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胰腺
原文
GATA6调节EMT和肿瘤扩散，是胰腺癌辅助化疗反应的标志
  1. Paola Martinelli1，2，
  2. Enrique Carrillo-de Santa Pau1，
  3. 特雷弗·考克斯3.，4，
  4. 布鲁诺·塞恩斯5，
  5. 纳尔逊Dusetti6，
  6. 威廉Greenhalf4，
  7. 洛伦佐·里纳尔蒂1，7，
  8. Eithne科斯特洛3.，
  9. Paula Ghaneh3.，4，
  10. Nuria Malats8，
  11. 马库斯Buchler9，
  12. 玛丽娜Pajic10，
  13. 安德鲁·V·比金10，11，12，13，
  14. 胡安Iovanna6，
  15. 约翰Neoptolemos3.，4，
  16. 弗朗西斯科X雷亚尔1，14
  1. 1上皮癌变组，西班牙国家癌症研究中心cnio，马德里、西班牙
  2. 2癌症进展和转移组，维也纳医科大学癌症研究所，维也纳、奥地利
  3. 3.英国癌症研究利物浦临床试验单位，利物浦大学，利物浦、英国
  4. 4NIHR利物浦胰腺生物医学研究单位，分子和临床癌症医学系，利物浦大学，利物浦、英国
  5. 5预防医学、公共卫生和微生物学系，马德里大学Autónoma，马德里、西班牙
  6. 6马赛研究中心Cancérologie马赛(CRCM)， INSERM U1068, CNRS UMR 7258, Aix-Marseille Université和Paoli-Calmettes研究所，Parc科学与技术公园，马赛、法国
  7. 7巴塞罗那生物医学研究所、西班牙
  8. 8遗传和分子流行病学小组，西班牙国家癌症研究中心cnio，马德里、西班牙
  9. 9普通、内脏和移植外科，海德堡大学医院，海德堡、德国
  10. 10癌症的部门，金霍恩癌症中心加文医学研究所，悉尼、澳大利亚
  11. 11格拉斯哥大学癌症科学研究所沃尔夫森沃尔癌症研究中心，格拉斯哥、英国
  12. 12苏格兰西部胰腺科，格拉斯哥皇家医院，格拉斯哥、英国
  13. 13新南威尔士大学医学院西南悉尼临床学院，利物浦、澳大利亚
  14. 14Departament de Ciències实验和致敬，庞培法布拉大学，巴塞罗那、西班牙
  1. 对应到Francisco X Real博士，CNIO, Melchor Fernandez Almagro, 3岁。西班牙马德里28029;freal在{}cnio.esPaola Martinelli Borschkegasse博士8a。1090奥地利维也纳;paola.martinelli在{}meduniwien.ac.at

摘要

背景及目的GATA因子在癌症中的作用近年来越来越受到关注，但GATA6在胰导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)中的作用存在争议。GATA6在一部分肿瘤中被扩增，并被认为是致癌的，但在分化良好的肿瘤中发现了高GATA6水平，并与更好的患者预后相关。相比之下，GATA6的肿瘤抑制功能是通过遗传小鼠模型证明的。我们旨在阐明GATA6在PDAC中的作用。

设计我们将GATA6在PDAC细胞系中的沉默和过表达与GATA6 ChIP-Seq和RNA-Seq数据相结合，以了解GATA6功能的机制。然后，我们在主要患者样本中证实了我们的一些观察结果，其中一些样本包含在ESPAC-3辅助治疗随机临床试验中。

结果GATA6在体外抑制上皮-间充质转化(EMT)，在体内抑制细胞传播。GATA6具有独特的前上皮细胞和抗间充质细胞功能，其转录调控是直接的，间接地暗示了EMT中涉及的其他转录因子的调控。GATA6在肿瘤中丢失，与分化改变和获得基样分子表型有关，与上皮-上皮(ET)一致2)过渡。基底样GATA6患者低肿瘤的生存期较短，对辅助5-氟尿嘧啶(5-FU)/亚叶酸钙的反应明显较差。然而，对培养细胞中GATA6表达的调节并不直接调节对5-FU的反应。

结论我们提供了GATA6抑制肿瘤功能的机制，它作为典型上皮分化的调节因子的作用，并提出GATA6表达的缺失既是对辅助治疗反应的预后和预测。

  • 癌症遗传学
  • 上皮分化
  • 基因调控
  • 胰腺癌
  • 辅助治疗

这是一篇根据创作共用署名(CC BY 4.0)许可条款发布的开放获取文章，该许可允许其他人出于商业用途分发、混音、改编和构建此作品，前提是正确引用原始作品。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2015-311256

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    视频1

    本研究的意义

    关于这个问题我们已经知道了什么?

    • GATA6在小鼠胰腺中维持上皮分化，并抑制突变kras驱动的小鼠肿瘤发生。

    • 典型亚型的胰腺肿瘤具有更好的预后，具有高GATA6表达。

    • GATA6在胰腺肿瘤的一个子集中被扩增，其过表达增加了体外胰腺癌细胞的增殖。

    • 携带肿瘤的患者GATA6放大/拷贝数增益存活时间更长。

    新的发现是什么?

    • GATA6通过直接和间接的独特机制调控胰腺癌细胞的上皮细胞-间充质转化(epithelial - mesenchymal transition, EMT)，同时控制上皮细胞和间充质细胞的转录程序。

    • GATA6抑制基样分子表型的异位表达，类似于在乳腺癌和膀胱癌中描述的，它在GATA6的一个子集中被激活低肿瘤。

    • 基底样GATA6患者低肿瘤患者的生存期比GATA6患者更差媒介或GATA6高肿瘤。

    • GATA6患者低与GATA6患者相比，5-氟尿嘧啶(5-FU)/亚叶酸辅助性治疗肿瘤的预后更差高肿瘤，而吉西他滨治疗对两组有相同的效果

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 我们最终解释了从观察到的难题，即GATA6在肿瘤的一个子集中被放大;然而，高GATA6的患者存活时间更长。

    • GATA6表达可作为患者预后的标志物。

    • 如果在一项独立研究中得到证实，我们观察到GATA6患者低5-FU/亚叶酸钙辅助治疗可指导胰腺癌患者的治疗选择。

    简介

    胰腺导管腺癌(PDAC)是最常见的胰腺癌类型，预后不佳1，2在切除和吉西他滨或5-氟尿嘧啶(5-FU)+亚叶酸叶酸或吉西他滨辅助化疗后，5年生存率为25%-30%。3 - 7大多数患者的病情已发展到晚期，不适合手术。吉西他滨是治疗局部晚期和转移性疾病的主要药物。最近，吉西他滨+nab-紫杉醇和FOLFIRINOX联合化疗显示，晚期疾病患者的生存有适度改善。8，9

    PDAC的外显子组/基因组测序揭示了一种复杂的遗传改变模式，影响多种核心信号通路。10少数经常改变的基因(喀斯特，CDKN2A，TP53，SMAD4)已被证明很难靶向治疗。其余的改变发生在<10%的肿瘤中，因此不是新疗法的理想靶点。患者分层治疗选择是不可行的，因为缺乏病理/分子标志物，可以可靠地预测治疗反应。最近关于高hENT-1肿瘤蛋白水平与吉西他滨反应相关的报道是有希望的，但需要在前瞻性研究中重复。11新的治疗靶点和标志物的识别是患者分层和靶向治疗的两个优先事项。

    组学技术提供了一种新的癌症分子分类学。在PDAC中，很少有研究针对基于分子的分类。Collisson等12鉴定出三种PDAC亚型:经典型、外分泌型和间充质型。经典肿瘤显示高GATA6 mRNA表达，患者有明显更好的结果。具有经典表型的细胞对体外化疗有明显的反应．12GATA6属于与(a /T)GATA(a /G)一致序列结合以激活或抑制基因表达的转录因子家族。13GATA因子对细胞分化很重要GATA6对于维持成年小鼠的外分泌胰腺是必不可少的。14GATA6在PDAC中的致癌作用是基于发生的GATA6一小部分肿瘤的增益/放大。15，16然而,高GATA6拷贝数与PDAC患者的更好结局显著相关，17这表明它的功能可能比最初设想的更复杂。最近在PDAC小鼠模型中假设了GATA6的肿瘤抑制作用，18，19它调节与分化相关的以及与癌症相关的转录程序。

    在这里，我们发现，在人PDAC细胞中，GATA6通过一种涉及转录因子(包括FOXA1/2)调控的独特机制，直接或间接地抑制去分化和上皮间质转化(EMT)。一致地，PDAC主要样本中GATA6的缺失与分化改变和患者总体生存期缩短有关。最后，分析来自ESPAC-3随机辅助化疗试验的肿瘤样本7表明GATA6低表达预示对辅助剂5-FU/亚叶酸钙反应较差。

    结果

    GATA6维持PDAC细胞的典型上皮表型

    为了确定GATA6的功能，我们分析了它在一组PDAC细胞系中的表达，以选择用于功能丧失和功能获得分析的最佳模型(见在线补充数字S1)。我们沉默了三种PDAC细胞系中的GATA6，包括一种GATA6放大(A13B),16使用两种不同的慢病毒驱动shrna(图A, B和见在线补充数字S2A-C)。PaTu8988S细胞生长为致密菌落，GATA6沉默后呈纺锤状，散射增加。E-cadherin下调，vimentin上调(图1A, B)，所有特征都表明是急救医生。类似地，gata6沉默的A13B细胞显示出较低的E-cadherin水平在线补充数字S2B, S2D)和gata6沉默的SK-PC-1细胞显示波形蛋白水平升高(见在线补充数字S2D)。尽管GATA6沉默对细胞特异性的影响部分不同(可能取决于下调的程度和遗传背景)，但我们观察到对EMT的共同趋同。一致地，在L3.6pl PDAC细胞中，GATA6过表达-表现出松散的生长模式-导致紧密菌落的形成，减少散射，上调E-cadherin表达和下调vimentin (图1C-D，看在线补充数字S2F)。这些发现支持间充质-上皮转变(MET)，并证明GATA6在PDAC细胞中维持典型上皮表型。

    GATA6 is required for the maintenance of the epithelial phenotype of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) cells. (A) Top: phase contrast microphotographs of PaTu8988S cells infected with either shCtrl or two different GATA6-targeting shRNAs (shG6-1 and shG6-2). Higher magnification of the highlighted region is shown in the inset. Bottom: expression of E-cadherin and vimentin detected by immunofluorescence. Nuclear counterstaining with diamidino-2-phenylindole (DAPI) is shown separately. Scale bars: 50 μm. (B) Expression of GATA6, KRT5, KRT14, E-cadherin and vimentin, detected by western blotting, in total lysates from PaTu8988S cells infected with the indicated constructs. Vinculin was used as a loading control. (C) Left: L3.6pl cells infected with either an empty vector (Ctrl) or a GATA6-overexpressing vector (G6). Right: expression of E-cadherin, and vimentin detected by immunofluorescence. Nuclear counterstain with DAPI is shown separately. Scale bars: 50 μm. (D) Expression of GATA6, E-cadherin and vimentin detected by western blotting in total lysates from L3.6pl cells infected with the indicated constructs. Vinculin was used as a loading control.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    GATA6是维持胰腺导管腺癌(PDAC)细胞上皮表型所必需的。(A)上:被shCtrl或两种不同的靶向gata6的shrna (shG6-1和shG6-2)感染的PaTu8988S细胞的相位对比显微照片。高亮区域的高倍放大显示在插图中。下图:免疫荧光检测E-cadherin和vimentin的表达。二氨基苯基吲哚(DAPI)的核反染色单独显示。比例尺:50 μm。(B) western blotting检测GATA6、KRT5、KRT14、E-cadherin和vimentin在感染上述结构物的PaTu8988S细胞总裂解液中的表达。以Vinculin作为加载对照。(C)左:L3.6pl细胞感染空载体(Ctrl)或gata6过表达载体(G6)。右图:免疫荧光检测E-cadherin和vimentin的表达。 Nuclear counterstain with DAPI is shown separately. Scale bars: 50 μm. (D) Expression of GATA6, E-cadherin and vimentin detected by western blotting in total lysates from L3.6pl cells infected with the indicated constructs. Vinculin was used as a loading control.

    GATA6抑制体外侵袭和体内细胞播散

    EMT在肿瘤进展和扩散中起重要作用20.，21并与PDAC患者的预后相关。22一致地，gata6沉默的PaTu8988S和SK-PC-1细胞在体外表现出更高的入侵能力(图2A，看在线补充数字而过表达GATA6的L3.6pl细胞的侵袭性降低(图2B).为了评估GATA6对肿瘤细胞传播的贡献，我们将GATA6沉默的PaTu8988S和GATA6过表达的L3.6pl细胞以及各自的对照细胞注射到胸腺癌的脾脏中Foxn1ν并通过qPCR测量人类基因在肝脏中的表达，估计传播。GATA6在PaTu8988S细胞中的沉默显著增加了其到达肝脏的能力(p=0.048)，而在L3.6pl细胞中过表达GATA6具有相反的效果(p=0.032) (图2C)。

    GATA6 inhibits invasion in vitro and cell dissemination in vivo. (A) Quantification of the in vitro invasiveness of PaTu8988S cells infected with the indicated constructs, measured as number of invading cells per microscopic field (×20 magnification). Data are mean±SEM of at least three independent experiments; **p<0.01. (B) Quantification of the in vitro invasiveness of L3.6pl cells infected with the indicated constructs. Data are mean±SEM of at least three independent experiments; **p<0.01. (C) Quantification of the metastatic burden in the liver of nude mice after intrasplenic injection of the indicated cells, measured by qPCR with human-specific primers detecting HPRT; *p<0.05.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    GATA6抑制体外侵袭和体内细胞播散。(A)用所示结构物感染的PaTu8988S细胞的体外侵袭性的量化，测量为每个显微镜场(×20放大倍率)的侵袭细胞数量。数据为至少三个独立实验的均值±SEM;**p < 0.01。(B) L3.6pl细胞感染指示结构的体外侵袭性的量化。数据为至少三个独立实验的均值±SEM;**p < 0.01。(C)在脾脏内注射指示细胞后，裸鼠肝脏转移负担的定量，用qPCR检测人特异性引物产生HPRT；＊p < 0.05。

    这些数据表明，GATA6可能通过调控EMT/MET抑制PDAC细胞获得转移潜能。此外，在最近发表的数据集中，GATA6在原发肿瘤(n=145)和邻近正常胰腺(n=46)中表达水平相当，23而在转移瘤中则显著降低(n=61) (p<0.001，见在线补充数字S3)，与GATA6在患者中的抗转移作用一致。

    GATA6直接或间接阻断EMT

    EMT主要受SNAI、ZEB和TWIST转录因子控制，抑制E-cadherin表达和上皮分化，20.而目前已知的上皮程序的阳性调控因子很少。

    分析的所有gata6沉默细胞中E-cadherin mRNA均降低(图3A)，并在过表达L3.6pl细胞中上调(图3B)。此外，在gata6沉默的PaTu8988S细胞中SNAI2、ZEB1和TWIST1的mRNA水平上调，间充质标志物vimentin (图3C)。因此，在过表达gata6的L3.6pl细胞中SNAI1和vimentin mRNA水平降低(图3B).这些数据表明GATA6可以通过涉及emt诱导转录因子(emt - tf)的典型通路调控EMT-MET。不同细胞系间，依赖gata6的emt - tf水平变化不同，提示EMT-MET调控趋同。

    GATA6-dependent direct and indirect transcriptional regulation of epithelial–mesenchymal transition (EMT). (A) Expression of E-cadherin in PaTu8988S, A13B and SK-PC-1 cells infected with the indicated shRNA constructs, detected by RT-qPCR. (B) Expression of E-cadherin, SNAI1 and VIM (vimentin) in L3.6pl cells infected with the indicated constructs, measured by RT-qPCR. (C) Expression of SNAI2, ZEB1, TWIST1 and VIM in PaTu8988S cells infected with the indicated constructs, measured by RT-qPCR. (D) GATA6 binding to the indicated regions of the E-cadherin promoter detected by ChIP-qPCR in PaTu8988S cells. (E) Luciferase-based reporter assay showing the activity of an E-cadherin reporter in HEK293 cells transfected with empty vector (blue) or with vectors expressing either wild-type (light green) or mutated (dark green) GATA6. (F) GATA6 binding to the promoters of the indicated genes, detected by ChIP-qPCR in PaTu8988S cells. Data are presented as mean±SEM of at least three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01 in all panels. ChIP-qPCR data are represented as % of input normalised against a negative control sequence, compared with binding of non-specific IgG; statistical significance is calculated for the enrichment of GATA6 binding to the region of interest, compared with the negative sequence.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    gata6依赖的上皮-间充质转化(EMT)的直接和间接转录调控。(A) RT-qPCR检测被指定shRNA构建物感染的PaTu8988S、A13B和SK-PC-1细胞中E-cadherin的表达。(B)通过RT-qPCR检测被指定结构物感染的L3.6pl细胞中E-cadherin、SNAI1和VIM (vimentin)的表达。(C)通过RT-qPCR检测SNAI2、ZEB1、TWIST1和VIM在被指定结构物感染的PaTu8988S细胞中的表达。(D)在PaTu8988S细胞中，通过ChIP-qPCR检测到GATA6与E-cadherin启动子的指示区域结合。(E)以荧光素酶为基础的报告性试验显示一种钙粘蛋白转染空载体(蓝色)或表达野生型(浅绿色)或突变型(深绿色)GATA6的载体(深绿色)的HEK293细胞。(F)在PaTu8988S细胞中通过ChIP-qPCR检测GATA6与指示基因启动子的结合。数据以至少三个独立实验的平均值±标准差表示。*p<0.05， **p<0.01。ChIP-qPCR数据表示为与非特异性IgG结合相比，与阴性对照序列归一化的输入百分比;与阴性序列相比，GATA6结合到感兴趣区域的富集具有统计学意义。

    为了进一步阐明GATA6是如何调节EMT的，我们使用ChIP-Seq技术确定了GATA6在PaTu8988S细胞中的全基因组分布。GATA6占据26 248个基因组区域(FDR<0.01，见在线补充数据设置S1)。规范的GATAA序列是序列标记中最丰富的基序(见在线补充数字S4A, E-value: 3.8e-350)。GATA6的峰值优先被发现(40%)在编码基因转录起始位点(TSS) 1 kb内在线补充数字S4B)。ChIP-qPCR证实了一部分基因的ChIP-Seq结果在线补充数字自己)。

    一项手动emt靶向分析显示了两个GATA6峰钙粘蛋白轨迹(见在线补充数字S4D)。其中一个包括TSS，并包含一个非典型的GATC序列，GATA3在乳腺癌细胞中与之结合。24我们确认了GATA6在这个序列和TSS (图3D).野生型gata6 -但不是dna结合突变体17增强的活动钙粘蛋白启动器-报告器结构，包括TSS (图3E)，表明直接转录激活。另一个峰值接近四个典型的GATAA基序;通过ChIP-qPCR检测，证实其在第一个位点附近的结合(图3D). GATA6还结合了多个上皮基因的启动子，包括原钙粘蛋白、紧密连接成分(Cldn1, cldn4, cldn7, ocn, tjp1, tjp2, tjp3)、桥粒蛋白(Dsc2 dsc3 dsg2)、整合素和角蛋白。我们观察到GATA6与的启动子结合SNAI1而且ZEB1,的第二个内含子ZEB2(经ChIP-qPCR证实;图3F，看在线补充数字S4D)。的启动子中也发现了GATA6VIM(编码波形蛋白)和其他间充质基因(图3F，看在线补充数字S4D)。基因富集和功能注释分析(DAVID套件)25在5643个距离TSS < 1kb且FDR<0.1%的GATA6峰上在线补充表S1)显示“局灶粘附”、“紧密连接”和“肌动蛋白细胞骨架调节”通路的富集。TGFβ和ERBB通路参与EMT和PDAC，10也得到了充实。这些结果表明，GATA6具有广泛的直接前上皮功能，并同时抑制间充质程序。

    GATA6调节E-cadherin诱导剂FOXA1和FOXA2

    在少数已知的e -钙粘蛋白转录激活因子中，FOXA1和FOXA2，26这是胰腺发育的两个重要调节因子。27显著的GATA6峰FOXA1而且FOXA2建议强力绑定(图4A)，在TSS通过ChIP-qPCR确认(图4B). FOXA1/2 mrna在过表达gata6的L3.6细胞中表达上调(图4C)在gata6沉默的PaTu8988S和SK-PC-1细胞中被抑制(图4D);gata6沉默的PaTu8988S细胞FOXA1/2蛋白减少(图4E).此外，野生型gata6 -而不是突变激活FOXA1而且FOXA2启动子-报告子结构(图4F).有趣的是，FOXA DNA结合序列是GATA6 ChIP-Seq中第二丰富的motif(见在线补充数字S4A)，我们证实FOXA2与GATA6靶标的一个子集结合，包括激活和抑制基因(见在线补充数字S4E)。总之，这些数据表明GATA6激活E-cadherin的转录，也可能是通过间接诱导FOXA1和FOXA2来激活其他靶标。因此，GATA6和FOXA1/2在它们的前上皮功能中相互合作。为了评估FOXA1/2对gata6依赖功能的贡献，我们在gata6过表达的L3.6pl细胞中分别沉默了它们，但大量细胞死亡阻碍了进一步的分析(未显示)。

    GATA6 directly activates the proepithelial transcription factors FOXA1 and FOXA2. (A) Representation of ChIP-Seq peaks on FOXA1 and FOXA2 promoters. (B) GATA6 binding to the promoters of FOXA1 and FOXA2 detected by ChIP-qPCR in PaTu8988S cells. (C–D) Expression of FOXA1 and FOXA2 in L3.6 (C), PaTu8988S and SK-PC-1 (D) cells infected with the indicated constructs, measured by RT-qPCR. (E) Expression of FOXA1 and FOXA2 proteins in GATA6-silenced PaTu8988S cells. Vinculin was used as loading control. (F) Luciferase-based reporter assay showing the activity of FOXA1 and FOXA2 promoter reporters in HEK293 cells transfected with empty vector (blue) or with vectors expressing either wild-type (light green) or mutated (dark green) GATA6. In all the panels, data are presented as mean±SEM of at least three independent experiments; *p<0.05, **p<0.01. ChIP-qPCR data are represented as % of input normalised against a negative control sequence, compared with binding of non-specific IgG; statistical significance is calculated for the enrichment of GATA6 binding to the region of interest, compared with the negative sequence.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    GATA6直接激活上皮前转录因子FOXA1而且FOXA2．(A) ChIP-Seq在FOXA1而且FOXA2启动子。(B) GATA6与启动子的结合FOXA1而且FOXA2在PaTu8988S细胞中进行ChIP-qPCR检测。(C - D) RT-qPCR检测FOXA1和FOXA2在L3.6 (C)、PaTu8988S和SK-PC-1 (D)细胞中表达。(E) gata6沉默的PaTu8988S细胞中FOXA1和FOXA2蛋白的表达。以Vinculin作为加载对照。(F)基于荧光素酶的报告试验显示活性FOXA1而且FOXA2用空载体(蓝色)或表达野生型(浅绿色)或突变型(深绿色)GATA6的载体转染HEK293细胞中的启动子报告子。在所有组中，数据以至少3个独立实验的平均值±SEM表示;＊p < 0.05,**p < 0.01。ChIP-qPCR数据表示为与非特异性IgG结合相比，与阴性对照序列归一化的输入百分比;与阴性序列相比，GATA6结合到感兴趣区域的富集具有统计学意义。

    GATA6在人PDAC中缺失，与上皮分化丧失有关

    我们使用4mm核心组织微阵列(TMA)对肿瘤(n=25)中的GATA6、E-cadherin和FOXA2进行了免疫组化分析，以检测肿瘤内异质性。GATA6广泛或局部丢失分别为4例(16%)和12例(48%)。在所有GATA6中，E-cadherin始终处于低水平/定位错误负的肿瘤和局灶性GATA6缺失区域。同样，FOXA2在GATA6基因中也很低负的区域，支持GATA6-FOXA2-E-cadherin轴在原发性PDAC中的相关性(图5A).在四个发表的PDAC基因表达研究的元数据集中(META, n=108)，28-31我们证实GATA6、FOXA2和E-cadherin mRNA水平呈正相关(所有比较p<0.001;图5B).在一个独立的系列中观察到类似的相关性(Moffitt，见在线补充数字S5)。23FOXA1表达与GATA6、FOXA2或E-cadherin无相关性(数据未显示)，表明FOXA2是PDAC中GATA6的主要伙伴。

    GATA6 loss in human pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is associated with altered differentiation. (A) Expression of GATA6, FOXA2, E-cadherin and KRT14 in two PDAC samples, detected by immunohistochemistry. Top: cells retaining GATA6 expression are FOXA2high, E-cadherinhigh and KRT14neg; bottom: GATA6neg cells are FOXA2low, E-cadherinlow and KRT14pos. Scale bar: 50 μm. (B) Scatter plots showing correlated expression of GATA6, FOXA2 and E-cadherin mRNA in the PDAC meta-dataset. (C) Proportion of tumours showing GATA6 amplification (blue) or genomic loss (red) in the combined analysis of three PDAC gene copy number variation datasets. The percentage of GATA6 losses that were independent from loss of SMAD4 is represented in dark red.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    GATA6在人胰腺导管腺癌(PDAC)中的缺失与分化改变有关。(A)免疫组化检测两种PDAC样品中GATA6、FOXA2、E-cadherin和KRT14的表达。上图:保留GATA6表达的细胞为FOXA2高,钙粘蛋白高和KRT14负的；底部:GATA6负的FOXA2细胞低,钙粘蛋白低和KRT14pos．比例尺:50 μm。(B) PDAC元数据集中GATA6、FOXA2和E-cadherin mRNA相关表达的散点图。(C)显示肿瘤的比例GATA6在三个PDAC基因拷贝数变异数据集的组合分析中，扩增(蓝色)或基因组丢失(红色)。百分比GATA6与损失无关的损失SMAD4用暗红色表示。

    我们的观察表明GATA6在人PDAC中具有抑制肿瘤的作用，这与我们在小鼠PDAC中的发现一致。18这个概念与的发生是不一致的GATA610%-20%的PDACs，15，16，32这导致了它是PDAC致癌基因的提议。为了解决这个难题，我们进行了重新分析GATA6三个PDAC系列基因拷贝数的变化(CNV，见在线补充表S2):32，33，3413/117(11%)肿瘤显示扩增，但损失率相似(17/117,14.5%)(图5C和see。在线补充表S2)。GATA6是在18q11, 28.7 MbSMAD4，在PDAC中经常被删除。GATA6而且SMAD4在11/17例中同时丢失，在6/17例中单独丢失，这表明独立的选择性压力对GATA6在部分pdac (图5C和see。在线补充表S2)。GATA6澳大利亚胰腺癌倡议最近报告的PDAC子集(9/100)证实了损失。35

    低GATA6标识具有类基特征的PDAC子类型

    为了深入了解GATA6在PDACs中的功能，我们比较了PDAC元数据集中属于GATA6表达最高和最低四分位数的肿瘤的转录组(GATA6高和GATA6低，每组n=27)，鉴定出GATA6基因上调或下调的基因有495个低与GATA6高FDR<0.01(见在线补充数据设置S2)。在基底样(base -l)乳腺癌中诱导和在发光样乳腺癌中抑制的基因集在GATA6上调的基因中富集低肿瘤(见在线补充表S3和图S6)。

    最近，一种膀胱癌的basl亚型被描述为与相应的乳腺癌亚型具有相似性，这表明起源不同的低分化癌可能收敛到相似的分子表型。根据膀胱癌定义的47个基因特征(BASE47)对元数据集样本进行分层聚类36发现了PDAC的一个BAS-L亚群(见在线补充数字S7A)。

    基底角蛋白在pdac的一个子集中表达，但在正常胰腺中检测不到。12，37使用前面描述的tma，在GATA6中发现了KRT14负的7/16个PDACs区域，而在GATA6中不存在高区域(图5A)。一致地，在basl肿瘤中GATA6显著降低(p<0.001，见在线补充数字S7B)和gata6沉默的PaTu8988S细胞外表达基底角蛋白KRT5和KRT14 (图1B).此外，ChIP-Seq数据显示GATA6与多个已发表的碱基相关签名的基因启动子结合，36，38，39其中一些也在RNA-Seq实验中被调节(见在线补充数据S3)。综上所述，这些数据表明GATA6参与了BAS-L转录程序的调控，而类碱基PDACs是GATA6低．

    在PDAC患者中，GATA6的低表达预示着较差的生存期和对辅助化疗的明显反应

    患有basl型膀胱肿瘤和乳腺肿瘤的患者预后较差，对治疗有明显的反应。36，38，39为了评估GATA6缺失对患者生存的影响，我们分析了58例已建立异种移植的患者，并获得了转录组数据。根据GATA6表达值分为三组(< 500,500 - 1000，>1000)。在这个探索性系列中，GATA6水平与所考虑的临床-病理变量没有显著相关性(见在线补充表S4)。GATA6患者的生存媒介和GATA6高肿瘤相似(分别为12.7个月和13.1个月)，且明显长于GATA6低肿瘤(4.6个月，p=0.003) (图6A、B)。在单因素分析中，GATA6低表达与死亡风险显著增加相关(HR=5.39, 95% CI 2.3 ~ 12.9;p<0.001)，在经年龄和性别调整的模型中(HR=3.77, 95% CI 1.74 ~ 8.17;p = 0.001) (表1)．

    查看该表:
    表1

    3个月、6个月、12个月和24个月生存的单因素分析结果(法国系列)

    GATA6 expression is associated with outcome and with response to adjuvant therapy. (A) Kaplan–Meier plot of the overall survival for patients included in the French series. (B) Median survival of patients included in the French series, classified according to GATA6 level. The value of p=0.003 calculated with Mann–Whitney U test. (C) Kaplan–Meier plot of the overall survival for patients included in the 5-fluorouracil (5-FU)/leucovorin arm of the ESPAC-3 trial. (D) Kaplan–Meier plot of the overall survival for patients included in the gemcitabine arm of the ESPAC-3 trial.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    GATA6表达与预后和辅助治疗反应相关。(A)法国系列患者的总生存期Kaplan-Meier图。(B)法国系列患者的中位生存期，根据GATA6级别分类。用Mann-Whitney U检验计算p=0.003。(C) ESPAC-3试验中5-氟尿嘧啶(5-FU)/亚叶酸钙组患者的总生存期Kaplan-Meier图。(D) ESPAC-3试验中吉西他滨组患者的总生存期Kaplan-Meier图。

    为了进一步探讨GATA6表达与患者预后之间的关系及其预测价值，我们分析了ESPAC-3试验中患者的tma。7使用基于反应细胞比例和染色强度的组织评分，37/313(11.8%)肿瘤中GATA6表达较低/无法检测到。GATA6水平与肿瘤分级相关(p=0.005)，但与其他临床-病理变量无关(见在线补充表S5)。两个治疗组在患者人口统计学方面都很平衡(见在线补充表S6)。在5-FU/亚叶酸叶酸组，GATA6患者低或GATA6媒介肿瘤的存活率明显低于GATA6患者高肿瘤(p值分别为0.018和0.039)(图6C)。相比之下，在吉西他滨组，GATA6表达与生存无关(图6D).在单因素分析中，GATA6水平与预后呈边际显著相关，仅在接受5-FU/亚叶酸的患者中(p=0.057) (表2,请参阅在线补充表S7)。多变量分析没有揭示额外的相关性(见在线补充表S8)。此外，KRT14的表达并不能预测结果(见在线补充表S7)。这些结果支持了GATA6患者的观点低/中与吉西他滨相比，5-FU/亚叶酸钙治疗肿瘤的益处可能更少。

    查看该表:
    表2

    单因素生存分析结果(ESPAC-3)

    我们处理了由患者来源的异种移植建立的11个原代细胞系(TKCC细胞，见在线补充数字S8A)35随着5-FU、吉西他滨或紫杉醇剂量的增加，并监测药物的细胞毒性作用。GATA6低细胞对1 μM 5-FU的敏感性显著降低(r=−0.61,p=0.046)，对所有其他5-FU浓度的敏感性均有降低趋势(图7看看在线补充数字S8B)，而与吉西他滨或紫杉醇没有观察到相关性，无论使用的浓度如何(图7看看在线补充数字S8C, D)。这些发现支持了在ESPAC-3试验患者中观察到的GATA6水平与5-FU反应的选择性关联。

    GATA6 expression negatively correlates with sensitivity to 5-fluorouracil (5-FU) in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) cells. Scatter plots showing cell survival upon treatment with the indicated doses of 5-FU (top), gemcitabine (middle) and paclitaxel (bottom), plotted against GATA6 protein level. Red square indicates significant correlation. Survival was normalised against DMSO-treated cells. Data are presented as the average value of at least three independent experiments.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    GATA6表达与胰腺导管腺癌(PDAC)细胞对5-氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性呈负相关。散点图显示了用指定剂量的5-FU(上)、吉西他滨(中)和紫杉醇(下)治疗后的细胞存活率，并绘制了与GATA6蛋白水平的关系。红色方框表示相关性显著。对dmso处理的细胞进行正常生存。数据以至少三个独立实验的平均值表示。

    为了研究GATA6是否在对5-FU的反应中具有致病作用，我们在PaTu8988S细胞中敲除了它，以及5-FU敏感的GATA6高TKCC18和TKCC19细胞，并在L3.6pl细胞和5-FU抗性GATA6细胞中过表达低、TKCC9、TKCC15和TKCC26细胞。然而，我们没有观察到这些细胞对5-FU、吉西他滨或紫杉醇敏感性的显著变化在线补充数字S9,S10和数据未显示)。

    讨论

    对PDAC生物学和肿瘤分类的更好理解应该利用现有的治疗方法。在这里，我们为这些方向提供了重要的证据。我们扩展了先前的数据，表明GATA6是肿瘤分化的标志，提供了强有力的证据，证明它通过新的机制调节上皮表型，并显示其作为患者分层标志的潜力。

    GATA6在PDAC中具有促上皮和抗emt功能，它通过一种独特的机制实现这一功能，既涉及上皮基因的激活，也涉及间充质基因的抑制。此外，GATA6的作用是双重的:直接通过调节上皮细胞和间充质基因，间接通过调节上皮细胞前和间充质前转录因子。据我们所知，GATA6是第一个具有这种特性的EMT调节器。GATA6阻断肺腺癌细胞的去分化和转移性的获得，40但其潜在机制尚未阐明。在这里，我们表明PDAC细胞也是如此，其中GATA6下调增加了肿瘤细胞的传播。一致地，在ESPAC-3患者队列中，GATA6低表达与中等/较差的肿瘤分级相关。虽然与淋巴结状态或局部浸润无显著相关性，但GATA6组织评分在两项参数均呈阳性的患者中均有较低的趋势。这些观察结果，以及我们在体外和体内的数据，进一步支持GATA6在抑制肿瘤扩散方面发挥作用，尽管其他因素似乎也参与其中。

    值得注意的是，如之前报道的那样，gata6沉默的PDAC细胞增殖降低(未显示)，15 - 17日这与观察到的EMT与较慢的增殖和肿瘤生长减慢相一致。41在GATA6过表达的L3.6pl细胞中，增殖也同样降低(未显示)，这表明GATA6具有更复杂的功能。不同的遗传(即，SMAD4状态，见在线补充表S9)和表观遗传景观可能解释了与先前报道的差异。17

    GATA6也抑制一个类似于在乳房和膀胱中描述的基底样转录程序36，38，42，43最近，在PDAC。23在PDAC中，规范分化的丧失先前与低GATA6相关12还有肺癌。40此外，在最近描述的经典PDAC亚型中，gata6过表达签名得到了丰富。23然而，机械的解释是完全缺失的。我们的工作支持GATA6在抑制PDAC中的basl计划中的因果作用。有趣的是，具有basl表型的细胞群存在于正常的多层上皮中，如乳腺、膀胱和肺，但在单层胰腺上皮中不存在。因此，碱基相关程序的出现并不一定反映了肿瘤的细胞来源，但它可能代表了多种肿瘤上皮细胞类型的一种常见的“低能”状态。另外，PDAC中的BAS-L表型可能代表了向异位分化程序的过渡，这可以被定义为“上皮到上皮的转变”(ET2)．等2不同于世系保存的异位分化程序的激活，例如在PDAC前体中观察到的胃表型，44在小鼠中也被GATA6抑制。18在胰腺，由ET定义的基础程序2概念并不代表一种发展特征。而等2在肿瘤进展过程中可能预示着一个全面的EMT，这些过程在肺腺癌中似乎是独立的，其中GATA6低basl肿瘤缺乏EMT特征。40需要更多的调查来评估来自ET的假定序列2以及GATA和FOXA蛋白家族更普遍的作用。

    总之，这些发现有助于解释由支持GATA6在PDAC中作为致癌基因的观察产生的难题;然而，gata6低的肿瘤患者预后更差。

    序列调控的EMT和MET是肿瘤有效扩散所必需的。45，46GATA6调节这两个过程;因此，我们假设遗传环境和微环境可能会选择GATA6表达的损失和获得。多项证据指向环境依赖的功能:GATA6在体内有利于EMT黑腹果蝇体外MDCK细胞47并且是促肿瘤活性所必需的Apc在小鼠结肠中丢失。48不同的输出可能取决于其他转录调节因子和共激活因子/抑制因子的水平/定位以及表观遗传格局。我们建议GATA6属于一类新型癌症基因，其作用取决于细胞/基因组环境，可致癌或抑瘤。

    GATA6缺失导致PDAC细胞和小鼠PDAC中的EGFR通路激活，18这表明GATA6在患者的治疗反应中具有预测性或因果性。为了探索这一概念，我们分析了ESPAC-3患者的样本，ESPAC-3是一项比较5-FU/亚叶酸钙和吉西他滨的随机辅助试验。7ESPAC-3试验表明，两种治疗对总生存期的影响相当。我们发现GATA6患者低肿瘤不能从辅助治疗的5-FU/亚叶酸中获益，并且与类似治疗的GATA6患者相比，其生存率显著降低高肿瘤。相比之下，GATA6的表达与吉西他滨的反应无关。总之，这些结果指向GATA6作为患者分层的预测标记。考虑到FOLFIRINOX在PDAC患者中的抗肿瘤活性，确定GATA6是否也预测对这种药物组合的反应将是重要的。此外，联合分析hENT和GATA6表达可能显示出增强的预测能力。

    GATA6中观察到对5-FU/亚叶酸缺乏反应的机制低肿瘤仍有待阐明。在各种实体肿瘤中，包括PDAC，体外5- fu耐药细胞中EMT特征的出现已被报道。49，50，51但缺乏因果关系。TKCC细胞中GATA6水平的调节并没有改变其对化疗药物的敏感性，这表明GATA6是参与药物反应的分子表型的一部分，但不是其主要驱动因素。

    总之，我们在这里提供了一个全面的机制分析GATA6在PDAC细胞中的功能，其中它抑制EMT，碱基性和传播，支持其作为PDAC肿瘤抑制因子的作用，进一步加强了我们和其他人观察到的基因组损失，并通过高甲基化GATA6推广者最近描述。52最后，我们提出GATA6作为一个有价值的标记来指导患者的治疗。

    方法

    细胞系

    HEK293T和PDAC细胞在添加10% FBS和NaPyr的DMEM中培养，在标准条件下(37°C, 20% O2， 5% co2)，除L3.6pl细胞外，其余细胞用10%血清RPMI培养。所使用细胞的突变谱可在在线补充表S9。我们从ATCC获得HEK293T细胞，从C. Iacobuzio-Donahue (Memorial Sloan Kettering, New York, USA)获得A13B细胞，从C. Heeschen (CNIO, Madrid, Spain)获得L3.6pl细胞，从M. Buchholz (University of Marburg, Germany)获得PaTu8988 S。按上述方法建立TKCC原代细胞系。35所有剩余的PDAC细胞以前都在实验室中获得。

    细胞毒性检测

    细胞以低密度(5000个/孔)播种于96孔板中，用DMSO或增加浓度的5-FU (1 nM-100 μM, SIGMA-Aldrich)、吉西他碱(1 nM-100 μM, SIGMA-Aldrich)或紫杉醇(100 pM-10 μM, SIGMA-Aldrich)处理。72小时后，用甲醇固定细胞，用结晶紫染色。用1% SDS提取结晶紫，在595 nm处测定吸光度。

    质粒，转染和感染

    表达非靶向和gata6靶向shRNA的慢病毒载体购买自SIGMA-Aldrich (MISSION shRNA)。含有人类野生型和突变的GATA6 cDNA的pcDNA3质粒之前已经有过描述。17将GATA6 cDNA克隆到表达gfp的FG12慢病毒载体中，在PDAC细胞中过表达。含有Foxa1和Foxa2启动子的记者质粒是RJ Matusik博士(Vanderbilt University, Tennessee, USA)的慷慨礼物。含有e -钙粘蛋白启动子的记者质粒是a Nieto博士(西班牙阿利坎特神经科学研究所)的慷慨礼物。病毒包装HEK293T细胞用标准磷酸钙方案转染，转染48小时后收集上清，过滤后用于感染PDAC细胞。通过嘌呤霉素或facs分选选择成功感染的细胞。

    免疫组化和免疫荧光

    切片与一抗孵育(见在线补充表S10)。酶标二抗来自DAKO。以DAB+(3,3-四盐酸二氨基联苯胺+)为显色剂，用苏木精反染细胞核。免疫荧光(IF)染色采用alexa偶联Invitrogen二抗，核用4 ' -6-二氨基氨基-2-苯基吲哚(DAPI)反染色。图像使用LEICA应用程序套件进行伪彩色处理。

    基因表达分析

    根据制造商的说明使用Trizol (SIGMA-Aldrich)从细胞中提取总RNA，用DNase I (Ambion DNA-free kit, Invitrogen)处理，并使用TaqMan逆转录试剂(Applied Biosystems)转化为cDNA。定量PCR使用SYBR-green mastermix (Applied Biosystems和Promega)，在Prism 7900 HT仪器(Applied Biosystems)中进行。引物使用Primer3Plus设计，反应重复三次。所有量化均归一化为内源性HPRT，使用标准ΔΔCt方法。引物序列在在线补充表S11系列。

    蛋白质分析

    在Laemmli缓冲液中制备蛋白提取物并进行超声处理。SDS-PAGE-western印迹采用标准方案进行。53一抗信息在在线补充表S11系列。

    基质侵润试验

    transwell (BD Falcon, 0.8 μm)表面涂有BD Matrigel。细胞(105)在无血清DMEM中播种到Matrigel上，并在添加10% FBS的情况下向DMEM入侵。入侵细胞24小时(L3.6pl)或72小时(PaTu8988S)后用PFA固定，用DAPI染色细胞核，荧光显微镜计数。入侵细胞/场的数量由在一个单独的孔中平行播种的细胞数量归一化。

    荧光素酶检测

    HEK293T细胞转染E-cadherin, Foxa1或Foxa2报告质粒，以及gfp表达质粒。同时引入空pcDNA3 (Invitrogen)，或含有野生型或突变型GATA6 cDNA的pcDNA3。使用商业荧光素溶液(Promega)作为底物，用光度计测量荧光素酶活性。通过western blotting检测GFP水平，将转染效率归一化。

    芯片

    细胞在室温下与1%甲醛交联15分钟，在裂解缓冲液(2×10)中收获7(剪切时间30分钟，占空比20%，强度10,200次/次，每周期30秒)。按照标准方案，使用抗gata6 R&D AF1700抗体进行ChIP。54使用独立的染色质免疫沉淀物进行测序和ChIP-Seq验证，使用qPCR(引物列于在线补充表S7)。

    体内传播试验

    异种移植按所述进行。19简单地说,5×104将细胞重悬于50 μL PBS中，注射到胸腺癌脾脏中Foxn1ν老鼠;10周后，将肝脏外植，在Trizol中均质，提取RNA。人类产生HPRT引物被用来量化人类细胞的存在。小鼠从查尔斯河实验室购买，并在标准条件下饲养在CNIO。所有实验均经卡洛斯三世Salud Carlos III研究所(西班牙马德里)动物伦理委员会批准，并按照国际医学科学组织理事会(CIOMS)制定的《涉及动物的生物医学研究国际指导原则》中所述的《动物护理和使用道德行为准则》进行。

    微阵列数据和GSEA分析

    PDAC元数据集的层次聚类使用geneppattern (http://www.genepattern.broadinstitute.org)．数据集以行为中心和以列为中心，行规范化和列规范化。差异基因表达和GSEA使用来自同一在线套件的相应模块进行。

    患者和样本

    详细资料载于在线补充资料．

    统计分析

    数据以均数±标准差表示。采用双尾Student's t检验或单尾Fisher's检验进行统计学分析，以p<0.05为显著性。所有统计分析均使用VassarStat.net和r进行。用于临床数据分析的统计检验的详细信息如下在线补充资料．

    致谢

    我们感谢文中提到的研究者提供试剂。E.巴特列，A.卡诺，O. Domínguez, M.伊达尔戈，R. Martínez, D.里科，V.塞巴斯蒂安，M.塞拉诺和E.瓦格纳的宝贵贡献;N. del Pozo提供技术支持;CNIO核心设施的持续支持;德尔马医院(巴塞罗那)病学系和澳大利亚胰腺癌基因组计划(APGI;http://www.pancreaticcancer.net.au)．John Neoptolemos教授是欧文和艾伦·埃文斯外科主席，也是美国国立卫生研究院(NIHR)的高级研究员。

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    脚注

    • 贡献者PM:完成大部分实验，设计实验，分析数据，撰写初稿，共同领导工作;EC-dSP、TC、NM:分析数据;BSJr:进行实验，分析数据;ND, WG和EC:生成和分析数据;LR:进行实验和数据分析;PG:生成的数据;MB:负责临床试验及相关信息;MP、AVB:生成试剂，分析数据;JI:生成和分析数据;JN:负责临床试验，生成研究材料及相关信息; FXR: designed the study, analysed data, was responsible for the overall conduct of the study, wrote the manuscript and co-led the work. All authors discussed data, read the manuscript, made comments and agreed with its content.

    • 资金这项工作得到了来自Ministerio de Economía y Competitividad (Madrid, Spain)的SAF2007-60860, SAF2011-29530和ONCOBIO Consolider的部分资助，来自Instituto de Salud Carlos III的RTICC，来自欧盟第七框架计划的256974和289737的资助，以及来自奥地利科学基金(FWF)的P27361-B23的资助。AB获得了来自威康信托基金会、英国癌症研究中心、医学研究委员会(MRC)、工程和物理科学研究委员会(EPSRC)、英国胰腺癌、首席科学家办公室(苏格兰政府)和胰腺癌行动网络(美国)的支持。英国癌症研究中心利物浦临床试验单位，ESPAC试验，以及ESPAC组织的收集、储存和分析都由英国癌症研究中心资助。总理获得了西班牙科学与创新部的Juan de la Cierva资助。BSJr获得了西班牙科学与创新部颁发的Ramón y Cajal优秀奖，以及纽约癌症研究所颁发的临床和实验室整合计划(CLIP)赠款。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 伦理批准来自法国系列的患者被纳入Paoli-Calmettes研究所临床试验编号为2011-A01439-32。转译ESPAC-T研究从利物浦(成人)研究伦理委员会获得了关于化疗肿瘤标志物表征的伦理委员会批准(07/H1005/87)。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。

    • 数据共享声明我们愿意分享与报告的任何工作相关的数据。