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摘要
客观的家族性腺瘤性息肉病(FAP)的特点是在结肠和直肠的不同进化阶段发展数百至数千个腺瘤,如果不及时治疗,将不可避免地发展为腺癌。在这里,我们研究了从癌前腺瘤到癌的遗传改变和转录组转变。
设计对6例FAP患者和1例FAP患者匹配的相邻正常组织、不同分期的多区域腺瘤和癌进行全外显子组测序、全基因组测序和单细胞RNA测序MUTYH-相关息肉病(n=56外显子组,n=56基因组和n=8,757单细胞)。全面研究了腺癌癌变过程中的基因组改变(包括拷贝数改变和体细胞突变)、克隆结构和转录组动力学。
结果基因组进化分析表明,来自同一FAP患者的相邻病变可能来自同一种癌症启动细胞。此外,三羧酸循环途径在腺瘤中被强烈抑制,在癌中则被轻微缓解。与散发性结直肠癌患者的正常结肠上皮细胞相比,FAP患者的“正常”结肠上皮细胞已经显示出代谢重编程。
结论先前报道的现场癌变模型中描述的过程也发生在FAP患者中,并可能导致FAP患者相邻病变的形成。在癌前腺瘤阶段,碳水化合物代谢的重编程已经发生。我们的研究提供了癌症发生起始和发展过程中基因组和转录组景观的准确图像,特别是在从腺瘤到癌的转变过程中。
- 结肠致癌作用
- 结直肠腺瘤
- 家族性腺瘤性息肉病
- MUTYH-相关息肉病(MAP)
- 场癌化
- 单细胞转录组分析
- 肿瘤的异质性
这是一篇开放获取的文章,根据创作共用署名非商业(CC BY-NC 4.0)许可证发布,该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此基础上进行构建,并以不同的条款许可其衍生作品,前提是正确引用原始作品,给予适当的荣誉,任何更改都已注明,并且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/.
数据来自Altmetric.com
本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
家族性腺瘤性息肉病(FAP)是一种常染色体显性综合征,主要由遗传突变引起APC(腺瘤性大肠息肉病)。
FAP患者会在结肠和直肠形成成百上千个腺瘤,如果不及时治疗,将不可避免地发展为腺癌。
FAP的早期预防具有挑战性,经典FAP的护理标准是预防性结肠切除术或直肠结肠切除术。
新的发现是什么?
在FAP患者中,空间分离的肿瘤可能起源于相同的癌症引物细胞,这表明致病性事件可能发生在临床可识别的腺瘤出现之前很久,即使在宏观上正常的上皮细胞中也是如此。
通过比较FAP患者正常结肠组织与散发性结直肠癌患者正常结肠组织上皮细胞的转录组特征,我们发现FAP患者的正常上皮细胞已经表现出增强的代谢过程和增殖活性。
碳水化合物代谢的重编程已经在癌前腺瘤中发生。
本研究的意义
在可预见的未来,它会对临床实践产生怎样的影响?
尽管FAP患者的邻近正常上皮细胞没有累积潜在的驱动突变和拷贝数改变(cna),但在转录组水平上,这些组织已经为癌变做好了准备,这表明有必要针对“正常”粘膜进行FAP患者的预防、诊断和治疗。
在FAP患者病变癌变的早期阶段,碳水化合物代谢的重编程已经发生,这表明碳水化合物代谢可能是早期预防腺瘤的一个靶点。
简介
家族性腺瘤性息肉病(FAP)是一种常染色体显性综合征,主要由大肠性腺瘤性息肉病(APC)。1 2FAP患者在结肠和直肠会产生成百上千的腺瘤,如果不及时治疗,这些腺瘤将不可避免地发展为腺癌。3 - 5结肠切除术是FAP的主要预防性治疗方法。3 4 6APC是一种肿瘤抑制基因,调节细胞粘附和迁移,维持基因组稳定和凋亡。最重要的作用APC基因通过介导蛋白降解负调控WNT信号通路CTNNB1它是WNT信号通路的关键组成部分。结肠细胞中WNT信号通路活性增强可导致上皮细胞增生。7号到9号
大约85%的非fap散发性结直肠癌(CRCs)有体细胞转移APC基因突变,APC在CRC的腺瘤-癌序列中显示为看门人基因。7 10与散发性CRCs不同,FAP中只能收集到一个病变,处于多个进化阶段的病变使其成为追踪结直肠癌发生的理想自然模型。
已有研究应用批量全外显子组测序(WES)和全基因组测序(WGS)方法研究腺瘤与癌的基因组改变差异,旨在揭示CRC进展过程中的关键事件。11日12但是,从一个大队列中获得的病变之间的差异可能会被个体间的差异所混淆,例如遗传背景、饮食习惯和肠道菌群。在本研究中,我们同时收集了同一患者的相邻正常组织、不同分期的腺瘤和癌组织。采用多区域抽样策略研究肿瘤内异质性。每个病变同时获得三组数据,包括WES、WGS和单细胞RNA-seq数据。对同一FAP患者不同进化阶段病变的基因组景观和克隆结构进行了全面研究。此外,单细胞RNA-seq数据被用于研究来自同一FAP患者的多区域采样病变的转录组异质性,并探索结直肠腺瘤起始和癌变过程中肿瘤细胞的转录组动态。
材料与方法
肿瘤的收集和准备
在手术切除标本后立即进行组织取样。每例患者均采集正常黏膜、小腺瘤、中腺瘤、大腺瘤和癌的标本。对于大多数直径大于10毫米的腺癌,有2 - 5个区域被取样。每个区域分为两个部分,一部分用于血氧黄素和伊红(H&E)和免疫组化染色,另一部分用于单细胞收集和基因组DNA提取。
Whole-exome测序
提取的基因组DNA (200 ng)经超声破碎成150-200 bp的片段。在末端修复后,将预先设计的带有额外3 bp条形码的代码适配器连接到片段DNA上。然后,用NEB指数引物、NEB通用引物和2× KAPA HiFi HotStart ReadyMix (KAPA Biosystems, cat。KK8054)。接下来,使用SureSelectXT Human All Exon v5和SureSelectXT Human All Exon v6套件(Agilent Technologies, cat)将具有不同条形码适配器的库合并用于全外显子组序列捕获。g7530 - 9000)。
桑格测序
所有APC种系突变位点和体细胞突变位点,以及种系突变位点中的MUTYH,经Sanger测序验证。用于桑格测序的引物概述在在线补充表3.
数据分析
有关详情,请参阅在线补充材料和方法.
结果
队列概况
本研究的队列包括6例FAP患者,1例FAP患者MUTYH-相关息肉病(MAP)和2例散发性结直肠癌。共采集56份样本:6份外周血,12份邻近正常组织,23份低级别腺瘤(LGIN,包括I级和II级),5份高级别腺瘤(HGIN, III级),10份癌(在线补充表1而且在线补充图1A)。最小的腺瘤直径为2mm,最大的癌直径为50mm。对于大多数直径大于10mm的病变,分别取样2 - 5个区域(图1一个)。从56个样本中共采集了86个区域。对每个区域的测序数据进行汇总(在线补充表2)。
其中4例FAP患者有家族遗传特征(在线补充图1B-G)。遗传种系突变位点APC在FAP1 (p.E1309fs)、FAP2 (p.E1397fs)、FAP3 (p.W699*)和FAP4 (C .834+1G>C,剪接供体变体)(在线补充图2A而且在线补充表3)。FAP5的临床表型被怀疑是由基因合子后突变引起的APC因为没有发现家族史,而且三人串连APCpv1377fs、py1376fs和pe1374_h1375delinsd三个突变位点被FAP5的9个区域(共13个区域)共享。在线补充图2A,B而且在线补充表3)。MAP1息肉疑似MAP。发现两个种系停止增益突变(p.R19*和p.Q267*)MUTYH(在线补充图2CMAP1的所有病变。与之前的研究结果一致,4 6 19-23MAP1的所有病变均发生体细胞突变喀斯特与FAP患者的病变相比,C到a突变的比例更高(图1 b而且在线补充图2D)。虽然FAPs和MAPs都与多发性结直肠腺瘤相关,但其分子发病机制和体细胞遗传改变是不同的。20.所有生殖系和合子后突变APC以及FAP患者的种系突变MUTYH通过Sanger测序(在线补充表3)。
队列中的基因组改变景观
外显子体的平均深度为64个reads,约85%的覆盖区域被超过30个高质量reads映射(在线补充表3)。在67个具有WES数据的样本中,总共发现了8327个体细胞突变。经过严格筛选,共鉴定出4220个潜在致病突变,包括3570个单核苷酸变异和650个吲哚(在线补充表4而且在线补充材料和方法)。据报道,CRC中有许多基因反复突变,12并总结了我们队列中这些潜在驱动基因的突变情况(在线补充表5而且图1 b)。
与之前的报道一致APC是人类结直肠上皮细胞中的守门人基因,APC具有最高的突变频率,包括体细胞突变、拷贝中性异质性丧失(cnLOH)和拷贝数改变(cna),通过使用FAP患者的所有病变推断(突变=36,全部=52;突变频率=69%)(图1 b)。22先前报道的腺瘤-癌转移模型的特点是在APC,喀斯特而且TP53。22对于FAP患者APC生殖系突变,潜在的致病基因组改变喀斯特而且TP53分别只在7个样本(11%)和2个样本(3%)中发现(图1 b),这可能与所使用病灶的病理分级不同有关。最常突变的信号通路是WNT信号通路(在线补充图3A)。12然后我们分析了多重病变的突变负担(MBs)(每百万碱基突变数)。结果显示,与邻近正常组织相比,低级别腺瘤已经显示出明显更多的体细胞突变。癌的体细胞mb相对较重,但由于样本量有限,与低级别腺瘤相比,无统计学意义。有趣的是,高级别腺瘤的MB高于癌(不显著,p= 0.075) (在线补充图3B)。11 12 24先前报道过在CRCs中复发的CNAs(在染色体7、8、13和20上的拷贝数增加;在我们的队列中也发现了染色体5q, 15q和18q的拷贝数损失(在线补充图4)。
同一FAP患者不同进化阶段病变的克隆结构
一般认为不同的病变来源于不同的细胞,FAP3、FAP4、FAP5和MAP1 (在线补充图5-8)。从体细胞突变谱推断的系统发育分析表明,FAP1中空间分离的病变共有172个体细胞突变,包括FAP1中潜在的致病突变玲娜(p.R844H),SMAD4(p.C115W),FBXW7(p.S668fs和p.G687V)和ASXL1(p.P808fs) (图2 a, B)。FAP1中病变共享突变的突变频率相对高于非共享突变的突变频率,表明这些与FAP1在空间上分离的病变是单克隆的,起源于同一细胞(在线补充图9A)。在FAP2中也发现了同样的模式(在线补充图10和11)。FAP2中空间分离病变共有136个体细胞突变,包括FAP2中潜在的致病突变SOX9(p.Q312fs)和ZFHX3(p.P2116L)。FAP2中病变共享突变的突变频率相对低于FAP1,提示FAP2中病变的多克隆起源(在线补充图10C)。由于这两例患者之前曾因严重息肉病行全结肠切除术,这两例患者的病变均来自第二次直肠癌手术切除的残余直肠。因此,这些病变在空间上彼此接近,处于癌变晚期(图2 c而且在线补充图10D)。结合前面提到的所有信息,我们认为先前报道的现场癌变模型中描述的过程也发生在这两名患者身上,并导致了物理分离的病变。25 - 28在这个模型中,癌前细胞积累潜在的致病突变,赋予它增殖优势,然后它的子细胞通过隐窝裂变扩展到邻近区域。接下来,随着其他致病事件的积累,形成空间分离的病变(图2 c而且在线补充图10D)。这一现象强调致病性事件可能在临床上可识别的腺瘤出现之前很久就发生了,即使在宏观正常的上皮细胞中也是如此。
虽然所有来自FAP1的病变都起源于同一细胞,但观察到高度的瘤间和瘤内异质性(图2 b)。APC(p.R1858Q)和FAT4(p.R555Q)在两种腺瘤中共享,而仅在癌中观察到cna。此外,在FAP1的癌组织中发展了两个谱系。SMAD4(p.G386D)仅在Car R3中获得,而PIK3CA(p.*1069fs)为其他三个地区所共有(图2 b)。除了体细胞突变外,Car R3与其他三个区域相比也存在明显的cna位点,且异质性突变缺失(图2 d而且在线补充图9B,C)。29其他来自FAP4和FAP5的多区域病灶的克隆结构分析支持点状进化模型;大多数潜在的驱动突变和复发的cna是克隆的(在线补充图6和7)。30.
FAP患者的转录组分析
为了追踪结直肠腺瘤起始和癌变过程中的转录组动态,从前面描述的6例FAP患者以及2例散发性CRC患者中收集了8757个单细胞。经过严格筛选后,7,583个(86.6%)细胞被留作进一步分析(在线补充材料和方法而且在线补充表6)。利用转录因子的调控网络特征进行无监督聚类,将细胞分为6个簇。根据已知细胞类型标志物的表达模式,我们定义了环境细胞(内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、肥大细胞、T细胞和B细胞)和上皮细胞(在线补充图12而且在线补充表6)。肿瘤中免疫细胞(肥大细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞)和成纤维细胞比例明显高于邻近正常组织和腺瘤,提示肿瘤中免疫浸润增强(在线补充图12E)。然后,我们重点研究了上皮细胞在癌变过程中的转录组动态。
FAP患者正常上皮细胞代谢过程和增殖活性增强
由于FAP患者出生时生殖系突变APC基因,我们推测FAP患者的正常结肠上皮可能表现出不同于散发性CRCs患者的正常结肠上皮的转录组特征。对6例FAP患者邻近正常组织中的707个单个上皮细胞和2例散发CRC标本中邻近正常组织中的152个上皮细胞的转录组进行了分析。这些正常组织与相应的邻近病变不存在潜在的致病突变或cna (图2而且在线补充图5-7、10、11和13)。
分析了这两种类型的相邻“正常”上皮细胞之间的差异表达基因。位于性染色体上的基因被排除,以避免性别偏见。我们发现FAP患者正常结肠上皮中有2569个基因上调(在线补充表7)。FAP上皮中上调最显著的基因为OLFM4,被报道为肠干细胞和CRC细胞亚群的标记物(图3一)。31另一个上调基因,ATF3,据报道是一种癌发生的抑制转录因子,可由缺氧诱导(图3一)。32基因本体分析显示FAP中这些上调基因在代谢过程中富集,包括肽生物合成、核苷酸代谢、氨基酸代谢、脂质代谢和碳水化合物代谢过程(图3 b)。此外,参与细胞周期的基因也得到富集,这表明FAP患者邻近正常上皮细胞的增殖潜能已经增强(图3 b)。通过MKI67免疫组化染色证实FAP患者正常上皮细胞增殖活性增强(图3 c, D)。
同一FAP患者不同进化阶段病变的转录组异质性
由于所有来自FAP1的病变都来自同一个细胞,我们试图研究这些病变的转录组异质性。通过tSNE分析,所有来自FAP1的上皮细胞被分为4个簇。簇1和簇2主要由1号腺瘤的3个区域(Ade1区域1、Ade1区域2和Ade1区域3)和癌的2个区域(Car区域2)的细胞组成。第三簇主要由3号腺瘤(Ade3)和癌的第三区(Car区3)的细胞组成。簇4主要由癌的第1区和第4区(Car region1和Car region4)的细胞组成(图4一)。盎,ANPEP而且FGL1在聚类2中表现出高表达(图4 b)。盎据说能促进新血管的形成。33ANPEP是肠细胞的标记基因,和FGL1在结直肠腺癌中高表达。34-36聚类3中特异性表达的基因在基因本体(GO)术语中富集,如淋巴细胞激活、适应性免疫反应和对细菌的防御反应,这意味着腺瘤3和癌的第三区域可能表现出增强的免疫反应(图4 c)。cd8阳性T细胞的免疫组化染色也显示Car区1较其他三个区域浸润的免疫细胞更多(图4 d)。与其他簇的细胞相比,簇4的细胞表现出明显的转录组特征。在聚类4中特异性表达的基因富集于GO术语WNT信号通路、细胞增殖的负调控、上皮薄片的形态发生和细胞连接组装(图4 e)。这些结果表明,肿瘤内的转录组异质性可能由其空间位置决定,并受到周围微环境的影响。在FAP2 (C1 R1和C1 R2)和FAP3 (A1 R1和C R2)以及没有FAP的患者(CRC1 Car R3和CRC2 Car R2)中也发现了类似的模式(在线补充图14和15而且在线补充表8)。然而,在来自FAP4和FAP5的低级别腺瘤中没有发现空间区域特异性的转录组标记(在线补充图16而且在线补充表8)。
癌症的代谢特征已经在癌前腺瘤中建立起来
Monocle237用于构建可反映正常上皮细胞向癌发展过程中主要转录组变化的癌发生假时间图,且仅使用上皮细胞进行假时间图构建。邻近正常上皮细胞和I级腺瘤细胞主要分布在伪时间轨迹的起点,而癌细胞主要分布在伪时间轨迹的终点(在线补充图17A,B)。这种模式在所有FAP患者中都得到了保留(在线补充图17C)。然后,分析沿伪时间轨迹发生显著变化的基因。对沿伪时间轨迹表现出不同动态模式的四组基因进行了分析(图5一个,在线补充表9)。第一组基因在邻近正常上皮细胞中表达水平升高。在癌变过程中,这些基因首先在伪时间的早期下调,然后在伪时间轨迹的接近终点时上调。基因本体分析显示,这些基因参与了柠檬酸循环(TCA)循环、呼吸电子传递、糖异生、线粒体活性等(图5 b)。这一结果与之前的发现一致,即癌细胞主要使用糖酵解途径而不是TCA途径来产生能量,并产生代谢物生物合成的中间前体,这种现象被称为Warburg效应。38-44有趣的是,大多数参与TCA循环的基因首先从邻近的正常上皮下调到腺瘤,然后从腺瘤略微上调到癌,这表明TCA通路在癌前腺瘤中已经被强烈抑制;虽然这种抑制后来在癌组织中得到缓解,但癌组织中的TCA循环活性仍低于邻近正常上皮组织(图5 c)。组2的基因也在癌发生早期下调,而组3的基因直到癌发生晚期才下调。组2的基因也富集在代谢过程中,而组3的基因富集在离子止血和凋亡信号通路中。第4组的基因在癌变后期上调,并在氧化石墨烯术语骨髓白细胞激活、伤口愈合和细胞对酸性化学物质的反应中富集,表明在癌变过程中有多种适应性反应(在线补充图17D)。
早在低级别腺瘤阶段,EMT程序就上调了
癌和癌前腺瘤之间最显著的区别是癌的侵袭和转移能力。10上皮细胞-间充质转化(Epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)被报道参与多种癌症行为,特别是癌症的侵袭和转移。40 45-49我们希望通过分析癌前腺瘤中emt相关基因沿癌发生伪时间轨迹的表达动态来确定emt相关程序是否在癌前腺瘤中上调。表达水平EPCAM(一种上皮标记基因)在癌变过程中先轻度上调后下调,而VIM(间充质标记基因)逐渐上调(在线补充图18A)。emt相关基因普遍沿伪时间轨迹上调,表明间充质特征在癌发生过程中迅速增强,即使在早期腺瘤中也是如此。表达水平TGFBI在腺瘤癌变过程中逐渐增加(在线补充图18A,B)。据报道,该基因是头颈癌部分EMT的关键调节因子。50通过免疫组化染色,我们发现在腺瘤和癌组织中TGFBI蛋白的丰度也增加(在线补充图18C)。
讨论
FAP患者出生时生殖系突变APC基因和将不可避免地发展成数百个多重癌前腺瘤在结肠直肠。这一特性使FAP成为研究腺瘤-癌转变过程的自然模型。先前对FAP中多分级癌前腺瘤或来自一组散发性CRC患者的不同进化阶段病变的研究报告,癌中的突变和CNA负担高于癌前腺瘤。有趣的是,在我们的队列中,高级别腺瘤的mb甚至比癌重。但由于高级别腺瘤样本量相对有限(n=9),高级别腺瘤与癌的MBs差异无统计学意义,降低了结果的可靠性。此外,Cross等报道晚期腺瘤比癌具有更高的基因内异质性,这意味着由于稳定选择,癌具有更尖锐的适应度峰值。51在我们的队列中,腺瘤和癌之间的瘤内异质性没有显著差异(在线补充图19)。我们怀疑这两项研究之间的不一致可能是由于所研究的队列不同。克罗斯研究的腺瘤和癌等来自散在性结直肠癌患者,而我们研究中纳入的病变来自FAP患者。
几个潜在的驱动基因,包括APC,喀斯特而且TP53,被报道为促进癌变的关键因素。即使遗传了生殖细胞突变APC,第二击在APC基因,包括突变和cnLOH,仍然是FAP患者最常见的复发事件。的突变频率TP53(8%)在我们的队列中相对较低,在已发表的FAP队列中(11%),51而TCGA数据库报告的比例为60%。12然而,由于样本量有限,这一结论被削弱,需要更大的队列来验证这一假设。
通过分析来自同一FAP患者的多个病变,我们发现FAP患者的相邻病变可能来自同一细胞。这一结果推进了先前关于野区癌变的研究结果,表明通过隐窝裂变的野区癌变可以在FAP患者中产生多个空间相邻的肿瘤。52Gausachs等研究人员还报告了FAP患者存在“遗传场效应”的可能性,这是基于发现物理分离的隐窝在FAP中共享热点突变喀斯特。29然而,基于几个突变位点的进化关系推断限制了这一结论的可靠性。我们基于WES的分析进一步证实了FAP患者的野区癌变理论。四名FAP患者生殖系突变APC,在FAP1和FAP2中观察到现场癌变,但在FAP3和FAP4中未观察到。一种可能的解释是FAP3和FAP4的病变彼此相对较远(彼此至少相距5厘米),级别较低。FAP1和FAP2的病变在空间上彼此相对接近,均处于癌变晚期,在第二次手术中从残留的直肠癌中切除,为癌前克隆繁殖留下足够的时间。未来需要更大的样本量来验证这些假设。FAP患者的现场癌变后果比散发性CRC患者更严重,因为FAP患者的每个细胞都通过基因的遗传突变完成了癌变的第一步APC.从临床角度来看,这一观察表明,癌变的发生早于可见息肉病的出现。监测隐窝裂变事件的速率可能有助于防止潜在病变的发生。在未来,定量研究野癌区可能的大小也将有助于CRC的诊断和治疗。研究野区癌变区病变间交叉的正常区域将有助于识别早期腺瘤起始的重要事件。
与非FAP患者的正常黏膜相比,FAP患者的正常黏膜已经表现出增强的代谢过程和增殖活性,这可能是由于FAP中遗传突变的长期影响APC基因。这一结果增加了在诊断和治疗FAP时监测邻近正常黏膜的必要性。代谢重编程被报道为癌症的标志之一,但代谢重编程是发生在癌症发生的早期阶段还是晚期,还没有全面的分析。通过使用scRNA-seq技术,我们排除了非上皮细胞类型(如免疫细胞、间充质细胞和内皮细胞)在肿瘤中的影响,我们发现代谢重编程也发生在腺瘤中,并且TCA通路的活性在腺瘤中甚至低于癌。腺瘤和癌之间的代谢差异意味着代谢的重编程,特别是碳水化合物代谢,可能在肿瘤起始以及从腺瘤到癌的进展中发挥重要作用。
总之,我们提供了FAP患者结直肠癌发生的转录组景观的第一张图片。全面研究了肿瘤发生过程中的转录组动态。此外,我们发现FAP患者也会发生局部癌变。这些发现将促进我们对结直肠癌发病机制的理解。
致谢
这项工作得到了北京基因组学先进创新中心的资助。部分分析在生命科学中心的高性能计算平台上进行。
参考文献
脚注
JL, RW, XZ和WW贡献相同。
贡献者FT、WF和XZ构思了这个项目。JL在XZ、SG、YM、XW、LG和HL的帮助下设计并完成了单细胞RNA-seq、全外显子组测序和全基因组测序实验。XZ负责患者的入组。XZ和WW进行组织取样,H&E和免疫组化染色。RW在JL的帮助下进行了生物信息学分析。HL和LG进行组织病理学复查。JL和FT在所有作者的帮助下完成了手稿。
资金本研究由北京基因组学先进创新中心资助。
相互竞争的利益没有宣布。
患者发表同意书不是必需的。
伦理批准本研究经北京大学第三医院伦理委员会(M2016170)批准,所有患者术前均签署知情同意书。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。