整体内容负责。
资金国家自然科学基金(No. 81871906和82073326 to BS, 81802316 to LJ, 82002460 to LW)，中国博士后科学基金(No. 2019M661552 to LW)和上海交通大学基础研究试点项目(No. 21TQ1400205 to LJ)资助。
相互竞争的利益没有宣布。
患者和公众参与患者和/或公众没有参与本研究的设计、实施、报告或传播计划。
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