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客观的评估潜在的混杂因素影响结肠微生物群组成必须基于健壮的微生物疾病的识别标记。在这里,我们研究人类肠道微生物群的变化之间的联系和粪便一致性使用布里斯托尔凳子规模分类,反映了粪便含水量和活动,被认为是代表肠道结肠转运时间。
设计通过16 s rDNA Illumina公司分析粪便样本的53个健康女性,我们评估微生物丰富度之间的联系,拟杆菌门:厚壁菌门比,菌群,并与自我报告属丰富,布里斯托尔凳子Scale-based粪便一致性。计算每个样本的微生物群的增长潜力测试是否渡越时间作为选择性力量肠道细菌的增长。
结果粪便一致性强与所有已知的主要微生物标记。物种丰富度呈负相关,对拟杆菌门呈正相关:厚壁菌门比,和联系Akkermansia和Methanobrevibacter丰富。BSS-scores菌群分布明显。基于微生物群的增长潜力和粪便一致性之间的相关性分数在两种菌群,我们假设,加速运输导致结肠生态系统分化。更短的运输时间可以会增加大量的快速增长物种Ruminococcaceae -拟杆菌样本,暗示冲刷回避策略,快速复制,这一趋势在缺席普氏菌-enterotyped个人。在这个菌群坚持主机却能合成更多形成组织因此似乎更有可能细菌策略应对冲刷。
结论凳子之间的关联强度的一致性和物种丰富度,菌群和社区强调成分在肠道粪便一致性评估的重要性metagenome-wide协会的研究。
- 肠道细菌
- 肠道微生物
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来自Altmetric.com的统计
本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
粪便一致性,布里斯托尔的凳子规模(BSS),反映了不同含水量和结肠生态系统和活动与结肠转运时间。(低分数:公司凳子和缓慢的交通,高分:便溏和快速运输)。
物种丰富度提出了肠道健康的主要标志,因为高细菌丰富性和多样性的想法常常反映出生态系统稳定性和弹性与一致的疾病之间的联系和物种的数量的减少粪便样本。
粪便菌群基因组已经被证明分层进,把人口大约三种可能的星座的肠道微生物生态系统;同样厚壁菌门:拟杆菌门和Prevotellaceae:拟杆菌比例提出了作为肠道微生物组的重要阶层因素。
有什么新发现吗?
观察到的物种丰富度下降与更高的BSS分数达到最低的个体便溏。
菌群分布明显在BSS分数:普氏菌(P)与便溏受试者的菌群是却能合成更多形成丰富而Ruminococcaceae -拟杆菌(RB)菌群完全主导却能合成更多形成粪便样本越困难。
RB中菌群,却能合成更多形成Methanobrevibacter和Akkermansia与结肠转运时间呈正相关。可以为类似的观察Oxalobacter和Butyricimonas,而拟杆菌更丰富的稀粪。
微生物群的增长潜力与BSS得分呈正相关RB菌群,却能合成更多形成暗示渡越时间作为选择性力量微生物生活习性。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
在这里,我们表明,物种丰富度的重大改变或社区组成部分可以反映出粪便一致性的变化,阻碍了识别,特别是鲁棒性和再现性疾病的标记。适当的分析是“因此不可能没有粪便一致性测量。本研究因此强调这些测量的迫切必要性在肠道微生物群研究和临床研究。
介绍
尽管最近的努力进行描述健康的结肠微生物群,1 - 4很多参数可能影响微生物组成和代谢能力仍未开发。这种混杂因素的识别,包括饮食,5,6摄入抗生素的历史,7和炎症状态,8,9定义是至关重要的一个健康的肠道生态系统的边界,因此,识别健壮的疾病标志物在临床微生物组关联研究。
运输时间是肠道微生物栖息地的关键决定因素,影响养分和水沿着肠吸收以及设置的速度腔的微生物种群间隙在排泄。10直接测量的渡越时间通常是不切实际或轻度入侵,它通常被忽视在微生物的研究到目前为止。然而,粪便一致性分类的布里斯托尔凳子规模(BSS)成绩提出了作为结肠运输代理,10 - 12允许评估其影响,即使应用家庭抽样协议。BSS广泛的使用在临床研究和建议的评估便秘和腹泻,胃肠功能紊乱。13 - 15BSS将人类排泄物分为7个类别一致性,得分最高的对应于宽松的凳子和快速运输,而较低的分数代表硬凳子和结肠转运时间更长。10 - 12,16每个类别一致性差异反映了粪便材料的含水率,降低水活动联系起来,长期通过减少养分流动和肠道transit-limiting微生物增长阻碍了酶活性。17因此,BSS分类总结的影响两个主要和塑造肠道生态系统明显related-selective力量:肠道转运率和水的活动。
在这里,我们使用自我报告的BSS分数加上16 s rDNA Illumina公司扩增子的粪便样本53岁健康志愿者评估潜在的微生物群组成和粪便一致性之间的关联。西部一个健康的人口,超过一半的粪便通过预计属于中央BSS类别3和4。11然而,增加发生大便更据报道在女性中更为普遍。11,12,18因此,为了提高抽样的机会更均匀分布的凳子BSS类别,所有我们有限的包容女性志愿者。
方法
样本数据
53健康女性,20-55岁(平均42.5),被招募为佛兰德肠道菌群项目的一部分。没有被诊断出患有癌症和炎症性肠病,或者已经腹泻抑制剂,泻药或益生元在抽样前一周,也没有抗生素之前3个月内抽样(见在线补充表S1)。项目的目标和要求的承诺被解释为意味着信息小册子和所有参与者的知情同意签署了一份声明。参与者的全科医生记录他们的病史,加上身高,体重,和腰部和臀部周长。志愿者记录时间的通便和BSS和报告这些信息连同信息一般饮食和健康状况的问卷调查。
肠道微生物群的细菌组成部分的描述变量地区4 rDNA测序
粪便样本收集后立即冻结在−20°C的参与者。冷冻后运输到集合点在他们的社区和随后的干冰运输,样本存储在−80°C在集合点后72小时内发货,直到DNA提取。根据Godon DNA提取了等。19放大的可变区域4 16 s rRNA基因,我们使用了515 f - 806 r引物(分别GTGCCAGCMGCCGCGGTAA和GGACTACHVGGGTWTCTAAT)修改为包含Illumina公司适配器和条形码序列,以便定向排序。放大进行了一式三份25μL反应包含2μL稀释模板(1:10),2.5μL 10 x AccuPrime PCR缓冲我,0.1μL AccuPrime Taq高保真(5 U /μL)和0.5μL 806 r 515 f和1.0μL底漆(10μM每个引物)。热循环由最初的变性步骤在94°C(3分钟),紧随其后的是30周期的变性(45 s在94°C),退火(60年代在50°C)和90年代在72°C扩展。最后在72°C扩展包括5分钟。扩增子量化在安捷伦2100生物分析仪(美国安捷伦科技,圣克拉拉,加州)和汇集克分子数相等的浓度。片段大小被选中(∼400个基点)通过削减的主要乐队从琼脂糖凝胶,以减少非特异性扩增的产物。最后一个库的大小和量化与安捷伦生物分析仪也进行了。测序进行Illumina公司MiSeq平台(MiSeq试剂盒2,500周期)根据制造商的规格来生成paired-end读取250基地在每个方向的长度。使用fastq-join重叠paired-end读取被合并20.和处理MacQIIME V.1.8。只有Illumina公司读取长度> 250 bp和平均质量分数超过30,保留了进一步分析。读取被分配到业务分类单位(辣子鸡)通过QIIME新创OTU挑选管道。这种方式99.6%、87.6%、53.4%和12.5%的读取是分配给订单,家庭,分别属和物种水平。对绿色煤电封闭OTU挑选QIIME 2013数据库除了执行更严格的分类任务。从OTU丰富和各自的分类学分类、特性丰富矩阵计算在不同分类水平,代表OTU和类群丰富/样品。比较不同的样本,样本数量稀薄到26 260读新创OTU挑选数据集和26 024读封闭OTU挑选和修剪因此缺席辣子鸡phyloseq包最低的基础上在RV.3.0.1类群丰度的总和。
统计分析
统计分析进行了稀薄和修剪功能使用RV.3.0.1丰度矩阵。聚类样本的菌群是使用集群包完成21根据指令上可用http://enterotyping.embl.de。最优数量的集群是由Calinski-Harabasz指数。此外,enterotyping执行了狄利克雷多项混合物(DMM)使用DirichletMultinomial 1.6.0包R。22拉普拉斯是用来确定最优数量的集群通过惩罚模型的复杂性。菌群Ruminoccoccaceae——却能合成更多形成集群被分配拟杆菌或普氏菌基于分类单元控制Arumugam的菌群在原文却能合成更多形成等23(见在线补充表S2)。
物种丰富度(观察,Chao1)和α多样性的测量(Shannon)计算使用phyloseq包。24
每个样本的微生物群的增长潜力估计的平均值的最大增长率(maxGRs)属,加权丰度在示例。gut-reference物种的maxGRs (IMG v4Ref)估计从基因组特征25和中值分配给属。
物种丰富度之间的相关性,微生物群增长潜力,和相对细菌类群丰富与BSS被斯皮尔曼等级次序相关的评估,作为实现r p值修正了多个测试Benjamini-Hochberg错误发现率修正(q值)。斯皮尔曼等级次序的相关性是用来检查的相关性菌群和渡越时间却能合成更多形成(BSS),基于每个菌群在每个BSS却能合成更多形成类别的百分比。微生物群的增长潜力,菌群之间的差异的重要性是通过魏克森讯号等级测试评估。
结果
健康的肠道微生物生态系统通常被认为是高细菌的特点,丰富性和多样性,认为反映了生态系统的稳定性和弹性。26,27粪便微生物分析揭示了一个看似一致的疾病之间的联系和观察到的或估计的物种数量的减少在一个示例,表明细菌丰富肠道健康的一个主要标志。26,27在这里,我们确定粪便一致性是粪便微生物丰富度密切相关。事实上,观察到的物种的丰富性大大下降与凳子坚定(斯皮尔曼的r =−0.45, p = 0.0007),达到其最小diarrhoea-afflicted个人(图1A)。总物种丰富度的估计(Chao1)证实了这种负相关(r =−0.41, p = 0.003,数据未显示)和信号仍然是重要的应用程序更严格的分类任务(参考OTU选择关闭,看到方法;趋势还证实了一个数据集除肠易激综合症的病人,在线补充图S7、和在数据组24人,在线补充图S8)。这些结果符合减少微生物丰富的轶事报导与渗透性腹泻。28
粪便一致性变异物种丰富度和人体菌群。相关性(A)观察到的物种丰富度和粪便一致性,由布里斯托尔凳子规模(BSS)(斯皮尔曼相关,r =−0.45, p = 0.0007)和(B)菌群分布和凳子却能合成更多形成一致性(BSS);蓝色:Ruminococcaceae -拟杆菌(RB)菌群(却能合成更多形成r =−0.88, p = 0.019),格林:p菌群(r = 0.88, p = 0.019)却能合成更多形成。
此前,粪便菌群基因组已经被证明分层进,23把人口大约三种可能的星座的肠道微生物群落结构。随着菌群也与丰富的梯度,8,9我们分析了菌群的分布在凳子上一致性的分数。应用多个聚类方法,我们发现我们当前数据集最优分割成两个不同的集群(见在线补充表S2)。主导的命名分类单元的参考出版物,23我们把集群Ruminococcaceae——观察拟杆菌(RB)和普氏菌(P)菌群(却能合成更多形成分别为77%和23%的总样本;分区在medoids (PAM)与Jensen-Shannon距离聚类)。BSS成绩欠佳的观察到明显是分布在:在P菌群更丰富的人却能合成更多形成松散的凳子(r: 0.88, P = 0.019), RB菌群完全主导却能合成更多形成坚实的样本(r:−0.88, P = 0.019;图1B;趋势还证实男性,在线补充图S8)。这些观察是由厚壁菌门的分析证实:拟杆菌门和Prevotellaceae:拟杆菌门丰富比率(提出enterotyping的替代品29日分别)在凳子上得分(r = 0.42, p = 0.001和r =−0.04, p = 0.77;参见图S1A在线补充,B)。值得注意的是,在RB菌群,却能合成更多形成Ruminococcaceae丰富积极与BSS分数(r =−0.37, p = 0.016),拟杆菌人口增加宽松的凳子(r = 0.43, p = 0.004)(见图S2在线补充)。因此,RB的增强的流行菌群的困难却能合成更多形成粪便Ruminococcaceae高的类别是由样品:拟杆菌比,这将把它们归入Ruminococcaceae菌群根据Arumugam术语最初建议却能合成更多形成等。23甚至在单一菌群低却能合成更多形成丰富的样本更丰富更宽松的凳子上(见图S3)在线补充,丰富信号就不是一个纯粹的菌群分布在一致性的分数却能合成更多形成的结果。虽然环境因素的识别塑造或导致菌群分层还在进行中,却能合成更多形成饮食一直强调的潜在的不同影响。5,30.更具体地说,P的发生菌群与农村,却能合成更多形成富含纤维的食物。5,31日non-fermentable纤维消费被认为增加粪便的含水量和可塑性,32这个观察符合P菌群中却能合成更多形成患病率的增加便溏类别。然而,质疑膳食纤维消费或在运输过程中产生的变化速率或水活动推动普氏菌水华,在目前仍不明了。
粪便一致性变异与变化粪便微生物群组成的群落结构和多样性,它与丰度梯度的个人属(见在线补充表S3)。RB中菌群,却能合成更多形成Methanobrevibacter和Akkermansia人口增加粪便坚定(并因此减缓交通个体更普遍)。可以为类似的观察Oxalobacter和Butyricimonas,而拟杆菌更丰富的稀便(见在线补充图S4)。这些关联在总的数据集(参见仍然显著表1和在线补充图S5)或者当应用更严格的分类任务(见在线补充表S4)。
增加丰富的产甲烷菌等Methanobrevibacter在努力提高甲烷产量的凳子证实了先前的报道在便秘的人。33有人建议,甲烷扮演着积极的角色在运输的延迟减慢肠道蠕动。34此外,除氢通过甲烷生产改变整个肠道发酵过程,这可能会影响结肠蠕动。33另外,增加丰富能反映健身课程属生长在条件的肠道转运。作为坚实的粪便一致性与生态系统水分活度降低,相关微生物丰度的波动也可能源于种特异的抗水压力。
人类结肠生态系统是一个开放、营养和连续流环境。为了避免冲刷,驻留细菌可以复制在一个足够高的增长率或附加或殖民宿主组织。35因此,运输时间可能作为选择性力量肠道细菌的增长。事实上,高营养的波动引起的可用性和微生物群人口规模减少结肠转运时间会快速成长的细菌的教科书式的选择压力,提前生长缓慢同行每当资源可用(r-selection)。36也增强了水的活动和相关的增加养分流动的稀便将有助于选择性力量由加速运输。迹象显示相关的细菌增长率和利率之间的通道来自体外处理连续流发酵37-39——稀释率确定的增长速度的细菌有教养,体内观察高等粪便细菌生物量与更短的运输时间。40,41评估这一假设,我们估计每个样本的平均maxGR微生物群的增长潜力25属(见方法),由丰富的样本加权(基于新创OTU以及关闭参考OTU作业;在线辅助表S5)。我们发现微生物群增长潜力确实与凳子得分呈正相关,因此结肠转运时间,RB中菌群(r = 0.34, p = 0028;却能合成更多形成图2)。然而,这种相关性在P菌群(却能合成更多形成缺席图2)。引人注目的是,P菌群样本却能合成更多形成的平均增长率低于RB样本之一(微生物群中位数增长潜力0.38 /小时和0.52 /小时,分别Wilcoxon P < 10−4;在线辅助图S6)。这主要是由于更高的相对丰度增长缓慢普氏菌在这些样本(平均相对丰富的spp普氏菌0.48671 vs 0.00026的P-enterotype RB-enterotype,分别)。一方面,缺乏相关性增长率和结肠转运时间P菌群可能表明物种却能合成更多形成菌群采取另一种策略来避免冲刷,却能合成更多形成即更高程度的坚持宿主组织。这一事实普氏菌确实是能够结合胶原蛋白和粘蛋白降解低聚糖支持这一假说。42,43此外,我们的结果可能表明粪便一致性,因此水活动普氏菌个人独立于加速运输,主要反映增加粪便水合能力,例如,与纤维消费。总的来说,粪便和图书馆稀释系列已被证明不影响成分读数16 s扩增子分析44——获得的结果并没有由于技术问题引起的变化在水中content-our结果提示运输时间微生物生活习性决定选择性力量之一。
微生物群的增长潜力与肠道运输Ruminococcaceae -快拟杆菌(RB)菌群。却能合成更多形成微生物群的增长潜力在凳子上的一致性(布里斯托尔凳子规模(BSS)),提出了渡越时间作为一个代理,在RB-enterotype (r = 0.34, p = 0.028)。
本研究的结果表明,物种丰富度的重大改变或社区组成部分可以反映粪便一致性的变化,阻碍了识别,影响的鲁棒性和再现性疾病的标记。便秘或腹泻时往往被视为dysbiotic结肠微生物群的指标可能导致疾病症状,发病或演变,粪便一致性或过境时间并不总是考虑混杂因素。我们使用Scheperjans最近的一项研究说明这个问题等45评价帕金森病的微生物群的作用。作者检测低丰度的Prevotellaceae结合Ruminococcaceae人口增加患者与健康对照组相比。然而,随着便秘被报道为帕金森病的早期症状46鉴于微生物之间的重叠信号观察和我们的发现BSS-associated微生物丰度的波动,可能存在的风险提出的微生物群签名只有粪便一致性健康和患病的个体之间的差异的结果。他们的信用,作者包括瓦克斯纳便秘分数在学习了这分数主要是集中在长期的评估严重便秘(即极端BSS 1)和BSS的病人不会弥补日常变化以及控制。47包含粪便一致性记录或结肠转运时间测量作为一个“相关的信号只允许更好的理清相关的疾病和那些粪便一致性。
结论
在一起,我们的结果表明之间深刻的联系粪便一致性和所有主要的读数的肠道微生物群组成。增加结肠转运时间与增强蛋白水解发酵48-50和相关生产潜在的有害的代谢产物,观察之间的负相关BSS-assessed通道速率和微生物丰富报道这里挑战当前主导的高丰富性被宿主的健康直接相关。此外,我们在这里确定肠道微生物组成与粪便一致性差异社区规模,属水平和评估提出生物机制的渡越时间可能会如何影响肠道微生物群通过选择性压力微生物生活习性。虽然纵向研究结合凳子得分记录,直接渡越时间的测量是必要的,巩固观察到的相关性,提出假说,BSS之间的关联的强度和物种丰富度,菌群和社区组成强调粪便一致性评估的重要性和分析“肠道微生物群的研究和临床研究。
确认
作者感谢两个匿名评论者的建设性的评论这样的一个早期版本的手稿以及Raes实验室成员活泼的讨论和反馈。
引用
补充材料
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补充数据
仅这个web文件已经由英国医学杂志出版集团从一个电子文件提供的作者(年代)和没有对内容进行编辑。
- 数据补充1——在线补充
脚注
DV和GF同样起到了推波助澜的作用。
推特跟玛丽Joossens在@JoossensM
贡献者DV参与收集数据,进行了分析和写论文。女朋友设计研究,收集数据,并参与了数据分析和论文的写作。sv参与数据分析和论文的写作。RT执行数据预处理。乔丹收集数据,参与研究设计和论文的写作。小参与研究设计和写作论文的协调,负责整体研究。
资金科研基金弗兰德斯(FWO), KU鲁汶,玛丽·居里行动(FP7人COFUND-Proposal 267139)之下,弗拉芒政府(IWT130359)、机构创新科技(IWT) Metacardis (FP7 Metacardis之下健康- f4 - 2012 - 305312),君子医学研究所。
相互竞争的利益没有宣布。
伦理批准sccp的研究伦理委员会布鲁塞尔(包143201215505)。
出处和同行评议不是委托;外部同行评议。