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肠道微生物群
原始研究
减肥手术后人类肠道菌群独立于肥胖改变小鼠肠道形态和葡萄糖吸收
  1. 费尔南多·F Anhê1，
  2. Soumaya Zlitni2，
  3. 宋洋张3.，
  4. Béatrice崔素云4，
  5. Cassandra Y Chen1，
  6. 凯文·P·福利1，
  7. 妮可·G·芭拉1，
  8. 迈克尔·G·苏雷特5，
  9. Laurent Biertho4，
  10. 丹尼斯理查4，
  11. 安德烈Tchernof4，6，
  12. 林家棠3.，
  13. 安德烈Marette4，
  14. 乔纳森Schertzer1
  1. 1生物化学与生物医学学系“，，法恩库姆家族消化健康研究所和麦克马斯特大学代谢、肥胖和糖尿病研究中心，汉密尔顿，安大略、加拿大
  2. 2遗传与医学系“，，斯坦福大学，斯坦福大学，加州美国
  3. 3.多伦多总医院研究所，大学卫生网络，多伦多，安大略、加拿大
  4. 4魁北克心肺研究所研究中心，拉瓦尔大学，魁北克，魁北克、加拿大
  5. 5麦克马斯特大学法恩库姆家族消化健康研究所医学系、代谢、肥胖和糖尿病研究中心，汉密尔顿，安大略、加拿大
  6. 6拉瓦尔大学营养学院，魁北克，魁北克、加拿大
  1. 对应到加拿大汉密尔顿市生物化学和生物医学科学系Jonathan Schertzer博士;schertze在{}mcmaster.ca

摘要

客观的减肥手术是改变肠道微生物组成的2型糖尿病(T2D)的有效治疗方法。我们确定了限制性或吸收不良的减肥手术后人类肠道菌群是否足以降低血糖。

设计肥胖和T2D的女性采用十二指肠开关(BPD-DS)或腹腔镜袖状胃切除术(LSG)进行胆胰分流。同一患者在每次手术前后的粪便样本被用来定植啮齿动物，并评估血糖控制的决定因素。

结果在BPD-DS或LSG口服人类微生物群7周后，无菌小鼠的葡萄糖耐量得到改善，而食物摄入量、脂肪量、胰岛素抵抗、分泌和清除率没有变化。bpd - ds后被微生物定植的小鼠空肠远端绒毛高度/宽度和隐窝深度较低，肠道葡萄糖吸收较低。抑制钠-葡萄糖共转运体(Sglt)1取消了小鼠血糖控制中微生物传递性的改善。在无特异性病原体(SPF)大鼠中，bpd - ds后用微生物群在空肠内定植4周足以改善血糖控制，但在空肠内抑制Sglt-1后血糖控制无效。更高的Parabacteroides和更低的Blautia与bpd - ds和LSG后人类细菌定殖后血糖控制的改善相一致。

结论限制性或吸收不良的减肥手术后，啮齿类动物暴露于人类肠道微生物群可以改善血糖控制。减肥手术后的肠道菌群是一个独立的因素，可以改变上肠道的肠道形态，降低sglt1介导的肠道葡萄糖吸收，从而独立于肥胖、胰岛素或胰岛素抵抗的变化来改善血糖控制。

  • 葡萄糖代谢
  • 肥胖手术
  • 肠道微生物
  • 糖尿病
  • 肠道吸收

数据可用性声明

应合理要求提供数据。

http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名非商业(CC BY-NC 4.0)许可证发布，该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此基础上进行构建，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是正确引用原始作品，给予适当的荣誉，任何更改都已注明，并且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2022-328185

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    关于这个话题我们已经知道了什么?

    • 减肥手术是治疗2型糖尿病(T2D)最有效的长期治疗方法。

    • 减肥手术在减肥前降低血糖。

    • 与限制性减肥手术相比，吸收不良术后血糖降低更大。

    • 减肥手术改变了肠道菌群的组成。

    • 肠道菌群可以影响肥胖和血糖。

    • 目前尚不清楚人类减肥手术后肠道菌群的改变是否是降低血糖的独立因素。

    这项研究补充了什么?

    • 人体吸收不良和限制性减肥手术后的微生物足以改善小鼠的血糖控制。

    • 微生物群介导的低血糖传输需要无菌小鼠长期(7周)灌胃定植，SPF大鼠(4周)腔内给药。

    • 微生物群介导的改善血糖控制的传递不需要改变脂肪量、胰岛素抵抗、分泌或清除。

    • 微生物群降低血糖是由于降低钠依赖性肠道葡萄糖吸收。

    • 在小鼠中，减肥手术后的细菌亚群与肠道形态改变和肠道葡萄糖吸收降低相吻合。

    这项研究如何影响研究、实践或政策?

    • 减重手术后人体的微生物群足以降低肠道葡萄糖吸收和血糖。

    • 开发益生菌或后生物制剂，模拟减肥手术的微生物效应和降低肠道葡萄糖吸收，可能会促进T2D患者持久的降血糖益处，而不会出现减肥手术的缺点。

    简介

    肥胖预示着2型糖尿病(T2D)的发展，其特征是血糖升高、葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗。1 2减肥手术促进持久的体重减轻，在长期控制T2D方面比传统的医疗干预更有效。3.高血糖是全因死亡的独立危险因素，减肥手术可以增加肥胖患者的生存率。4个5在任何可测量的体重减轻之前，减肥手术可以迅速降低血糖和胰岛素抵抗。６ ７然而，目前尚不清楚减肥手术如何促进快速和持久的血糖降低，从而促进T2D缓解。

    腹腔镜袖状胃切除术(LSG)和十二指肠开关胆胰分流(BPD-DS)跨越了减肥手术的范围。LSG是一种限制性手术，可以缩小胃的大小。BPD-DS是一种吸收不良和限制性手术，因为它除了长时间的小肠旁路外，还会产生胃袋。7与LSG相比，BPD-DS产生更强劲和持续的血糖降低，包括更大的T2D缓解，这是以更频繁的副作用为代价的。7 8

    减肥手术会改变肠道菌群的组成和功能。６ ７人类胃旁路手术后肠道微生物群的保守变化可以促进无菌小鼠的体重减轻和脂肪减少。9在一些临床前模型中，有证据表明肠道微生物在减肥手术后降低脂肪量方面具有因果作用。9 - 11众所周知，肠道微生物会影响宿主代谢，并可能导致代谢综合征的特征，包括胰岛素抵抗和血糖控制。12日13目前缺乏关于减肥手术后肠道微生物作为降低血糖的独立因素的因果作用的信息。6日14

    在本研究中，我们将同一患者在LSG或BPD-DS前后的粪便微生物群定植在小鼠和大鼠体内，以测试肠道微生物与减肥手术降低血糖之间的因果关系，并确定肠道微生物群降低血糖的机制。

    材料与方法

    动物

    16 ~ 24周的雌性C57BL6/N小鼠最初来自Taconic，在麦克马斯特大学的中央动物设施(CAF)中，在特定的无病原体(SPF)或无菌(GF)条件下繁殖。小鼠接受饮食(Teklad全球18%蛋白质啮齿动物饮食，Envigo，猫# 2918)和自由饮水。10周龄的雌性Sprague-Dawley大鼠(查尔斯河实验室)被关在SPF级房间的单独笼子里，在标准的12小时明暗循环下，自由获取饮用水和食物(Teklad Diet 7012，哈伦实验室，麦迪逊，威斯康辛州)。

    减肥手术

    患者根据机构批准的程序在Québec心肺研究所的减肥手术护理中心登记。关于减肥手术的详细描述见在线补充资料．

    患者和公众参与

    许多参与者被邀请参加临床医生和研究人员在患者支持小组会议的背景下举行的演讲。两名参与者在视频中分享了他们的经历。

    供体病人和粪便

    我们选择3例术后12个月体重和血糖特征有典型变化的女性患者(表1)．在BPD-DS或LSG之前和之后12个月收集同一患者的粪便样本，在−20°C下立即冷冻，随后在−80°C下保存。随后将粪便在冰上解冻，在磷酸盐缓冲生理盐水(1:10 (w:v))中重新悬浮，在1.5 mL管中倒入液体，并在−80°C保存直到使用。这些患者在每次收集粪便前至少1个月没有服用抗生素。药物使用和热量摄入显示在在线补充表1和2．

    查看该表:
    表1

    供体患者特征

    人鼠粪便移植

    GF小鼠从无菌设施用密闭无菌容器出口到SPF室，无菌容器在消毒生物安全柜(BSC)下打开。将供体患者新鲜解冻的粪便灌给随机分配的SPF小鼠(200 μ L/小鼠/每周3次)和GF小鼠(200 μ L/小鼠/每周2次)，共9周。一名供体患者的粪便浆被用来在2到5只小鼠身上定植，并且在手术前后用不同的小鼠测试同一患者的粪便。在初始定殖后，GF小鼠被转移(单笼)到无菌笼中，可获得无菌水，每周更新一次。SPF级小鼠每个笼子里养4只，每周更新笼子。在BSC下处理定植的GF小鼠。所有小鼠都被关在通风的笼子里，保持正压模式。

    肠道葡萄糖吸收

    在被BPD-DS患者肠道菌群定植7周的GF小鼠禁食6小时后，测量体内肠道葡萄糖吸收。将非代谢葡萄糖类似物(3- o -甲基- d -吡喃葡萄糖(3-OMG)， 4毫克/只小鼠)和扑热aminol(1毫克/只小鼠)灌给小鼠，并在循环中通过配备三重四极杆质谱仪的高压液相色谱进行定量(见在线补充资料有关详情)。

    肠道血管外科

    麻醉大鼠(氯胺酮，60 mg/kg;手术前服用Xylazine, 8 mg/kg。肠管分别放置在幽门括约肌远端6厘米和18-22厘米的管腔室，因此分别位于小肠上部(USI)和空肠中部。或者，中间空肠导管被放置在回肠中部的远端导管所取代(见在线补充方法详情)。在血管手术中，将导管植入左颈动脉和右颈静脉进行采血。在实验前5天每天监测术后食物摄入量和体重。未达到usi /空肠和血管手术前体重至少85%的大鼠被排除在外。

    人-大鼠粪便移植及上小肠葡萄糖耐量试验

    在每个时间点(即术前和术后)，来自BPD-DS供体患者的等量粪便样本汇集在一起。如供体患者所述，在手术前后从合并的粪便中获得粪浆。空肠插管后1天，新鲜解冻的浆液直接注入空肠插管，以SPF大鼠远端空肠和回肠为目标(1.5 mL/只，3次/周，连续4周)。定植3周后，大鼠接受USI和血管插管手术。恢复5天后(在此期间维持空肠插管定植)，大鼠禁食过夜(16小时，从16:00到8:00)，并通过空肠插管输注一剂间氯津(P3449, Sigma-Aldrich, 0.04 g/kg)或对照物(10%二甲基亚砜和10%乙醇，0.9%生理盐水)(瞄准空肠远端和回肠)，随后立即输注一剂葡萄糖(G8769, Sigma-Aldrich, 0.04 g/kg)。4 g/kg)输注至USI套管(瞄准几乎整个小肠)。在USI输注葡萄糖后0、5、10、20、30、40 min监测血糖。

    看到在线补充方法详细了解代谢表型、细菌分析、组织学分析、信使RNA (mRNA)提取、RT-PCR分析、免疫印迹和短链脂肪酸测定。

    统计分析

    微生物种群的分析是在r中进行的，微生物群方差的划分是通过相对扩增子序列变异(ASV)丰度计算的Bray-Curtis差异的置换多元方差分析完成的。采用Wilcoxon秩和检验进行两两比较。采用Benjamini-Hochberg方法计算假发现率的调整。15用于数据分析和可视化的R包包括phyloseq，16素食主义者,17UpsetR,18ggplot2,19tidyr,20.dplyr,21ggtree22和corrplot。23p<0.05时接受显著性。在GraphPad Prism V.9中使用未配对双尾Student 's t检验对其他变量进行统计分析。

    数据可用性:本研究中生成的所有数据和R脚本均可在合理要求下使用。16S rRNA基因测序数据存入美国国立卫生研究院序列读取档案(临时ID 124400)。

    结果

    减肥手术后肠道菌群改善血糖控制

    女性患者在LSG或BPD-DS后12个月空腹血糖降低(图1一个，表1)．在每种类型的减肥手术前(术前)或术后12个月，用一个供体患者的粪便浆来定植2到5只小鼠，并使用单独的小鼠来测试同一患者手术前后的粪便(图1 b)．在长期(7周)暴露于BPD-DS后患者粪便样本的葡萄糖耐量试验(GTT)中，与暴露于BPD-DS前患者粪便泥浆相同时间的小鼠相比，GF小鼠(而不是SPF小鼠)的血糖和曲线下面积(AUC)更低(图1 c, D)．当我们将来自LSG患者的粪便样本用于小鼠定植7周时，我们观察到类似的结果，在GTT期间，GF小鼠的血糖耐量和AUC较低，但SPF小鼠没有，SPF小鼠在LSG后接受患者的粪便，与在LSG前接触患者粪便的小鼠相比(图1 e, F)．使用BPD-DS和LSG后粪便材料的葡萄糖耐量的微生物群可传递性改善与GF小鼠的食物摄入量或身体成分的变化无关(在线补充图1)．我们发现，减肥手术后改善糖耐量的人-小鼠粪便微生物群传播并不归因于特定的人类患者(图1 d, F-参见顶部图例中小鼠GTT中供体内AUC比较的p值)。这些数据表明，减肥手术引起的同一患者体内人类微生物群的变化可以在不改变食物摄入量或脂肪量的情况下将改善的葡萄糖耐量传递给GF小鼠。

    Glucose tolerance in mice colonised with the faecal microbiota of patients before and after different types of bariatric surgery. (A) Change in fasting blood glucose 12 months after bioliopancreatic diversion with duodenal switch (BPD-DS) or laparoscopic sleeve gastrectomy (LSG) in female donor patients. (B) Colonisation strategy and timeline of body feature assessment and metabolic profiling in female germ-free (GF) and specific pathogen-free (SPF) mice colonised with faecal slurries from female patients before and after different types of bariatric surgery. Glucose excursion curves and area under the curves (AUC) of oral glucose tolerance tests (GTT) performed in SPF and GF mice colonised with the faecal microbiota of patients before and after (C, D) BPD-DS and (E, F) LSG. Data are presented as the mean±SEM. Unpaired Student’s t-test was used to calculate p values, which were considered significant at p<0.05 denoted by a *. Each square, triangle and circle represents a biological replicate (n=10–12). In AUC plots, each symbol colour represents a donor patient, and p values for within-donor comparisons of AUC in recipient mice presurgery versus postsurgery are described on the top of each panel next to the legend.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    在不同类型的减肥手术前后，葡萄糖耐量小鼠与患者粪便微生物群定植。(A)女性供体患者十二指肠开关生物胰分流术(BPD-DS)或腹腔镜袖状胃切除术(LSG)后12个月的空腹血糖变化。(B)女性无菌小鼠(GF)和特定无病原体小鼠(SPF)在不同类型的减肥手术前后用女性患者的粪便浆定植的身体特征评估和代谢谱的定植策略和时间线。在(C, D) BPD-DS和(E, F) LSG前后，用患者粪便菌群定植的SPF和GF小鼠进行口服糖耐量试验(GTT)的葡萄糖漂移曲线和曲线下面积(AUC)。数据以均数±标准差表示。采用Unpaired Student 's t检验计算p值，以a *表示p<0.05为显著性。每个正方形、三角形和圆形代表一个生物副本(n= 10-12)。在AUC图中，每一种符号颜色代表一名供体患者，并且在图中图例旁边的每一幅图的上方描述了接受小鼠手术前后供体内AUC比较的p值。

    减肥手术后肠道菌群降低肠道葡萄糖吸收

    为了深入了解改善葡萄糖控制的肠道微生物介导的人-小鼠传递机制，我们首先评估了在BPD-DS前后用粪便定植的GF小鼠的葡萄糖刺激胰岛素/c肽分泌(GSIS)和胰岛素敏感性(图2一个)．在GSIS期间，bpd - ds前和bpd - ds后定殖小鼠的血浆胰岛素和c肽水平相似(图2中)和类似的胰岛素清除率(以胰岛素/c肽比值(图2 f, G)．此外，接受bpd - ds前和bpd - ds后的小鼠表现出相似的胰岛素抵抗指数，通过胰岛素抵抗指数(在GTT期间)和稳态模型评估-估计胰岛素抵抗指数(图2 h,我)．同样，在BPD-DS之前或之后被微生物群定植的GF小鼠在胰岛素耐量试验中显示出类似的血糖和葡萄糖消失率(图2 j, K)．在接受bpd - ds前或bpd - ds后粪便菌群的SPF小鼠中没有发现差异(在线补充图2)．这些数据表明，BPD-DS后微生物定植的GF血糖控制的改善与胰岛素分泌、清除率或敏感性的变化无关。

    Glucose-stimulated insulin and c-peptide levels and insulin sensitivity in mice colonised with the faecal microbiota of patients before and after bioliopancreatic diversion with duodenal switch (BPD-DS). (A) Timeline of metabolic profiling in female germ-free (GF) mice colonised with faecal slurries from female patients before and after BPD-DS. (B, C) Plasma insulin, (D, E) c-peptide and (F, G) insulin/c-peptide ratio during glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) tests and area under the curves (AUC) in colonised mice. (H) Insulin resistance index, (I) homeostasis model assessment-estimated insulin resistance (HOMA-IR), (J) glucose excursion curves during insulin tolerance tests (ITT) and (K) glucose disappearance rate during ITT in colonised mice. Data are presented as the mean±SEM. Unpaired Student’s t-test was used to calculate p values, which were considered significant at p<0.05. Each square and triangle represents a biological replicate (B–H, n=11–12; J, K, n=16–17).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    在十二指肠开关生物脂胰分流(BPD-DS)前后，患者粪便微生物群定植小鼠的葡萄糖刺激胰岛素和c肽水平和胰岛素敏感性。(A) BPD-DS前后女性患者粪浆定植的雌性无菌(GF)小鼠的代谢谱时间表。(B, C)葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)试验时血浆胰岛素、(D, E) C肽和(F, G)胰岛素/ C肽比值以及定殖小鼠曲线下面积(AUC)。(H)胰岛素抵抗指数，(I)稳态模型评估-估计胰岛素抵抗(HOMA-IR)， (J)胰岛素耐量试验(ITT)期间葡萄糖漂移曲线和(K)定植小鼠ITT期间葡萄糖消失率。数据以均数±标准差表示。采用非配对学生t检验计算p值，p<0.05为显著性。每个正方形和三角形代表一个生物副本(B-H, n= 11-12;J, K, n= 16-17)。

    先前的研究记录了Roux-en-Y胃旁路术(RYGB)和LSG中肠道葡萄糖吸收的变化与血糖稳态的改善有关。- 28然而，目前尚不清楚减肥手术诱导的葡萄糖吸收变化是否与肠道菌群的变化有关。我们假设，在BPD-DS患者的微生物群定植的GF小鼠口服葡萄糖负荷期间的低血糖是由于肠道葡萄糖吸收降低所致。我们在BPD-DS患者术前和术后分别给另一组用非代谢性葡萄糖类似物(3-OMG)定植的GF小鼠灌胃，以评估肠道葡萄糖吸收，并对乙酰氨基酚评估胃排空(图3一)．与较低的肠道葡萄糖吸收一致，BPD-DS后定植菌群的GF小鼠与术前定植菌群的小鼠相比，循环中3-OMG的出现率较低，3-OMG血清浓度峰值较低(图3 b, C)．术前或术后微生物定植的GF小鼠胃排空没有变化，其表现为相似的外观率和血清中扑热息痛的峰值水平(图3 d, E)．

    Intestinal glucose absorption in mice colonised with the faecal microbiota of patients before and after bioliopancreatic diversion with duodenal switch (BPD-DS). (A) Timeline and study design of intestinal glucose absorption tests performed in female germ-free (GF) mice colonised with faecal slurries from female patients before and after BPD-DS. Rate of appearance in circulation and plasma peak concentration of (B, C) 3-O-methyl-D-glucopyranose (3-OMG) and (D, E) paracetamol during intestinal glucose absorption tests. Data are presented as the mean±SEM. Unpaired Student’s t-test was used to calculate p values, which were considered significant at p<0.05. Each square and triangle represents a biological replicate (B–E n=10–11).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    十二指肠开关生物脂胰分流(BPD-DS)前后小鼠肠道葡萄糖吸收与患者粪便微生物群定植。(A)在BPD-DS前后，在女性患者粪浆定植的雌性无菌(GF)小鼠中进行肠道葡萄糖吸收试验的时间轴和研究设计。肠道葡萄糖吸收试验时(B, C) 3- o -甲基-D-吡喃葡萄糖(3-OMG)和(D, E)扑热息痛在循环中出现率和血浆峰值浓度。数据以均数±标准差表示。采用非配对学生t检验计算p值，p<0.05为显著性。每个正方形和三角形代表一个生物复制(B-E n= 10-11)。

    钠-葡萄糖共转运体(Sglt)1是葡萄糖从腔到肠细胞的主要载体。接下来，我们在lsg前或lsg后肠道微生物定植的小鼠中通过药物抑制Sglt1 (图4一)．我们首先在naïve SPF级小鼠中进行口服GTT，以确定减弱(但未消除)肠道葡萄糖吸收的支氯津剂量(在线补充图3A-E)．我们发现0.04 g间氯津/kg在口服葡萄糖负荷期间显著降低了葡萄糖通过肠道的进入，但没有降低血糖清除率，因为载药处理和间氯津处理的小鼠在腹腔GTT中表现出相当的糖耐量(在线补充图3F, G)．然后，我们在lsg前或lsg后用粪便浆定植另一组GF小鼠，并在给药后1小时口服GTT。我们证实，在lsg后用粪便浆定植的体重匹配的载体处理的小鼠比lsg前定植的小鼠血糖更低(图4 b, C而且图1 f）;然而，在Sglt1抑制上，这种差异被消除了(图4 d, E)．这些数据表明，sglt1介导的肠道葡萄糖吸收是lsg后肠道微生物降糖作用的决定因素。

    Inhibition of sodium-glucose cotransporter (Sglt)1 negates improved glucose tolerance in mice colonised with the faecal microbiota of patients after laparoscopic sleeve gastrectomy (LSG). (A) Female germ-free (GF) mice were colonised with the faecal microbiota of female patients before or after LSG and thereafter subjected to oral glucose tolerance tests (GTT) on inhibition of Sglt1 with phloridzin (0.04 g/kg). Body weight, glucose excursion curves and area under the curves (AUC) of oral GTT in mice injected with (B, C) vehicle and (D, E) phloridzin. Data are presented as the mean±SEM. Unpaired Student’s t-test was used to calculate p values, which were considered significant at p<0.05. Each circle represents a biological replicate (n=5).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    抑制钠-葡萄糖共转运蛋白(Sglt)1，在腹腔镜袖状胃切除术(LSG)后，在患者粪便微生物群定植的小鼠中，葡萄糖耐量的改善被否定。(A)在LSG前后将雌性无菌(GF)小鼠定植在女性患者的粪便微生物群中，之后对其进行口服糖耐量试验(GTT)，以检测根霉素(0.04 g/kg)对Sglt1的抑制作用。(B, C)载液和(D, E)间氯津注射小鼠口服GTT的体重、葡萄糖漂移曲线和曲线下面积(AUC)。数据以均数±标准差表示。采用非配对学生t检验计算p值，p<0.05为显著性。每个圆圈代表一个生物复制(n=5)。

    bpd - ds后的肠道菌群改变受体小鼠的肠道形态

    我们发现没有变化Slc5a1(Sglt1)， neither inSlc2a1(Glut1)和Slc2a2(Glut2)， bpd - ds前或bpd - ds后和LSG定殖的GF小鼠近端和远端小肠中mRNA的表达(在线补充图4)．令人惊讶的是，形态学分析显示，在BPD-DS后定植菌群的GF小鼠远端小肠的绒毛高度、绒毛宽度和隐窝深度均较低(图5 a, B)，但不是在小肠近端(在线补充图5)，与用pre-BPD-DS菌群定殖的GF小鼠相比。

    Morphological characteristics in the distal small intestine of mice colonised with the faecal microbiota of patients before and after bioliopancreatic diversion with duodenal switch (BPD-DS). (A) Schematic representation of method used to separate and harvest different intestinal sections from mice. (B) Representative images and morphometric analysis of H&E-stained distal small intestine sections harvested from female germ-free (GF) mice colonised with the faecal microbiota of female patients before and after BPD-DS. Each dot represents a villus or crypt (ie, technical replicates, n=115–324).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    十二指肠开关生物脂胰分流术(BPD-DS)前后患者粪便菌群定植小鼠远端小肠形态特征(A)用于分离和获取小鼠不同肠段的方法示意图。(B) BPD-DS前后女性患者粪便菌群定植的雌性无菌(GF)小鼠远端小肠切片h&e染色的代表性图像和形态计量学分析。每个点代表一个绒毛或隐窝(即技术复制，n= 115-324)。

    bpd - ds后肠道菌群通过Wnt/β-catenin途径向宿主传递信号

    接下来，我们试图确定在bpd - ds前或bpd - ds后携带肠道微生物的GF小鼠远端小肠中观察到的较低绒毛高度、绒毛宽度和隐窝深度的可能机制。短链脂肪酸(SCFAs)是参与宿主生理控制的关键细菌产物，包括肠细胞稳态。虽然BPD-DS供体术后粪便丁酸水平较高，而LSG供体术后粪便乙酸水平较低，但这些特征并未在定植小鼠盲肠内容物中重现(在线补充图6)，表明SCFA并不是小鼠肠道结构、肠道吸收或血糖变化的主要因素。

    已知Wnt/β-catenin通路通过激活β-catenin整合信号控制肠细胞增殖(在线补充图7A)．bpd - ds后灌胃的小鼠远端小肠中活性/非活性β-catenin水平较低，而bpd - ds前灌胃的GF小鼠远端小肠中活性/非活性β-catenin水平相当(在线补充图7B-E)，但含有后bpd - ds微生物的小鼠比含有前bpd - ds微生物的小鼠显示出更高水平的无活性β-catenin (在线补充图7B)．这些结果表明，BPD-DS后肠道菌群可以将信号传递给宿主，并改变β-catenin的激活状态，这可能会抑制细胞增殖，并可能有助于降低减肥手术后暴露于菌群的肠道细胞的肠道吸收表面。

    bpd - ds患者的肠道微生物群靶向定殖远端小肠，以sglt1依赖的方式降低大鼠的血糖

    为了在另一个已经含有微生物群的模型中直接测试远端小肠中肠道微生物相关的变化，我们对雌性SPF大鼠进行定植，方法是在BPD-DS之前或之后将女性患者的粪便泥浆直接注入大鼠的远端小肠，然后进行USI GTT (图6)．在体重匹配的SPF大鼠中(图6 b)，与接受BPD-DS前粪便泥浆的大鼠相比，BPD-DS后患者的肠道微生物群远端小肠定植足以降低USI-GTT的血糖AUCs (图6 c)．与实验前体重相当(图6 d)，但经空肠内注射间霉素(图6 e)．为了评估远端小肠葡萄糖吸收是否发生在回肠，通过回肠插管将葡萄糖注入大鼠回肠，而不是USI。我们发现回肠葡萄糖输注不能提高血糖(在线补充图8)．这些数据表明，BPD-DS后的肠道微生物可以通过局部减少SPF大鼠远端空肠的葡萄糖吸收来改善宿主的葡萄糖耐量，而不是回肠。

    Targeted colonisation of the distal small intestine with gut microbes from patients after bioliopancreatic diversion with duodenal switch (BPD-DS) lowers blood glucose in rats in a sodium-glucose cotransporter (Sglt)1-dependent manner. (A) Gut catheters were placed into the luminal compartment of specific pathogen-free (SPF) female rats 6 cm and 18–22 cm distal to the pyloric sphincter and therefore positioned at the upper small intestine (USI) and middle jejunum, respectively. Next, 1 day after jejunal cannulation, equivalent amounts of faecal slurries from female patients before or after BPD-DS were pooled together and infused into the jejunal cannula 3 times a week for 4 weeks to target the distal jejunum and ileum of SPF rats. On 3 weeks (ie, 21 days) of colonisation, rats underwent surgery for USI and vascular cannulation. After 5 days of recovery, rats were fasted overnight, infused with vehicle or phloridzin via jejunal cannula (targeting the distal jejunum and ileum) and then immediately infused with glucose through the USI cannula (targeting almost the entire small intestine). Blood glucose was monitored at different time points (0, 5, 10, 20, 30, 40 min) after USI glucose infusion. Body weight, glucose excursion curves and area under the curves (AUC) of USI GTT in rats infused with (B, C) vehicle and (D, E) phloridzin. Data are presented as the mean±SEM. Unpaired Student’s t-test was used to calculate p values, which were considered significant at p<0.05. Each square or triangle represents a biological replicate (n=6–8).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    十二指肠开关生物胰分流(BPD-DS)后患者肠道微生物靶向定殖远端小肠，以钠-葡萄糖共转运体(Sglt)1依赖方式降低大鼠血糖。(A)将肠道导管分别放置于特异性病原体无(SPF)雌性大鼠幽门括约肌远端6 cm和18-22 cm处的腔室中，分别置于小肠上部(USI)和空肠中部。接下来，空肠插管后1天，将女性患者BPD-DS术前或术后等量的粪便浆集中在一起，每周3次注入空肠插管，持续4周，以SPF大鼠的远端空肠和回肠为目标。定植后3周(即21天)，大鼠接受USI和血管插管手术。恢复5天后，大鼠禁食一晚，通过空肠插管(以空肠远端和回肠为目标)输注载液或间氯津，然后立即通过USI插管输注葡萄糖(以几乎整个小肠为目标)。在USI输注葡萄糖后不同时间点(0、5、10、20、30、40 min)监测血糖。(B, C)载液和(D, E)间氯津灌注大鼠USI GTT的体重、葡萄糖漂移曲线和曲线下面积(AUC)数据以均数±标准差表示。采用非配对学生t检验计算p值，p<0.05为显著性。每个正方形或三角形代表一个生物副本(n= 6-8)。

    bpd - ds和lsg后受体小鼠的特定分类特征与微生物群可传播的血糖控制改善有关

    为了确定从减肥手术患者传播给小鼠的细菌群落特征，我们对LSG和BPD-DS前后微生物定殖的GF粪便样本进行了16S rRNA基因测序分析。在我们的模型中，分别接受BPD-DS和LSG治疗的供体患者粪便中鉴定出的asv中，有7.3%和18.7%传播给了受体GF小鼠(在线补充图9)．在BPD-DS和LSG受体小鼠中，传播类群分别占所有asv的13.1%和20% (在线补充图9)．与之前的报告一致，29 30供体患者BPD-DS倾向于降低α-多样性(在线补充图10A)，在LSG (在线补充图10B)．我们发现在被BPD-DS和LSG患者粪便定植的GF小鼠中α-多样性没有差异(在线补充图10C,D)，表明粪便样品中的微生物α-多样性并不是人到小鼠微生物群介导的血糖变化传递的关键特征。这些发现与减肥手术后血糖控制改善与细菌多样性增加无关的报道一致。30 31

    用BPD-DS或LSG患者粪便定植的小鼠粪便样本的布雷-柯蒂斯分类组成的主成分分析显示，BPD-DS前和BPD-DS后的微生物群落组成没有分离(图7)．相反，粪便样品的微生物组成分离了lsg前和lsg后，样品之间的46.2%的变化可以用前两个轴解释(图7 b)．我们进一步调查了术前和术后的丰富类群，发现lsg后受者粪便中有更高水平的Parabacteroides以及梭状芽孢杆菌纲的几个成员(例如，Caproiciproducens，Robinsoniella， GCA-900066575)与前lsg接受者(图7 c而且在线补充图11)．Blautia梭状芽孢杆菌属的另一个成员，是一个例外，在lsg后的接受者中显示出较低的丰度(图7 c而且在线补充图11)．对于BPD-DS受体，我们发现梭状芽孢杆菌有更微妙的扩张，其特征是有三个类群更高的存在:RobinsoniellaGCA-900066575(在后lsg接受者中也更高)和Anaerostignum（图7 c而且在线补充图11)．与LSG后被菌群定植的GF小鼠相似，低Blautia以及高水平的Parabacteroides在被bpd - ds后微生物群定植的GF小鼠(图7 c而且在线补充图11)．我们的研究结果强调了bpd - ds和lsg后的分类学特征，这些特征与血糖控制中微生物群传播的改善有关。

    Bacterial composition of the faeces of mice colonised with the faecal microbiota of patients before and after bioliopancreatic diversion with duodenal switch (BPD-DS) or laparoscopic sleeve gastrectomy (LSG). (A, B) Principal coordinate analysis (PCoA) on Bray-Curtis dissimilarity index comparing the faecal bacterial composition of female germ-free (GF) mice colonised with the faecal microbiota of patients before and after BPD-DS or LSG. The samples are stratified by patient donors of faecal microbiota. Permutational multivariate analysis of variance was used to assign statistical significance to the distance between clusters (presurgery vs postsurgery) in PCoA scatter plots. (C) Heat maps depicting the average of replicates for taxa significantly different between presurgery and postsurgery groups (p<0.05, Wilcoxon rank-sum test). ASVs were clustered at 99% similarity and collapsed to the genus level. The relative abundance of taxa is expressed as log10 fold change from its median level across the entire cohort (both surgeries combined). All relative abundance values of 0 were assigned 1×10−6, an order of magnitude lower than the lowest detectable relative abundance in the data, to allow the logarithmic transformation of the fold change. Each square, triangle and circle represents a biological replicate (n=11–12).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    在十二指肠开关生物胰分流术(BPD-DS)或腹腔镜袖状胃切除术(LSG)前后，与患者粪便微生物群定植的小鼠粪便细菌组成。(A, B) BPD-DS或LSG前后患者粪便菌群定植的雌性无菌(GF)小鼠粪便细菌组成的Bray-Curtis不相似指数主坐标分析(PCoA)。样本由患者粪便微生物群供体分层。采用置换多元方差分析对PCoA散点图中聚类之间的距离(术前与术后)进行统计学意义分析。(C)热图显示术前组和术后组类群重复的平均值有显著差异(p<0.05, Wilcoxon秩和检验)。asv在相似度为99%的水平上聚类，并降至属水平。分类单元的相对丰度用log表示10在整个队列(两次手术合并)中位水平的变化为2倍。所有相对丰度为0的值都赋值为1×10−6，比数据中可检测到的最低相对丰度低一个数量级，以允许折叠变化的对数变换。每个正方形、三角形和圆形代表一个生物副本(n= 11-12)。

    讨论

    我们的数据显示，在两次不同的减肥手术后，患者肠道微生物的一个子集与更好的葡萄糖耐量相关，独立于小鼠脂肪量的变化。我们发现，人类限制性和吸收不良手术后的肠道菌群中含有可以降低血糖的微生物(或微生物因子)。然而，我们发现减肥手术后的微生物群没有改变胰岛素分泌、胰岛素清除率或胰岛素抵抗。我们发现，减肥手术后微生物群引起的低血糖的机制是远端小肠葡萄糖吸收降低。这一点很重要，因为病态肥胖患者的肠道葡萄糖吸收增加。32人们已经知道，减肥手术，如BPD-DS，促进葡萄糖排泄到肠腔28并增加肠细胞增生/肥大和糖酵解，使肠道成为血糖处理的关键部位。25日- 27日33然而，尽管这些典型的吸收不良手术的适应性改变在LSG患者中不存在，但限制性手术后仍可见肠道葡萄糖吸收降低。26日27日在这里，我们表明，减肥手术后的细菌是一个独立的因素，可以降低宿主的肠道吸收表面，并降低餐后葡萄糖在肠道的吸收。肠道微生物和饮食调节肠道形态是有先例的。益生菌可以改变鱼的肠道形态，34高脂肪喂养的小鼠肠道吸收表面较低。35人们很容易推测，在人类减肥手术后，某些肠道微生物可能会施加反调节压力，作为补偿吸收不良手术后肠细胞增生/肥大的一种手段，25根据我们的发现，它可能参与Wnt/β-catenin通路，将信号传递到宿主上肠。

    减肥手术后菌群组成迅速改变。6我们最初假设微生物的变化会参与减肥手术后早期的血糖降低，比如体重显著减轻前几天。然而，我们的数据提出了一种有趣的可能性，即微生物的功能可能是改善长期血糖控制，而不是减肥手术的即时效果。在我们的研究中，我们使用无菌小鼠定植至少7周，因为有足够的暴露时间(即>45天)，并且需要多次灌胃才能使微生物影响GF小鼠的血糖。36 37在接受RYGB的大鼠粪便微生物移植到小鼠体内后，葡萄糖稳态在短时间内有适度改善的报道。14虽然这可以部分解释为人类BPD-DS与大鼠RYGB的差异，8宿主暴露于某些微生物的时间似乎是改变血糖的关键因素。

    在我们的研究中，通过在减肥手术前后口服灌胃具有肠道微生物群的SPF小鼠，未能传递更好的糖耐量。然而，我们发现长期(3次/周，持续4周)直接腔内微生物移植到SPF大鼠的远端小肠可以绕过这一限制，并在减肥手术后利用粪便细菌传递低血糖。这些发现为增强可以改变宿主代谢的微生物移植方案奠定了基础。总的来说，我们的工作认为微生物群诱导的肠道形态和葡萄糖吸收的变化是有助于持久降低血糖和长期T2D缓解的一个因素。

    基于扩增子的方法，如本文所使用的方法，不允许深入评价定殖效率，也不允许菌群植入的菌株水平分辨率。考虑到局限性，我们模型中的定殖效率估计在7%到20%之间，这比先前报道的要低。12 37我们承认，在我们的定植模型中，只有一小部分供体微生物群有望在样本收集、制备/存储(例如，冻融循环、暴露于氧气)和交付中幸存下来。但最重要的是，我们发现，在两种不同类型的减肥手术后，来自肠道微生物群的相对较小的细菌子集足以降低不同啮齿类动物模型的血糖。重要的是要考虑到(i)手术前后的人类接种来自同一患者，并且处理相同，(ii)在GF小鼠和SPF大鼠的多个队列中观察到可传递微生物的改善糖耐量，以及(iii)小鼠和大鼠的研究是由不同的操作员在不同的动物设施中进行的。虽然我们可以利用这种相对较小的定殖效率来缩小可能涉及降低宿主血糖的细菌范围，但重要的是要承认，我们的供体队列不够大，无法更精确地识别受体小鼠的细菌特征。每只小鼠都用来自一个供体的粪便物质进行定植，因此受体小鼠队列反映了在人类个体微生物群中典型的高个体间变异性。重要的是，我们的研究表明，通过微生物群转移来改善糖耐量的传递不是供体特异性的，这表明在不同类型的减肥手术后，人类体内可能出现的多种微生物群落包含功能冗余，可以降低宿主体内的肠道葡萄糖吸收和血糖。

    更高的Parabacteroides和更低的Blautia在限制性和吸收不良手术后共享的关键遗传分类学特征，与受体小鼠更好的葡萄糖控制相一致。我们强调这些类群，因为它们是受体小鼠粪便中含量最多的前20个类群之一，因为之前的研究结果与增加有关ParabacteroidesSPP可改善肥胖期间的代谢功能。38我们的结果与Ridaura一致等在该研究中，瘦人/血糖正常的人体内的微生物可以覆盖肥胖双胞胎粪便定植的GF小鼠体内的肥胖表型。特别是,拟杆菌spp和Parabacteroides瘦相关菌群中的SPP可以定植与肥胖相关菌群的小鼠。12使用双胞胎的另一种方法是像我们在这里所做的那样，在减肥手术前后使用患者内部比较，观察到体重和血糖的显著降低(表1)．我们的研究结果扩展了这一概念，并表明微生物群可传播的改变与宿主代谢相关ParabacteroidesSPP能在不降低体重的情况下降低血糖。值得注意的是Parabacteroides属和密切相关的属拟杆菌显示低酰化脂多糖(LPS)，可以拮抗toll样受体439-41多糖A具有耐受性，39 41 42这可能有助于改善术后受体小鼠的葡萄糖耐量。我们的数据还指出Blautia作为减肥手术后改善血糖控制的常见菌群属。的确,Blautia在糖尿病患者的粪便中含量更高43 44并且在减肥手术后更低。6 29总的来说，我们的研究结果强调，在两种类型的减肥手术后，小群细菌始终与改善血糖耐量的传递有关。由于后生物制剂可以改善宿主体内的葡萄糖稳态，45-48我们相信我们的工作为研究能够降低肠道葡萄糖吸收和血糖的后生物制剂提供了基础证据。从一个角度来看，在后续研究中探索粘膜血清素与减肥手术中微生物相关的降糖作用之间的联系是很有吸引力的。肠道衍生血清素分泌是一种受微生物群影响的特征49这已被证明会影响葡萄糖调节50还有肠道形态学。51此外，虽然我们证明了来自女性的人类微生物群可以传递雌性小鼠的血糖变化，但对雄性小鼠的任何性别依赖效应尚不清楚。

    我们得出结论，减肥手术后人类粪便中的微生物是降低sglt1介导的肠道葡萄糖吸收的独立因素，因此在转移到啮齿动物时改善血糖控制。这种微生物驱动的效应与远端小肠绒毛的结构变化有关。我们提出了一个模型，其中微生物群的变化有助于减肥手术的长期降糖效果，独立于肥胖和胰岛素抵抗中与微生物群相关的变化。可以降低葡萄糖吸收的微生物和/或其成分应该被挖掘为可以通过限制葡萄糖进入宿主而有助于持久降低血糖的因素。

    数据可用性声明

    应合理要求提供数据。

    伦理语句

    患者发表同意书

    伦理批准

    本研究由Québec心肺研究所研究伦理委员会批准(协议n°2015-2466,21160和21181,MP-10-2015-2489)。所有动物实验程序均由麦克马斯特大学动物伦理审查委员会(AREB, ref# 200103)和大学卫生网络机构动物护理和使用委员会(UHN, ref# 5884.16)根据加拿大动物护理委员会的指导方针批准。参与者在参与研究前均知情同意参与研究。

    致谢

    我们感谢Mélissa Pelletier和Mélanie Nadeau在人类数据和样本方面的技术援助，并感谢Nicola Henriquez在质谱方面的技术援助。

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    补充材料

    • 补充数据

      此网页文件由BMJ出版集团从作者提供的电子文件制作而成，并没有对内容进行编辑。

    脚注

    • 推特@ fernandez， @BeatriceSY_Choi， @TKTLam， @SchertzerLab

    • 贡献者FFA, JS, AM, TKTL和AT推导了假设并研究了数据。FFA进行实验，分析数据并撰写手稿。SZ和S-YZ进行了实验并分析了数据。BS-YC和NGB进行了实验。CYC和KPF帮助进行实验。LB进行手术。JS, AM和TKTL编辑了手稿。所有作者都参与了数据讨论，并在提交前批准了手稿。JS是担保人。

    • 资金这项研究得到了加拿大卫生研究院(CIHR)关于减肥护理的团队资助(TB2-138776)，强生医疗公司的研究者发起的研究资助(grant eth14 -610)和CIHR加拿大微生物组倡议2 (CMI2)团队资助(MRT-168045)的支持。

    • 免责声明试验的资金来源在研究的设计、实施或管理、数据收集、数据分析或解释，或本手稿的准备和发表决定中没有任何作用。

    • 相互竞争的利益FFA和S-YZ拥有加拿大卫生研究所(CIHR)博士后奖学金。AT和LB获得了强生医疗公司、Bodynov和美敦力公司的研究拨款支持，用于研究减肥手术，并担任IUCPQ和拉瓦尔大学的减肥和代谢手术研究主席。TKTL是加拿大糖尿病和肥胖研究主席和JK。McIvor在糖尿病研究中担任捐赠主席。JS是加拿大代谢性炎症研究主席。AM得到了CIHR/辉瑞在胰岛素抵抗和心血管疾病发病机制方面的研究主席的支持。JS是本次研究的担保人，因此对本次研究的工作和开展承担全部责任。

    • 患者和公众参与患者和/或公众参与了本研究的设计、实施、报告或传播计划。更多细节请参考“方法”部分。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。

    • 补充材料此内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅是作者的意见或建议，不被BMJ认可。BMJ不承担因对内容的任何依赖而产生的所有责任和责任。如果内容包括任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且对因翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏不负责。