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背景和目的:发病机理的结肠微生物群落参与克罗恩病(CD),但只有不到30%的微生物群落可以培养。我们调查潜在的差异之间的粪便微生物区系结肠CD患者在缓解期(n = 9),活跃的患者结肠CD (n = 8),和健康的志愿者使用文化独立技术(n = 16)。
方法:定量点污点杂交有六个放射性标记16 s核糖体核糖核酸(rRNA)针对寡核苷酸探针用于测量核糖体rna的比例相应系统组。时间温度梯度凝胶电泳(TTGE) 16 s rDNA被用来评价占主导地位的物种多样性。
结果:肠道菌显著增加在活跃和静止的CD。探测器可加性显著低于患者(65(11)%,69(6)%在活跃的CD和静止CD)比健康对照组(99 (7)%)。TTGE概要文件之间明显不同的活跃和静止的CD,但在健康的条件下稳定。
结论:微生物群落的生物多样性仍然很高CD。肠杆菌的数量,观察患者比健康更经常在CD,和30%以上的占主导地位的植物还属于未定义的系统组。
- 粪便微生物区系
- 克罗恩氏病
- 时间温度梯度凝胶电泳
- CD,克罗恩病
- CDAI, CD活动指数
- 炎症性肠病、炎症性肠病
- 核糖体rna,核糖体核糖核酸
- TTGE、时间温度梯度凝胶电泳
- PCR,聚合酶链反应
来自Altmetric.com的统计
内源性粪便微生物区系的一些成员有一个清晰的有害作用在大多数结肠炎动物模型和肠炎。强烈怀疑也是这样在炎症性肠病(IBD)患者,尤其是克罗恩病(CD)。1,2特别是,转移回肠粪便流预防术后复发的CD。3同样,哈珀等报道,再引入小肠废水进入患者的结肠克罗恩氏结肠炎治疗分裂回肠造口术诱发炎症而重新小肠的无菌超滤液废水没有。4不是所有的细菌都有相同的促炎的属性,和一些甚至可能保护。5,6实际上,最近的几项研究表明,益生菌微生物如乳酸杆菌、双歧杆菌,和酿酒可能积极影响的CD。7 -9先前的研究结肠微生物区系的CD已经受到几个因素。都有使用细菌培养技术但不到总额的30%可以培养的微生物区系。10此外,因素可能影响微生物群落的组成,如疾病位置和活动,抗生素暴露,肠道清洁,和人工营养,尚未考虑。
细菌微生物群落的分子分析基于16 s核糖体核糖核酸(rRNA)基因可以不再需要文化和可以用来描述大约90%的占主导地位的粪便微生物群落在健康受试者。10 -14占主导地位的相对比例系统组的细菌存在于粪便样本可以被定量评估点污点分析和生物多样性可以使用时间估计温度梯度凝胶电泳(TTGE)。15日,16本研究的目的是探讨人口结构(也就是说,比例的主要系统组)患者结肠粪便微生物区系的CD与健康的志愿者相比,和比较生物多样性之间的粪便菌群CD患者缓解活动性疾病和疾病。
病人
17结肠或ileocolonic CD患者进行了研究。粪便样本收集来自13个病人缓解(CD活动指数(CDAI) < 150)17患者和8个活跃的CD (CDAI > 150,意思是260)。4名患者在缓解和活动性疾病提供粪便样本。没有病人了抗生素,sulphasalazine或经历了清肠至少4周。他们的特点是表1中给出。粪便样本也从16名健康志愿者(40岁(3)年;七位男性/ 9名女性)不采取抗生素至少4周。主导菌群的稳定性,如评估TTGE剖面,研究了在一个健康主题提供五粪便样品在两年期间。
方法
在一小时内发射的住院病人,粪便样本整除Starstedt 2.2毫升螺钉帽管和冻结在−80°C。他们储存在−80°C到分析。
点状杂交
凳子是由定量分析点状杂交和以前所描述的多尔和他的同事们。10总RNA提取从冷冻粪便材料和参考微生物菌株。RNA提取点缀在膜杂交16 s rRNA的面板有针对性的寡核苷酸探针来评估六个独立的细菌的系统发育团体代表大约90%的健康成人粪便细菌核糖体RNA(表2)。拟杆菌集团包括所有属的物种拟杆菌,普氏菌,Porphyromonas11;双歧杆菌属是整个属组成双歧杆菌属物种;乳酸菌包括所有种类的乳酸菌,肠球菌,链球菌,Lactococcus,片球菌属,明串珠菌属21;的leptum梭状芽胞杆菌和球菌样的梭状芽胞杆菌组都包括属的物种真细菌,瘤胃球菌属,梭状芽胞杆菌以及一些特定的物种等丁酸弧菌属fibrisolvens,Coprococcus eutactus,梭菌属prausnitzii19 -20.;最后,肠道菌群组成整个肠杆菌科的家庭。每组的丰度是表示为rRNA指数,是特定的16 s rRNA占总细菌的比例16 s rRNA(测量意味着(SEM)一式三份)。参考株作为标准来评估rRNA索引拟杆菌vulgatus写明ATCC 8482,双歧杆菌longum写明ATCC 15707,嗜酸乳杆菌写明ATCC 4356,真细菌siraeum写明ATCC 29066,瘤胃球菌属长生蜿写明ATCC 27340,大肠杆菌(rRNA标准;罗氏,Meylan法国)。
时间温度梯度凝胶电泳(TTGE)
DNA隔离和rDNA放大
总DNA提取如前所述16从0.2克粪便样本。核酸测定的浓度和完整视觉含有溴化乙锭在1%琼脂糖凝胶电泳。
引物GCclamp-U968 (5 ' GCclamp -棉酚公司治理文化棉酚棉酚有条件现金援助TAC)和L1401 (5 ' GCG TGT GTA CAA广汽CC)被用来放大V6细菌16 s rDNA V8地区。15聚合酶链反应(PCR)进行了使用热恒星Taq DNA聚合酶(试剂盒、Courtaboeuf、法国)。PCR混合(50μl)包含1×PCR缓冲,2.5毫米MgCl2200μM每个核苷酸,pmol底漆U968-GC和L1401 2.5 U热恒星的Taq,大约2 ng的DNA。样本放大PCT 100 thermocycler (MJ研究、公司、美国)使用以下项目:95°C的15分钟,30周期为一分钟97°C, 58°C一分钟,一分钟30秒72°C,最后72°C 15分钟。16PCR产品1%琼脂糖凝胶电泳,分析了含有溴化乙锭,检查他们的大小(500个基点),估计他们的浓度。
TTGE PCR扩增子的分析
我们使用了DCode普遍突变检测系统(Bio-Rad、巴黎、法国)特定PCR分离产品序列。通过1毫米厚,电泳进行16×16厘米聚丙烯酰胺凝胶(8% wt /丙烯酰胺/ Bis卷,7 M尿素,1.25×TAE,,分别μl 55和550μl tem和10%过硫酸铵)使用7升1.25×TAE电泳缓冲。电泳是运行在一个固定的电压64 V的16个小时66°C的初始温度和斜坡率为0.2°C / h。对于更高的分辨率,电压是固定在20 V 15分钟在电泳的开始。每一个满载着100 - 200 ng放大DNA +同等体积的2×凝胶装入染料(0.05%溴酚蓝,0.05%二甲苯苯胺,70%甘油)。标记通过M Sutren用于每个凝胶。它由一个PCR扩增克隆rDNA的混合C球菌样的(157号,93,40),C leptum(号365和296),拟杆菌(号303和73年)。23凝胶是由浸沾在黑暗中30分钟解决SYBR绿色我核酸凝胶染色(罗氏诊断,GmbH,曼海姆,德国)和阅读风暴系统(分子动力学)。
计算和统计分析
点状杂交实验做一式三份,结果表示为手段(SEM)的rRNA指数(细菌16 s rRNA)总额的百分比。添加的所有六个探针的探针代表添加的贡献占总细菌核糖体rna。TTGE概要分析了使用GelCompar软件(版本2.0应用数学、Kortrigk,比利时;执照AJC7-8JHL-AX57-ANEV-GFEJ-AV47)。分析包括计算乐队的数量对于每个模式,并使用皮尔逊系数计算模式之间的比较来衡量相似的程度。统计比较了组间的主题(健康受试者,CD患者在缓解期,和活跃的CD患者)。比较了使用学生的t测试变量的正态分布,否则使用Wilcoxon的测试。
结果
粪便微生物区系的组成评估点污点杂交
显著的杂交信号被检测到拟杆菌,双歧杆菌属,乳酸菌,C leptum,C球菌样的组,显示他们的存在在所有粪便样品的主要微生物区系分析。细菌种类的相对比例的三组受试者如图1所示。肠道菌的信号中检测出所有CD患者样本但在健康受试者的样本。Enterobacterial rrna相比没有显著不同的活动性疾病患者与缓解(p = 0.193)。这两个拟杆菌集团和双歧杆菌往往不代表在CD患者的细菌核糖体rna。与健康对照组相比,这些差异是重要的只有不活跃的疾病患者(p = 0.013拟杆菌组织和双歧杆菌p = 0.010)。探针的可加性显著降低样本CD患者(积极或不活跃的疾病)比健康者(p = 0.006,图1)表明平均30%的病人的主要菌群的细菌核糖体rna不占了六探针。
占主导地位的粪便菌群组成,与特定的评估点污点杂交探针在健康的志愿者,不活跃的克罗恩病的患者,患者和独立活动的克罗恩病。核糖体核糖核酸(rRNA)索引对应于特定的16 s rRNA占总细菌的比例16 s rRNA(测量意味着(SEM)一式三份)。比较与健康受试者:* p = 0.0001, * * p = 0.006, p = 0.010 * * *, * * * * p = 0.013, p = 0.034 * * * * *。
以下结果四个病人在活跃的和不活跃的疾病阶段研究(意味着(SEM) rRNA %,活跃的和不活跃的疾病,分别):拟杆菌7.2(2.7)和29.2 (10.3),双歧杆菌属spp 5.5(2.8)和5.0 (2.1),乳酸菌3.3(0.8)和2.5 (1.0),C leptum19.4(4.0)和26.4 (10.8),C球菌样的10.9(5.0)和21.7(6.3),和肠杆菌4.5(2.3)和3.7 (0.4)。
由TTGE粪便菌群的生物多样性评估
TTGE配置文件独立的患者在缓解期(n = 9)和那些活跃的CD (n = 8)图2所示。他们不同的主题之间,和带型在所有情况下都是复杂的。乐队的数量缓解期间是19.9(2.5)和16.5(4.9)在活动性疾病(p = 0.086)。
时间温度梯度凝胶电泳的16 s rDNA扩增子(获得使用V6-V8区域的基因引物)的样本来自独立在活跃的和不活跃的结肠克罗恩病的患者。M,标记,组成的聚合酶链反应扩增克隆rDNA的混合球菌样的梭状芽胞杆菌(157号,93,40),leptum梭状芽胞杆菌(号365和296),拟杆菌(303和73号)23。我,不活跃的疾病;一个活跃的疾病。
皮尔森系数对比条带模式获得的健康主题提供5个样品在两年内每天介于93%和98%之间的比较(4粪便样本收集超过80天)和93%以上的比较在两年内收集的样本中(图3)。
时间温度梯度凝胶电泳的16 s rDNA扩增子的主导菌群在一个健康的控制采样两年时间。S1, 1997年收集的样本;S2-S5、样品收集在1 1999天,23日,58岁和78年,分别。相似性的系统树图给出了统计最优表示时间温度梯度凝胶电泳概况的基础上,应用未加权的皮尔森相关系数矩阵和两组使用算术平均法(UPGMA)。
TTGE概要文件的四个病人,他们研究了在两个活跃的和不活跃的疾病阶段图4所示。每个病人的条带模式之间明显不同的两个阶段。皮尔森系数对比条带模式在缓解与活动性疾病50%以下一个病人,大约70%的人(图4)。有一个平均的1.7(2.7)乐队在活动性疾病(p = 0.29)。一些乐队观察只在活动性疾病但没有出现在所有的病人。两个乐队只观察到在所有四个病人缓解期间,如图4所示。
时间温度梯度凝胶电泳的16 s rDNA扩增子的配对四个病人粪便样本研究期间活跃的和不活跃的克罗恩病。获得的系统树图是显示在图3中。第九,样本病人X在不活跃的疾病;AX,样本在活动性疾病病人的X。
讨论
使用分子方法,我们观察到患者的粪便微生物群落动态和静态结肠CD不同于健康受试者的粪便微生物区系,包含更多肠道菌。此外,大约30%的占主导地位的细菌不属于常见的主导系统组。在活动性疾病,占主导地位的微生物区系平衡的干扰但物种多样性仍然很高。
几行证据指向一个角色内生微生物区系的CD。肠道病变的发病机制占主导地位在胃肠道的远端部分肠道微生物区系是最丰富的,和细菌存在于粪便流已报告负责肠道病变手术后的复发。3,4,24日,25不到30%的内生结肠细菌可以培养。10日,23现代分子技术基于核酸序列比较强大的工具为文化独立描述微生物组成的复杂的生态系统,26占主导地位的细菌种类的,给一个更好的表示。本研究中使用的方法允许的检测系统组(点状)或细菌物种(个人16 s rRNA TTGE序列)只有当它代表至少1%的总细菌的微生物区系27即,大约108细菌每克。这些方法不能检测低浓度的细菌,其中一些可能被培养技术。
检查的主要改变内生微生物群在缓解,我们选择CD结肠疾病患者没有接受抗生素,sulphasalazine或结肠清洗前至少4周分析。病人接受治疗所需的维护remission-that, mesalazine,糖皮质激素或免疫抑制。这种治疗方法的影响微生物群落的组成是未知的。我们决定不sulphasalazine患者研究,因为它可能会影响微生物群落,可能是因为磺胺的一部分。28
增加肠道菌在动态和静态CD已经建议在研究”为基础的企业文化。29日,30.大肠杆菌菌株都牵连到CD的发病机制,特别是一些菌株与特定附着力属性增加回肠病变的CD。31日然而,相比之下,大肠杆菌应变Nissle 1917可能有保护作用的口服药物时,所显示溃疡性结肠炎患者的临床试验32位34和CD。7
拟杆菌表现出促炎属性在几个IBD动物模型。35虽然一些文化的研究也指出可能增加粪便拟杆菌在CD,36岁,37我们观察到的相对比例下降拟杆菌系统组。该组织调查生存拟杆菌还有的成员Porphyromonas和普氏菌属,不能检测微妙的具体修改拟杆菌例如,在物种水平B vulgatus。37双歧杆菌和乳酸杆菌(或至少其中一些成员组)是被一些作者认为是潜在的预防炎症性肠病。5,38 -40这本质上是基于对益生菌菌株的研究似乎防止炎症在IBD动物模型5,38岁的39在最近的临床试验。9日,40岁,41此前的一项研究表明,在CD双歧杆菌数量减少,42我们注意到这样一个减少的趋势在我们的病人,只在不活跃的患者显著的减少疾病。双歧杆菌的公认的保护作用与CD还有待证实,但Campieri等报道,益生菌:# 3包含四株双歧杆菌减少术后复发的风险的CD。9有趣的是,我们发现一个高比例的内生微生物群(大约30%)患者CD不属于健康的主要微生物群控制。鉴定细菌种类或组的出现在这个“系统差距”可以CD的重要发病机制的理解。整个细菌群体的描述患者的CD, 16 s rDNA克隆和测序的基础上,23目前正在进行中。
TTGE概要的粪便微生物区系非常稳定健康条件下随着时间的推移,但不稳定的病人。我们观察到只有轻微下降,乐队的数量在疾病的活跃阶段,表明微生物群落在这两种情况下都保持高度的多样性。我们观察到没有特定的单一乐队指着细菌的存在可以专门参与疾病活动。
更好地了解微生物区系的变化应该帮助确定治疗目标抗生素、益生菌和益生元。我们的研究结果表明,抗生素针对肠道菌或细菌负责系统差距应该在CD患者进行研究。在益生菌,这些含有双歧杆菌应该得到特别关注结肠CD的试验,以防止复发。
确认
P Seksik收到Ferring-France奖学金授予执行这项工作。