条文本

原始研究
减肥手术后人类肠道菌群改变小鼠的肠道形态和葡萄糖吸收独立于肥胖
  1. 费尔南多·F暗褐1
  2. Soumaya Zlitni2
  3. 宋洋张3.
  4. 比阿特丽斯So-Yun崔4
  5. 卡桑德拉Y陈1
  6. 凯文·P·弗利1
  7. 妮可G Barra1
  8. 迈克尔·克瑟特5
  9. Laurent Biertho4
  10. 丹尼斯理查4
  11. 安德烈Tchernof46
  12. 林家棠3.
  13. 安德烈Marette4
  14. 乔纳森Schertzer1
  1. 1生物化学与生物医学科学系“,法恩科姆家庭消化健康研究所,麦克马斯特大学代谢、肥胖和糖尿病研究中心汉密尔顿安大略、加拿大
  2. 2遗传与医学系斯坦福大学斯坦福大学加州美国
  3. 3.多伦多总医院研究所大学健康网络多伦多安大略、加拿大
  4. 4魁北克心肺研究所研究中心,拉瓦尔大学魁北克魁北克、加拿大
  5. 5麦克马斯特大学法恩科姆家庭消化健康研究所医学系,代谢、肥胖和糖尿病研究中心汉密尔顿安大略、加拿大
  6. 6拉瓦尔大学营养学院魁北克魁北克、加拿大
  1. 对应到加拿大汉密尔顿市生物化学和生物医学科学系Jonathan Schertzer博士;schertze在{}mcmaster.ca

摘要

客观的减肥手术是改变肠道微生物组成的2型糖尿病(T2D)的有效治疗方法。我们确定了限制性或吸收不良减肥手术后人体肠道菌群是否足以降低血糖。

设计肥胖和T2D的女性行十二指肠切换(BPD-DS)或腹腔镜袖状胃切除术(LSG)的胆胰分流。每次手术前后来自同一患者的粪便样本被用于啮齿动物定植,并评估血糖控制的决定因素。

结果无菌小鼠在口服BPD-DS或LSG 7周后,葡萄糖耐量提高,而食物摄入、脂肪量、胰岛素抵抗、分泌和清除没有变化。bpd - ds后定植菌群的小鼠空肠远端绒毛高度/宽度和隐窝深度较低,肠道葡萄糖吸收较低。抑制钠-葡萄糖共转运体(Sglt)1可使小鼠血糖控制中的微生物传递改善失效。在特异性无病原体(SPF)大鼠中,bpd - ds后空肠内定植4周的微生物群足以改善血糖控制,但在空肠内抑制Sglt-1后,血糖控制被抑制。更高的Parabacteroides和更低的Blautia与bpd - ds和LSG后人类细菌定植后血糖控制的改善相一致。

结论限制性或吸收不良的减肥手术后,啮齿类动物暴露于人类肠道菌群改善血糖控制。减肥手术后的肠道菌群是改变上肠肠形态和降低sglt1介导的肠道葡萄糖吸收的独立因素,这与肥胖、胰岛素或胰岛素抵抗的变化无关,可改善血糖控制。

  • 葡萄糖代谢
  • 肥胖手术
  • 肠道微生物
  • 糖尿病
  • 肠道吸收

数据可用性声明

根据合理的要求提供数据。

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关于这个话题我们已经知道了什么?

  • 减肥手术是2型糖尿病(T2D)最有效的长期治疗方法。

  • 减肥手术在减肥前降低血糖。

  • 与限制性减肥手术相比,吸收不良后血糖降低更大。

  • 减肥手术改变了肠道菌群的组成。

  • 肠道菌群可以影响肥胖和血糖。

  • 目前尚不清楚人类减肥手术后改变的肠道菌群是否是降低血糖的独立因素。

这项研究补充了什么?

  • 吸收不良和限制性减肥手术后来自人类的微生物足以改善小鼠的血糖控制。

  • 微生物群介导的低血糖传递需要无菌小鼠通过口服灌胃长期(7周)定植,SPF大鼠(4周)通过腔内给药。

  • 微生物群介导的葡萄糖控制的改善不需要改变脂肪量、胰岛素抵抗、分泌或清除。

  • 微生物群降低血糖是由于低钠依赖的肠道葡萄糖吸收。

  • 减肥手术后的一个细菌亚群与小鼠肠道形态和下肠葡萄糖吸收的改变一致。

这项研究将如何影响研究、实践或政策?

  • 减肥手术后人体的微生物群足以降低肠道葡萄糖吸收和血糖。

  • 益生菌或后生物制剂的开发,模仿减肥手术的微生物效应和降低肠道葡萄糖吸收,可能促进T2D持久的血糖降低效益,而不存在减肥手术的缺点。

简介

肥胖预示着2型糖尿病(T2D)的发展,其特征是血糖升高、葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗。1 2减肥手术促进持久的体重减轻,在长期控制T2D方面比传统的医疗干预措施更有效。3.高血糖是全因死亡率的独立危险因素,而减肥手术可以增加肥胖个体的生存率。4个5在任何可测量的体重减轻之前,减肥手术会迅速降低血糖和胰岛素抵抗。6 7然而,目前尚不清楚减肥手术是如何促进快速和持久的血糖降低以促进T2D缓解的。

腹腔镜袖式胃切除术(LSG)和十二指肠开关胆胰分流(BPD-DS)跨越了减肥手术的范围。LSG是一种缩小胃的限制性手术。BPD-DS是一种吸收不良和限制性的手术,因为它会造成胃袋和小肠的长旁路。7与LSG相比,BPD-DS产生了更强劲和持续的血糖降低,包括更大的T2D缓解,这是以更频繁的副作用为代价的。7 8

减肥手术改变了肠道菌群的组成和功能。6 7人类胃旁路手术后肠道菌群的保守变化,在转移到无菌小鼠后,可促进体重减轻和脂肪减少。9在一些临床前模型中,有证据表明肠道微生物在减肥手术后降低脂肪量方面具有因果作用。9 - 11众所周知,肠道微生物会影响宿主代谢,并可能导致肥胖以外的代谢综合征的特征,包括胰岛素抵抗和血糖控制。12日13关于减肥手术后肠道微生物作为降低血糖的独立因素的因果作用,目前缺乏相关信息。6日14

在这里,我们将来自相同患者的粪便菌群与lgs或BPD-DS前后的小鼠和大鼠进行定殖,以测试肠道微生物与减肥手术降低血糖之间的因果关系,并确定肠道菌群降低血糖的机制。

材料和方法

动物

雌性C57BL6/N小鼠最初来自Taconic,在麦克马斯特大学中央动物设施(CAF),在特定的无病原体(SPF)或无菌(GF)条件下繁殖。小鼠接受饮食(Teklad全球18%蛋白质啮齿动物饮食,Envigo,猫# 2918)和自由饮水。10周龄的雌性Sprague-Dawley大鼠(Charles River实验室)被关在SPF室内的单独笼子中,在标准的12小时明暗周期下,自由获得饮用水和饲料(Teklad Diet 7012, Harlan实验室,Madison, Wisconsin, USA)。

减肥手术

根据机构批准的程序,患者在Québec心肺研究所的减肥手术护理中心登记。减肥外科手术的详细描述在在线补充材料

患者和公众的参与

许多参与者被邀请参加临床医生和研究人员在患者支持小组会议背景下举行的演示。两位参与者在视频中分享了他们的经验。

供体病人和粪便浆

我们选择3例术后12个月体重和血糖特征有典型变化的女性患者(表1).在BPD-DS或LSG之前和之后12个月收集同一患者的粪便样本,立即在- 20°C冷冻,随后在- 80°C保存。粪便随后在冰上解冻,在磷酸盐缓冲盐水(1:10 (w:v))中重新悬浮,在1.5 mL管中别名,并在- 80°C保存直到使用。这些患者在每次收集粪便前至少1个月没有服用抗生素。药物使用和热量摄入在在线补充表1和2

表1

供病人特点

Human-to-mouse粪便移植

GF小鼠被装在密闭无菌容器中从无菌设施出口到SPF室,无菌容器在消毒生物安全柜(BSC)下打开。将供体患者新鲜解冻粪浆灌胃给随机分配的SPF小鼠(200 μ L/小鼠/3次/周)和GF小鼠(200 μ L/小鼠/2次/周),共9周。来自一个供体病人的粪便浆液被用来在2到5只老鼠身上定植,并且在手术前后分别用不同的老鼠来测试来自同一病人的粪便。初步定植后,GF小鼠被转移(单室)到无菌笼中,并提供无菌水,每周更新一次。SPF小鼠每笼饲养4只,每笼饮水,每周更新笼子。处理定植的GF小鼠在平衡计分卡下进行。所有小鼠均置于正压通风笼中。

肠道葡萄糖的吸收

用来自BPD-DS患者的肠道菌群定殖的GF小鼠在禁食6小时后测量体内肠道葡萄糖吸收。非代谢葡萄糖类似物(3- o -甲基- d -吡喃葡萄糖(3-OMG), 4 mg/小鼠)和扑热氨基酚(1 mg/小鼠)灌胃给小鼠,并在循环中通过配备三重四极杆质谱计的高压液相色谱法定量(见在线补充材料为进一步的细节)。

肠血管外科

大鼠麻醉(氯胺酮,60 mg/kg;Xylazine, 8毫克/公斤)术前。在幽门括约肌远端6 cm和18-22 cm的腔室中放置肠道导管,因此分别位于小肠上段(USI)和空肠中部。或者,空肠中部导管被置于回肠中部的更远端的导管所取代在线补充方法详情)。血管手术时,将导管植入左颈动脉和右颈静脉进行采血。在实验开始前5天,每天监测患者的摄食量和体重。未达到usi /空肠和血管手术前体重85%的大鼠被排除。

人-大鼠粪便移植及上小肠葡萄糖耐量试验

来自BPD-DS供体患者的等量粪便样本在每个时间点(即术前和术后)汇集在一起。如供体患者和粪浆中所述,从手术前后的联合粪便中获得粪浆。空肠插管后1天,新鲜解冻的浆液直接注入空肠插管,靶向SPF大鼠远端空肠和回肠(1.5 mL/大鼠,3次/周,持续4周)。定植3周后,大鼠进行USI手术和血管插管。在恢复5天后(在此期间保持空肠插管定植),大鼠禁食一夜(16小时,从16:00到8:00),并通过空肠插管(瞄准空肠远端和回肠)注入一剂哌利津(P3449, Sigma-Aldrich, 0.04 g/kg)或对照剂(10%二甲基亚砜和10%乙醇,0.9%生理盐水),随后立即注射一剂葡萄糖(G8769, Sigma-Aldrich,4 g/kg)输注到USI插管(几乎瞄准整个小肠)。USI输注葡萄糖后0、5、10、20、30、40 min监测血糖。

看到在线补充方法有关代谢表型、细菌分析、组织学分析、信使RNA (mRNA)提取、RT-PCR分析、免疫印迹和短链脂肪酸测定的详细信息。

统计分析

微生物种群的分析以r为单位进行,对相对扩增子序列变异(ASV)丰度计算的Bray-Curtis差异进行排序多变量方差分析。Wilcoxon秩和检验用于两两比较。用Benjamini-Hochberg法计算错误发现率的调整。15用于数据分析和可视化的R包包括phyloseq,16素食主义者,17UpsetR,18ggplot2,19tidyr,20.dplyr,21ggtree22和corrplot。23显著性为p<0.05。使用GraphPad Prism V.9中未配对的双尾Student 's t检验对其他变量进行统计分析。

数据可用性:本研究生成的所有数据和R脚本均可在合理要求下使用。16S rRNA基因测序数据存入美国国立卫生研究院序列读取档案(临时ID 124400)。

结果

减肥手术后肠道菌群改善血糖控制

女性患者在LSG或BPD-DS术后12个月空腹血糖较低(图1一个表1).每一种减肥手术前(术前)或术后12个月(术后)来自一个供体患者的粪便浆液被用来定植2 - 5只小鼠,并使用单独的小鼠在手术前后测试来自同一患者的粪便(图1 b).在长期(7周)暴露于BPD-DS后患者粪便样本的葡萄糖耐量测试(GTT)中,GF小鼠(而不是SPF小鼠)的血糖和曲线下面积(AUC)较低,与暴露于BPD-DS前患者粪便浆相同时间的小鼠相比。图1 c, D).当LSG患者的粪便样本被用于小鼠定植7周时,我们观察到类似的结果,在GTT中观察到GF小鼠血糖耐量较低,AUC较低,但SPF小鼠没有,SPF小鼠在LSG后接受患者粪便,与LSG前接触患者粪便的小鼠相比(图1 e, F).在GF小鼠中,在BPD-DS和LSG后,使用粪便材料的葡萄糖耐量的微生物传播性改善与食物摄入或身体组成的变化无关(在线补充图1).我们发现,减肥手术后改善葡萄糖耐量的人-小鼠粪便菌群传播并不归因于特定的人类患者(图1 d, F-见图例顶部小鼠GTT中供体内AUC比较的p值)。这些数据表明,减肥手术引起的同一患者体内人类微生物群的变化,可以在不改变食物摄入或脂肪量的情况下,将改善的葡萄糖耐量传递给GF小鼠。

图1

在不同类型的减肥手术前后,用患者粪便菌群定殖小鼠的葡萄糖耐量。(A)女性供体患者在十二指肠开关生物胰分流(BPD-DS)或腹腔镜袖状胃切除术(LSG)后12个月的空腹血糖变化。(B)女性无菌(GF)和特异性病原体无(SPF)小鼠在不同类型的减肥手术前后用女性患者的粪便浆液定植的定植策略和时间线的身体特征评估和代谢谱分析。在(C, D) BPD-DS和(E, F) LSG前后用患者粪便菌群定植的SPF和GF小鼠进行口服葡萄糖耐量试验(GTT)的葡萄糖漂移曲线和曲线下面积(AUC)。数据以平均值±SEM表示。未配对学生t检验用于计算p值,当p<0.05时(用a *表示)被认为显著。每个正方形、三角形和圆形代表一个生物复制(n= 10-12)。在AUC图中,每一种符号颜色代表一个供体患者,在每个图例旁边的面板上描述了供体内供体小鼠术前与术后AUC比较的p值。

减肥手术后肠道菌群降低肠道葡萄糖吸收

为了深入了解改善血糖控制的肠道微生物群介导的人-小鼠间传递机制,我们首先评估了在BPD-DS前后粪便定殖的GF小鼠中葡萄糖刺激的胰岛素/c肽分泌(GSIS)和胰岛素敏感性(图2一个).在GSIS期间,bpd - ds前和bpd - ds后定殖小鼠的血浆胰岛素和c肽水平相似(图2中)和类似的胰岛素清除率,以胰岛素/c肽比率(图2 f, G).此外,bpd - ds前和bpd - ds后受体小鼠表现出相似的胰岛素抵抗指数,通过测量胰岛素抵抗指数(在GTT期间)和稳态模型评估估计的胰岛素抵抗(图2 h,我).同样地,在BPD-DS前后定植微生物群的GF小鼠在胰岛素耐量试验中血糖和葡萄糖消失率相当(图2 j, K).在接受bpd - ds前或bpd - ds后粪便菌群的SPF小鼠中未发现差异(在线补充图2).这些数据表明,BPD-DS后微生物定殖的GF中葡萄糖控制的改善与胰岛素分泌、清除或敏感性的改变无关。

图2

十二指肠开关生物胰分流术(BPD-DS)前后小鼠粪便菌群的葡萄糖刺激胰岛素和c肽水平及胰岛素敏感性。(A)雌性无菌(GF)小鼠在BPD-DS前后的代谢图谱。(B, C)定植小鼠血浆胰岛素、(D, E) C肽和(F, G)胰岛素/ C肽在葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)试验中的比值和曲线下面积(AUC)。(H)胰岛素抵抗指数,(I)稳态模型评估-估计胰岛素抵抗(HOMA-IR), (J)胰岛素耐量试验(ITT)期间葡萄糖漂移曲线,(K)定位点小鼠胰岛素耐量试验期间葡萄糖消失率。数据以平均值±SEM表示。采用无配对学生t检验计算p值,当p<0.05时,认为p值显著。每个正方形和三角形代表一个生物复制(B-H, n= 11-12;J, K, n = 16 - 17)。

先前的研究已经证实了Roux-en-Y胃旁路术(RYGB)和lgs中肠道葡萄糖吸收的变化与改善血糖稳态相关。- 28然而,尚不清楚减肥手术引起的葡萄糖吸收变化是否与肠道菌群的变化有关。我们假设,在BPD-DS患者的微生物群定殖的GF小鼠口服葡萄糖负荷期间,较低的血糖是由于较低的肠道葡萄糖吸收。我们在手术前后分别用非代谢葡萄糖类似物(3-OMG)灌胃另一组植有BPD-DS患者菌群的GF小鼠,以评估肠道葡萄糖吸收,并用扑热息痛评估胃排空(图3一).与较低的肠道葡萄糖吸收一致,与术前微生物定殖的小鼠相比,BPD-DS后微生物定殖的GF小鼠循环中3-OMG的出现率较低,3-OMG血清浓度峰值较低(图3 b, C).用术前或术后微生物定植的GF小鼠胃排空没有变化,其表现为相似的外观率和血清中扑热息痛的峰值水平(图3 d, E).

图3

采用十二指肠开关(BPD-DS)进行生物脂胰分流前后小鼠粪便菌群的肠道葡萄糖吸收。(A)在BPD-DS前后用女性患者粪便浆定殖的雌性无菌(GF)小鼠进行肠道葡萄糖吸收试验的时间线和研究设计。肠道葡萄糖吸收试验中(B, C) 3- o -甲基-D-吡喃葡萄糖(3-OMG)和(D, E)扑热息痛的循环出现率和血浆峰值浓度。数据以平均值±SEM表示。采用无配对学生t检验计算p值,当p<0.05时,认为p值显著。每个正方形和三角形代表一个生物复制(B-E n= 10-11)。

钠-葡萄糖共转运体(Sglt)1是从管腔到肠细胞的主要葡萄糖载体。接下来,我们在lsg前或lsg后肠道微生物定殖的小鼠中通过药物抑制Sglt1 (图4一).我们首先在naïve SPF小鼠中进行口服GTT,以确定减少(但不消除)肠道葡萄糖吸收(在线补充图3A-E).我们发现0.04 g间菌津/kg在口服葡萄糖负荷时显著降低葡萄糖通过肠道的入口,但不会清除血糖,因为载体处理和间菌津处理的小鼠在腹腔GTT中表现出相当的葡萄糖耐量(在线补充图3F, G).然后,我们在lsg前或lsg后用粪便浆液定殖另一组GF小鼠,并在给药1小时后进行口服GTT。我们证实,体重匹配的灌胃剂小鼠在灌胃后用粪便浆液定植的血糖低于灌胃前定植的小鼠(图4 b, C而且图1 f);然而,在抑制Sglt1时,这种差异被消除(图4 d, E).这些数据表明,sglt1介导的肠道葡萄糖吸收是lgs后肠道微生物降糖效果的决定因素。

图4

对钠-葡萄糖共转运体(Sglt)1的抑制否定了腹腔镜袖状胃切除术(lgs)后患者粪便菌群定植小鼠的葡萄糖耐量改善。(A)雌性无菌(GF)小鼠在LSG前后定植女性患者的粪便菌群,之后进行口服糖耐量试验(GTT),以检测phloridzin (0.04 g/kg)对Sglt1的抑制。口服GTT小鼠体重、葡萄糖漂移曲线和曲线下面积(AUC)分别为(B, C)对照剂和(D, E)间菌素。数据以平均值±SEM表示。采用无配对学生t检验计算p值,当p<0.05时,认为p值显著。每个圆代表一个生物复制(n=5)。

bpd - ds后受体小鼠肠道菌群改变肠道形态

我们发现……没有变化Slc5a1(Sglt1),无论是Slc2a1(Glut1)和Slc2a2(Glut2), bpd - ds前或bpd - ds后和LSG定殖的GF小鼠小肠近端和远端mRNA表达(在线补充图4).令人惊讶的是,形态学分析显示,经BPD-DS后定植的GF小鼠小肠远端绒毛高度、绒毛宽度和隐窝深度均较低(图5 a, B),但不是在小肠近端(在线补充图5),与定植bpd - ds前菌群的GF小鼠进行比较。

图5

采用十二指肠开关生物脂胰分流术(BPD-DS)治疗患者粪便菌群的小鼠远端小肠形态特征。(A)分离和获取小鼠不同肠段的方法示意图。(B)获得的雌性无菌(GF)小鼠在BPD-DS前后粪便菌群定植的远端小肠切片的代表性图像和形态计量学分析。每个点代表一个绒毛或隐窝(即技术复制,n= 115-324)。

bpd - ds后肠道菌群通过Wnt/β-catenin途径向宿主传递信号

接下来,我们试图确定在含有bpd - ds前或bpd - ds后肠道微生物的GF小鼠远端小肠中,介导下绒毛高度、绒毛宽度和隐窝深度的可能机制。短链脂肪酸(SCFAs)是参与宿主生理控制的关键细菌产物,包括肠细胞稳态。虽然BPD-DS供体术后粪丁酸水平较高,而LSG供体术后粪乙酸水平较低,但这些特征并没有在定植小鼠盲肠内容物中重现(在线补充图6),表明SCFA不是小鼠肠道结构、肠道吸收或血糖变化的主要参与者。

已知Wnt/β-catenin通路整合信号,通过激活β-catenin (在线补充图7A).bpd - ds后用浆液定殖的小鼠远端小肠中活性/非活性β-catenin水平较低,与bpd - ds前的GF小鼠远端小肠水平相当(在线补充图7B-E),但携带bpd - ds后微生物的小鼠比携带bpd - ds前微生物的小鼠显示出更高水平的失活β-连环蛋白(在线补充图7B).这些结果表明,BPD-DS后的肠道菌群可以向宿主传递信号,并改变β-连环蛋白的激活状态,这可能抑制细胞增殖,并可能有助于降低肥胖手术后暴露于菌群的肠道细胞的肠道吸收面。

将bpd - ds后患者的肠道菌群靶向定植远端小肠,以sglt1依赖的方式降低大鼠血糖

为了在另一种已经含有微生物群的模型中直接测试肠道微生物相关的变化,我们对雌性SPF大鼠进行定殖,方法是将BPD-DS前后女性患者的粪便浆直接注入大鼠的远端小肠,然后进行USI GTT (图6).体重匹配SPF大鼠(图6 b),与BPD-DS前接受粪便浆的大鼠相比,BPD-DS后患者的肠道菌群定植远端小肠足以降低USI-GTT的血糖AUCs (图6 c).实验前体重相当(图6 d),但空肠内给药间菌津(图6 e).为评估大鼠远端小肠葡萄糖吸收是否发生在回肠,我们将葡萄糖通过回肠插管注入大鼠回肠,而不是USI。我们发现回肠葡萄糖输注未能提高血糖(在线补充图8).这些数据表明,SPF大鼠BPD-DS后肠道微生物可以通过局部减少空肠远端葡萄糖吸收,而不是回肠,来改善宿主的葡萄糖耐量。

Targeted colonisation of the distal small intestine with gut microbes from patients after bioliopancreatic diversion with duodenal switch (BPD-DS) lowers blood glucose in rats in a sodium-glucose cotransporter (Sglt)1-dependent manner. (A) Gut catheters were placed into the luminal compartment of specific pathogen-free (SPF) female rats 6 cm and 18–22 cm distal to the pyloric sphincter and therefore positioned at the upper small intestine (USI) and middle jejunum, respectively. Next, 1 day after jejunal cannulation, equivalent amounts of faecal slurries from female patients before or after BPD-DS were pooled together and infused into the jejunal cannula 3 times a week for 4 weeks to target the distal jejunum and ileum of SPF rats. On 3 weeks (ie, 21 days) of colonisation, rats underwent surgery for USI and vascular cannulation. After 5 days of recovery, rats were fasted overnight, infused with vehicle or phloridzin via jejunal cannula (targeting the distal jejunum and ileum) and then immediately infused with glucose through the USI cannula (targeting almost the entire small intestine). Blood glucose was monitored at different time points (0, 5, 10, 20, 30, 40 min) after USI glucose infusion. Body weight, glucose excursion curves and area under the curves (AUC) of USI GTT in rats infused with (B, C) vehicle and (D, E) phloridzin. Data are presented as the mean±SEM. Unpaired Student’s t-test was used to calculate p values, which were considered significant at p<0.05. Each square or triangle represents a biological replicate (n=6–8).
" data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
图6

十二指肠开关生物胰分流(BPD-DS)后,患者的肠道微生物靶向定植远端小肠,以钠-葡萄糖共转运体(Sglt)1依赖的方式降低大鼠血糖。(A)在幽门括约肌远端6cm和18-22 cm的SPF雌性大鼠的腔室中放置肠道导管,因此分别位于小肠上部(USI)和空肠中部。接下来,空肠插管后1天,将女性患者BPD-DS前后等量的粪便浆液聚集在一起,以SPF大鼠的远端空肠和回肠为目标,每周3次,连续4周注入空肠插管。在定植3周(即21天)时,大鼠接受USI手术和血管插管。恢复5天后,大鼠禁食过夜,经空肠插管(以空肠远端和回肠为靶点)灌注vehicle或phloridzin,然后立即通过USI插管(以几乎整个小肠为靶点)灌注葡萄糖。在USI输注葡萄糖后不同时间点(0、5、10、20、30、40 min)监测血糖。(B, C)灌胃剂和(D, E)菌啉大鼠USI GTT的体重、葡萄糖漂移曲线和曲线下面积(AUC)。数据以平均值±SEM表示。采用无配对学生t检验计算p值,当p<0.05时,认为p值显著。每个正方形或三角形代表一个生物复制(n= 6-8)。

受体小鼠在bpd - ds后和lgs后的特定分类特征与血糖控制中微生物传播的改善有关

为了确定从肥胖手术患者传播给小鼠的细菌群落特征,我们应用16S rRNA基因为基础的测序分析了在LSG和BPD-DS前后定植微生物群的GF粪便样本。在我们的模型中,分别在接受BPD-DS和lgs的供体患者的粪便中鉴定出的asv中,7.3%和18.7%传播给了受体GF小鼠(在线补充图9).在BPD-DS和LSG受体小鼠中,传播类群分别占所有asv的13.1%和20% (在线补充图9).与以前的报告一致,29 30供体患者BPD-DS倾向于降低α-多样性(在线补充图10A),在lgs (在线补充图10B).我们发现在植有BPD-DS和LSG患者粪便的GF小鼠中α-多样性没有差异(在线补充图10C,D),表明粪便样本中的微生物α-多样性并不是人到小鼠微生物群介导的血糖变化传递的关键特征。这些发现与一些报道一致,即减肥手术后血糖控制的改善与较高的细菌多样性无关。30 31

用BPD-DS或LSG患者粪便定殖的小鼠粪便样本的分类组成的布雷-柯蒂斯差异主成分分析显示,BPD-DS前和BPD-DS后的微生物群落组成没有分离(图7).相反,粪便样品的微生物组成分离了lsg前和lsg后,样品之间的46.2%的变化可以用前两个轴解释(图7 b).我们进一步调查了术前和术后的类群丰度,发现lgs后受体粪便中有更高水平的Parabacteroides和梭状芽胞杆菌类的一些成员(如,CaproiciproducensRobinsoniella, GCA-900066575)比较pre-LSG受体(图7 c而且在线补充图11).Blautia是梭状芽胞杆菌类的另一成员,是一个例外,在接受lgs后的患者中显示出较低的丰度(图7 c而且在线补充图11).对于BPD-DS接受者,我们发现了梭状芽胞杆菌更微妙的扩展,其特征是三个类群的高度存在:RobinsoniellaGCA-900066575(在后lgs接受者中也更高)和Anaerostignum图7 c而且在线补充图11).与LSG后定植的GF小鼠相似,低Blautia和高水平的Parabacteroides在植有bpd - ds后菌群的GF小鼠中(图7 c而且在线补充图11).我们的发现强调了bpd - ds后和lgs后的分类学特征,与血糖控制中微生物传播的改善有关。

图7

采用十二指肠开关生物胰分流术(BPD-DS)或腹腔镜袖状胃切除术(LSG)前后定植患者粪便微生物群的小鼠粪便细菌组成。(A, B) brae - curtis不相似指数的主坐标分析(PCoA)比较雌性无菌(GF)小鼠在BPD-DS或LSG前后与患者粪便菌群定殖的粪便细菌组成。样本根据患者粪便菌群的供体进行分层。采用置换多变量方差分析对PCoA散点图中聚类(术前与术后)之间的距离进行统计学意义分析。(C)描述术前和术后组间类群重复平均数的热图(p<0.05, Wilcoxon秩和检验)。asv在99%相似度处聚类,并坍缩到属水平。分类单元的相对丰度用对数表示10在整个队列(两种手术合并)中位水平的倍数变化。所有相对丰度值为0的都被分配为1×10−6,比数据中可检测到的最低相对丰度低一个数量级,以便对倍数变化进行对数变换。每个正方形、三角形和圆形代表一个生物副本(n= 11-12)。

讨论

我们的数据显示,两种不同的减肥手术后患者肠道微生物的一个子集与更好的葡萄糖耐量独立于小鼠脂肪量的变化相关。我们发现人类限制性和吸收不良手术后的肠道菌群中含有可降低血糖的微生物(或微生物因子)。然而,我们发现减肥手术后的微生物群并没有改变胰岛素分泌、胰岛素清除或胰岛素抵抗。我们发现减肥手术后微生物群引起低血糖的机制是远端小肠对低肠葡萄糖的吸收。这一点很重要,因为病态肥胖患者的肠道葡萄糖吸收增加。32人们已经知道,减肥手术,如BPD-DS,促进葡萄糖排泄到肠腔28并增加肠细胞增生/肥厚和糖酵解,使肠道成为血糖处理的关键部位。25日- 27日33然而,虽然这些典型的吸收不良手术的适应性变化在LSG患者中不存在,但在限制性手术后仍可看到下肠葡萄糖吸收。26日27日在这里,我们表明,减肥手术后的细菌是一个独立的因素,可以降低宿主的肠道吸收表面,并降低餐后葡萄糖在肠道的吸收。肠道微生物和饮食调节肠道形态是有先例的。益生菌可以改变鱼的肠道形态,34高脂喂养的小鼠肠道吸收面较低。35人们很容易推测,在人体减肥手术后,某些肠道微生物可能会施加反调节压力,作为补偿吸收不良手术后肠细胞增生/肥大的一种手段。25根据我们的发现,它可能参与Wnt/β-catenin通路,将信号传递到宿主上肠。

减肥手术后,菌群组成迅速改变。6我们最初假设,微生物的变化会参与减肥手术后早期的血糖降低,例如显著体重减轻前几天。然而,我们的数据提出了一种有趣的可能性,即微生物的功能可能是改善长期血糖控制,而不是减肥手术的直接效果。在我们的研究中,我们使用无菌小鼠定植了至少7周,因为需要足够的暴露时间(即>45天)和多次灌胃微生物才能影响GF小鼠的血糖。36 37经RYGB大鼠粪便微生物移植入小鼠后,短时间内葡萄糖稳态有适度改善的报道。14虽然这可以部分解释为人类BPD-DS与大鼠RYGB的差异,8宿主暴露于某些微生物的时间似乎是改变血糖的一个关键因素。

在我们的研究中,通过在减肥手术前后灌胃具有肠道菌群的SPF小鼠定植,未能传递更好的糖耐量。然而,我们发现SPF大鼠长期(3次/周,持续4周)直接腔内微生物移植到远端小肠可以绕过这一限制,在减肥手术后利用粪便细菌传递更低的血糖。这些发现为改进能够改变宿主代谢的微生物移植方案奠定了基础。总的来说,我们的工作将微生物群诱导的肠道形态和葡萄糖吸收的变化定位为一个可能有助于持续降低血糖和长期T2D缓解的因素。

基于扩增子的方法,如本文所使用的方法,不能对定植效率进行深入的评价,也不能对微生物区系的定植进行菌株水平的解析。考虑到局限性,在我们的模型中,定植效率估计在7%到20%之间,这比之前报道的要低。12 37我们承认,在定植模型中,只有一小部分供体菌群有望在样本采集、制备/存储(例如,冻融循环、暴露于氧气)和交付中存活。但最重要的是,我们表明,在两种不同类型的减肥手术后,来自肠道菌群的相对较小的细菌子集足以降低不同啮齿类动物模型的血糖。重要的是要考虑到(i)手术前后的人体接种来自同一名患者,且处理相同,(ii)在多组GF小鼠和SPF大鼠中发现了微生物可传播的葡萄糖耐量改善,以及(iii)小鼠和大鼠研究是由不同的操作人员在不同的动物设施中进行的。虽然我们可以利用这种相对较小的定植效率来缩小可能与宿主中降低血糖有关的细菌,但重要的是要承认,我们的供体队列不够大,无法更精确地识别受体小鼠中的细菌特征。每只小鼠都用来自一个供体的粪便定殖,因此受体小鼠队列反映了典型的人类个体微生物群中个体间的高变异性。重要的是,我们发现通过菌群转移改善葡萄糖耐量的传递不是供体特异性的,这表明在不同类型的减肥手术后,人体内可能出现的多种微生物群落包含功能冗余,可以降低宿主体内的肠道葡萄糖吸收和血糖。

更高的Parabacteroides和更低的Blautia是限制性和吸收不良过程后共享的关键传输性分类特征,并与受体小鼠更好的葡萄糖控制相一致。我们之所以强调这些类群,是因为它们是受体小鼠粪便中含量最多的前20个类群之一,也因为之前的研究发现与之相关的数量增加了ParabacteroidesSPP改善肥胖期间的代谢功能。38我们的结果与Ridaura一致在该研究中,瘦人/血糖正常的人体内的微生物可以覆盖GF小鼠体内的肥胖表型,而GF小鼠的粪便来自不符合肥胖标准的双胞胎。特别是,拟杆菌spp和Parabacteroides瘦肉相关菌群中的SPP可以定植与肥胖相关菌群的小鼠。12使用双胞胎的另一种方法是使用肥胖手术前后的患者内比较,正如我们在这里所做的,观察到体重和血糖的显著降低(表1).我们的研究结果扩展了这一概念,并表明微生物群的可传性改变与宿主代谢有关ParabacteroidesSPP可以在不降低体重的情况下降低血糖。值得注意的是ParabacteroidesSPP和密切相关的属拟杆菌显示出能拮抗toll样受体4的脂多糖(LPS)39-41和具有耐药潜力的多糖A,39 41 42这可能有助于改善术后受体小鼠的葡萄糖耐量。我们的数据也表明Blautia作为改善减肥手术后血糖控制的常见菌群属。的确,Blautia在糖尿病患者的粪便中发现的含量更高吗43 44在减肥手术后降低。6 29总之,我们的研究结果强调,在两种类型的减肥手术后,小群细菌与改善血糖耐量的传播一致相关。由于后生物制剂可以改善宿主体内的葡萄糖稳态,45-48我们相信我们的工作为研究能够降低肠道葡萄糖吸收和血糖的后生物制剂提供了基础证据。从一个角度来看,在后续研究中探索黏膜血清素与减肥手术中微生物相关的降糖效果之间的联系是很有吸引力的。肠源性血清素分泌是一种受微生物群影响的性状49这已经被证明会影响血糖调节50和肠道形态。51此外,虽然我们发现来自女性的人类微生物群可以将雌性小鼠的血糖变化传递给雌性小鼠,但对于雄性小鼠的任何性别依赖效应尚不清楚。

我们得出的结论是,减肥手术后人类粪便中的微生物是降低sglt1介导的肠道葡萄糖吸收的独立因素,从而在转移到啮齿动物后改善血糖控制。这种微生物群驱动的效应与远端小肠绒毛的结构变化有关。我们提出了一个模型,其中微生物群的变化有助于减肥手术的长期降糖效果,独立于肥胖和胰岛素抵抗中的微生物群相关变化。可以降低葡萄糖吸收的微生物和/或它们的成分应该被挖掘为可以通过限制葡萄糖进入宿主而有助于持久降低血糖的因素。

数据可用性声明

根据合理的要求提供数据。

伦理语句

病人同意发表

伦理批准

本研究获得Québec心肺学会研究伦理委员会批准(方案编号2015-2466,21160和21181,MP-10-2015-2489)。所有动物程序均由麦克马斯特大学动物伦理审查委员会(AREB,参考# 200103)和大学卫生网机构动物护理和使用委员会(UHN,参考# 5884.16)根据加拿大动物护理委员会的指导方针批准。参与者在参与研究前给予知情同意。

致谢

我们感谢Mélissa Pelletier和Mélanie Nadeau在人体数据和样本方面的技术援助,感谢Nicola Henriquez在质谱分析方面的技术援助。

参考文献

补充材料

  • 补充数据

    这个网络仅文件已由BMJ出版集团从作者提供的电子文件生产(s),并没有编辑的内容。

脚注

  • 推特@ ferndo_anhe, @BeatriceSY_Choi, @TKTLam, @SchertzerLab

  • 贡献者FFA、JS、AM、TKTL和AT对假设进行了推导和数据研究。FFA进行了实验,分析了数据并撰写了手稿。SZ和S-YZ进行了实验并分析了数据。BS-YC和NGB进行了实验。CYC和KPF帮助进行实验。磅进行手术。JS, AM和TKTL编辑了手稿。所有作者都贡献了数据讨论,并在投稿前批准了稿件。JS是保证人。

  • 资金该研究得到了来自加拿大卫生研究院(CIHR)关于肥胖护理的团队资助(TB2-138776)、强生医药公司研究者发起的研究资助(grant th -14-610)和CIHR加拿大微生物组计划2 (CMI2)团队资助(MRT-168045)的支持。

  • 免责声明试验的资金来源在研究的设计、进行或管理、数据收集、分析或解释数据、或本手稿的编写和出版决定方面没有任何作用。

  • 相互竞争的利益FFA和S-YZ拥有加拿大卫生研究所博士后奖学金。AT和LB是强生医疗公司、Bodynov和Medtronic的研究经费支持的接受者,用于研究减肥手术,并担任IUCPQ和拉瓦尔大学的减肥和代谢外科研究主席。TKTL是加拿大糖尿病和肥胖研究主席和JK。McIvor是糖尿病研究的客座教授。JS是加拿大代谢性炎症研究主席。在胰岛素抵抗和心血管疾病的发病机制方面,AM得到了CIHR/Pfizer研究主席的支持。JS是本次研究的担保人,因此对本次研究的工作和开展承担全部责任。

  • 患者和公众的参与患者和/或公众参与了本研究的设计、实施、报告或传播计划。更多细节请参阅“方法”部分。

  • 来源和同行评审不是委托;外部同行评议。

  • 补充材料本内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查,也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅仅是那些作者(s)和不被BMJ认可。BMJ放弃从放在内容上的任何依赖产生的所有责任和责任。如果内容包含任何翻译材料,BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量),并且不对翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏负责。