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摘要
目标与UC相关的微生物变化的空间组成的相关性尚不清楚。我们将管腔刷样品、粘膜活检和激光捕获显微解剖与肠道菌群的深度测序相结合，以开发对照和UC中微生物群落的综合空间评估。
设计共有98份样本测序，平均深度为31 642个reads，来自9个个体，4个接受常规结肠镜检查的对照志愿者和5个因医学难治性结肠炎接受外科结肠镜切除的患者。从结肠四个部位提取样本，包括腔内菌群、黏液凝胶层和整个粘膜活检。
结果人际差异约占总差异的一半。令人惊讶的是，在个体内部，不对称特征向量图分析显示，在对照组和UC中，腔内和粘液凝胶菌群之间存在差异，结肠区域之间没有差异。在分类学水平上，在两个队列之间以及管腔和粘膜间室之间的分化是明显的，有一小组分类单元唯一地区分结肠炎中的管腔和黏膜菌群。区域炎症与这种空间分化或细菌多样性的破坏之间没有相关性。
结论我们的研究表明结肠菌群具有保守的空间结构，在显著的人际变异性背景下区分腔内和粘膜菌群。虽然UC志愿者和对照组志愿者之间的结构元素重叠，但两组之间存在差异，无论是在总体分类学组成方面，还是在如何将空间结构归因于不同的分类学方面。
- 结肠细菌
- 炎症性肠病
- 肠道微生物
- 溃疡性结肠炎
这是一篇根据创作共用署名非商业性(CC BY-NC 4.0)许可发布的开放获取文章，该许可允许其他人以非商业性的方式发布、混编、改编、构建本作品，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是原始作品被正确引用且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/
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视频摘要
本研究的意义
关于这个问题，我们已经知道了什么?
UC是一种主要影响远端结肠的空间型疾病，但可向近端扩展累及整个结肠。
UC导致粘膜炎症，粘液凝胶层改变，严重者结肠上皮溃疡。
在克罗恩病和UC中都有微生物区系的变化。
UC与粘膜相关细菌和粘液溶解菌的增加有关。
新的发现是什么?
通过系统采样UC和对照组志愿者结肠腔内和黏膜相关菌群，本研究证明了两个队列中腔内和黏膜菌群之间的空间差异。
虽然这两个队列之间有重叠，但UC中的这种分化与不同的细菌群有关。
在可预见的未来，这将如何影响临床实践?
识别UC中受到空间干扰的细菌群的能力可能会影响未来使用微生物调节治疗该疾病。
简介
虽然大量的研究调查了饮食与癌症的关系，1，2疾病,3.，4时间改变5和宿主因素6，7就肠道菌群而言，由于无法直接取样，大肠空间生态的详细情况一直难以阐明。最近的研究发现结肠内粘膜部位之间存在明显的异质性，粪便样本和粘膜活检之间存在差异。8 - 10与整个胃肠道纵轴相比，结肠内的差异相对均匀，但存在生理差异，特别是结肠近端作为饲料多糖的生物反应器和发酵罐的功能相关的腔内变化，在pH值、含水量、粪便一致性和短链脂肪酸方面有相应的纵向梯度。11，12从生理学上讲，腔内环境也不同于粘膜表面的环境，粘膜表面由粘液凝胶层排列，粘液凝胶层由无菌的内层和松散的粘液外层组成，外层浓密地定植着微生物群。13，14在微生物学上，粪便样本提供了微生物生态的未选择的代表，不适合空间生态分析。14，15最后，结肠常见病的空间分布也很明显，包括结直肠癌、UC和克罗恩病的分布。
我们之前开发了一种技术，使用受保护的标本刷检结合粘膜活检对管腔相关菌群进行采样，并使用T-RFLP分子指纹技术证明了它与黏膜菌群的组成不同。16在目前的研究中，我们在接受常规结肠镜检查的对照组志愿者和接受结肠手术切除的UC患者中，将受保护标本刷涂与黏膜活检和激光捕获显微解剖(LCM)相结合，对结肠四个层面的微生物群进行采样和深度测序，使用16S rRNA标记基因(图1)．我们研究的目的是确定结肠生态在个体内单一时间点的多个位点上是如何变化的，以及这种空间结构在个体间是否保守。其次，我们希望确定UC组和对照组的结肠之间是否存在微生物群的空间结构、人际变异程度或空间变异模式的差异。
潜在空间梯度示意图:(A)横断面梯度和(B)纵向梯度。(C)在结肠的四个层面(盲肠、横结肠、降结肠和直肠)取样。在每个水平提取三个采样层(腔腔、全粘膜活检和激光捕获显微解剖粘液凝胶层)。(D)各抽样方法的代表性图片的样本横断面组织示意图。
材料和方法
病人招聘
获得了圣文森特大学医院伦理和医学研究委员会的伦理批准。招募了4名接受常规结肠镜检查的对照组志愿者。所有患者在手术前都给予了知情的书面同意，年龄均超过18岁，且在前3个月内未服用抗生素。对照组没有活跃的病理证据(表1)．有炎症性肠病(IBD)、结肠癌、结肠切除史或在过去6周内住院、活动性出血或急诊内镜检查史的患者被排除在外。肠道制剂采用聚乙二醇基。UC患者因药物难治性UC或急性重度UC而接受全结肠切除术，对静脉氢化可的松和生物治疗无反应。所有接受结肠切除术的患者在麻醉诱导时均接受单剂量静脉抗生素治疗，但在前3个月未接受抗生素治疗。
样品收集
抽样水平为盲肠、横结肠、降结肠和直肠(图1)．在每个水平上分别获得三个菌群样本:一个管腔刷样本，一个完整的粘膜活检和一个激光捕获的粘液凝胶层样本。这为每个个体提供了12个样本。
在对照组志愿者中，如前所述，使用微生物保护标本刷(Hobbs Medical Inc, Stafford Springs, Connecticut, Springs)对腔内菌群进行采样。16使用桡骨颌三活检钳(Boston Scientific, Natick, Massachusetts, USA)进行粘膜活检。一个活检组织被放置在无菌、无核酸酶的微离心管中，并在干冰上冷冻，而另一个组织被悬浮在Tissue-Tek Cryomolds(樱Fintek USA, Inc, USA)中的Tissue-Tek O.C.T.化合物中，并快速冷冻LCM。
第三个粘膜样本用福尔马林固定和石蜡包埋，用于炎症的组织病理学评估。8微米的切片被安装在普通玻片上，用梅尔氏苏木素染色，然后用Leica Autostainer XL (Leica Microsystems, Ashbourne, Ireland)进行伊红反染色(Sigma Aldrich, Dublin, Ireland)。病理学家根据先前描述的系统对所有切片进行评分。17
在接受结肠切除术的患者中，结肠沿着反肠系膜边界切开，并在切除后立即取样。无菌、无核酸酶细胞学刷用于腔内菌群取样，同时使用无菌镊子和手术剪刀进行整个粘膜活检。在每个水平上收集三份完整的粘膜活检，所有样本的处理与对照组志愿者的相同。如前所述，使用Qiagen DNA迷你试剂盒(Qiagen, Germany)提取DNA。16简单地说，对于刷状样品，用无菌电线剪将插头和电线尖端分离，并放置在无菌的、无核酸酶的1.5 mL微型离心管中。DNA提取使用Qiagen DNA迷你试剂盒(Qiagen, Germany)。在装有取样刷的微离心管中分别加入缓冲ATL 180 μl和蛋白酶K 20 μl。用力旋转1分钟以去除黏附的粘液，然后脉冲离心并在56°C孵卵1小时。
去除电刷后，加入200 μL缓冲AL，脉冲涡旋，70°C孵育10 min。最后，加入100 μL 100%分子级乙醇，并将混合物装载到Qiagen (Qiagen, Germany)色谱柱上，按照制造商的说明进行加工。最终洗脱物为200 μL洗脱缓冲液。
活检样本以类似的方式处理，使用Qiagen DNA迷你试剂盒。用无菌刀片切割样品，在180µL的缓冲ATL和20µL的蛋白酶K中用力旋动，按上述方法处理。每次运行都使用提取空白，每个患者都要进行提取。16S rRNA的V4区PCR扩增后，提取空白确认为阴性(见下文)，如果空白扩增值与非模板对照相同，则所有空白扩增值均为阴性。
激光捕获显微解剖
快速冷冻的活检样品在−25℃下以12 μ m厚度(Leica CM3050 S, Leica Microsystems, Germany)进行冷冻切片。样品置于无菌、无核酸酶的ARCTURUS PEN膜载玻片上(应用生物系统公司，佩斯利，英国)。每个样品都使用新鲜叶片，以防止细菌DNA在样品之间转移。在每个样品被切片之前，用100%分子级酒精清洗和消毒，然后在无菌通风柜中直接紫外线照射30分钟，以防止环境DNA污染。切片后，立即将样品固定在70%分子级乙醇溶液中，并保存在- 80°C的密封容器中。样品直接转移到干冰上，并在LCM前分别取出和染色。染色方案使用阿利新蓝(Sigma-Aldrich)染色保存的粘液凝胶层，18使用前已经过过滤灭菌，并用梅尔氏苏木精(clint - tech, UK)进行反染色。激光捕获分离出紧密粘附的粘液凝胶层，然后进行大约80-100次靶向解剖(图1D)，取下瓶盖，将瓶盖上的膜置于无菌微离心管中。DNA提取采用与整个活检和刷样相同的方法。
扩增子测序和生物信息学分析
用通用引物PCR扩增16S SSU rRNA基因的V4区;520F (5 ' -AYTGGGYDTAAAG NG-3 ')和926R (5 ' -CCGTCAATTYYTTTRAGTTT-3 ')。总共使用了25个独特的条形码序列，以便在每个平板上收集不同的样本。每次PCR反应使用65 ng的模板DNA, 200 nM的引物和25 μL的BioMix Red (Bioline, London, UK)。PCR反应条件如下:94°C 2 min的初始化和变性，然后变性(94°C 1 min)，退火(52°C 1 min)和延伸(72°C 1 min) 30个循环，然后延伸(72°C 2 min)。在Teagasc 454测序平台上使用钛化学对Roche 454 GS-FLX测序。19使用Qiime套件工具对结果进行质量修剪、聚类、对齐和检查嵌合体。20.利用Qiime估算α和β多样性，利用FastTree包生成系统发育树。21基于未加权Unifrac距离的主坐标分析(PCoA)和层次聚类也使用Qiime进行。用KING可视化PCoA图。22为了进行分类学分类，对SILVA 16S特定数据库(V.110)进行裁剪读取。使用MEGAN分析得到的Blast输出23满分86分。
统计分析
用Wilcoxon秩和检验检验类群间的分类丰度有显著差异。未加权的UniFrac距离度量被用作执行主坐标规范分析(CAP)的输入。24
为了模拟个体内菌群的分布，采用了不对称特征向量图(AEM)分析。25之所以选择这种空间分析技术，是因为它明确地模拟了定向生态过程，解释了结肠中的粪便流。26使用一个假设的上游点创建了一个采样图(见在线补充图S1)，并由此导出了一个逐边站点矩阵，在此基础上执行主成分分析(见在线补充图S1了解工作流，见在线补充图S2了解说明示例)。得到的AEM向量被前向选择到冗余分析(RDA)中，以模拟物种分布。调整R2值被用来估计由模型解释的分类分布的方差百分比。为了在AEM框架的背景下对整个队列进行建模，还使用hellinger转换的家庭水平丰度进行了类间分析(BCA)。27
为了确定微生物群的分类差异是否可以用于将样本划分为不同的队列，一种机器学习算法随机森林(Random Forests)被应用于家族水平的丰度。28采用Spearman秩相关系数评价AEM分析中区域炎症与多样性、区域炎症与差异的相关性。采用非参数协方差分析(ANCOVA)来评估炎症是否不同地影响腔内和黏膜菌群。所有统计分析均使用R和相关软件包进行。29-33
结果
总的来说，来自9个个体的98个样本使用扩增子测序进行分析，获得3 069 310个reads(每个样本的平均测序深度为31 642 (SD 16 216)，在线补充表S1)。
空间生态
为了确定在我们的联合数据集中，人际变异是否是方差的一个重要组成部分，我们对未加权的unifrac距离进行了CAP，证明在联合队列中大部分被解释的方差是由于人际变异，而由其他测量的空间变量解释的比例要小得多(图2)．这与BCA家族水平丰度的结果相似(参见在线补充图S3)。
使用队列中所有样本的未加权UniFrac距离的主坐标规范分析(CAP)约束排序(A)表明人际差异解释了最大比例的方差。(B)由人际、横断面(管腔vs黏膜)、结肠区域(盲肠、横结肠、降结肠和直肠)和炎症的约束变量描述的CAP方差百分比。
为了模拟个体内部的空间生态并寻找空间结构的保守模式，我们进行了AEM分析。建立了采样位置的代表性图，从结肠近端到远端，腔内样本包含了单向流动(见在线补充图S1)。该模型的结果解释了较高比例的个人差异(42%-81%)。拟合的RDA值绘制在相应的结肠区域以图形表示结果(图3)．在对照组中，管腔和粘液凝胶菌群之间的分割是明显的(图3A、B)。
在四个对照组志愿者(A)和四个UC患者(C)中，通过不对称特征向量图分析建立了个人内部变异性的模型。值以0为中心，白色对应负，黑色对应正，圆的半径对应值的大小。在对照(B)和UC (D)中，个体内所有管腔和粘液凝胶样本与个体内匹配位置的刷子和粘液凝胶样本的拟合冗余分析值的差异表明，在个体内，管腔样本与其他管腔样本更相似，而粘液凝胶样本与个体内的粘液凝胶样本更相似，而不是在每个结直肠位置的管腔和粘液凝胶样本。显著性值:*<0.05，***<0.001。
在UC，五分之四的个体具有进行AEM分析所需的样本数量(见在线补充表S1)。在每个级别的炎症评分和总体疾病活动评分显示在表2．在所有这四个个体中，最显著的变异还表现为腔内和粘液凝胶菌群之间的分割(图3C, D)。
分类分析
为了广泛地描述管腔和粘膜环境之间的细菌梯度，在整个队列中评估了管腔、粘膜和粘液凝胶样本中每个细菌家族的平均丰度。样本被分类为从管腔到黏膜的梯度从高到低，从黏膜到管腔的梯度从高到低，或者没有明显的梯度(参见在线补充图S4)。通过Kruskal-Wallis试验，在三个采样层中有显著差异的细菌科被额外突出显示(见在线补充表S2)。
为了确定细菌群的差异丰度是否与观察到的两个队列之间的分离有关，我们比较了对照组志愿者和结肠炎患者在家庭水平上的相对丰度。类群比较采用Wilcoxon秩和检验，经多次比较Bonferroni校正后显著性水平为5%。然后使用Wilcoxon检验的z评分对样本进行排名，从控制组最丰富到UC组最丰富(图4)．为了确定哪些家庭在对照和结肠炎之间最具区别性，我们将机器学习算法随机森林应用到家庭水平的丰度数据。使用整个队列中一定比例的随机抽样作为训练集(约40%)，并在剩余样本上测试分类器，10次重复运行的平均分类错误为1.8%，这意味着算法可以根据家族水平丰度将98%以上的样本正确分类为control或UC。根据从分析和比较中删除时的平均准确度下降，对两个队列中证明最具歧视性的分类进行排序，只纳入那些在Wilcoxon秩(图4)．在对照组中，Bacteroidaceae和Akkermanseaceae均显著丰富且高度歧视性，而在UC中，Clostridiaceae、Peptostreptococcaceae、Enterobacteriaceae、Ruminococcaceae、Bifidobacteriaceae、Actinomycetaceae和Prevotellaceae家族中未培养的成员FJ440089均显著丰富且高度歧视性(family见在线补充表S3, genus见在线补充表S4)。
(A)随机森林分类器的结果，按降序显示了两个队列之间最具歧视性的细菌家族。使用Wilcoxon秩检验和Bonferroni校正进行多次比较，根据它们在对照(蓝色)、UC(红色)或非(灰色)中是否显著增加来对样本进行着色。(B)经过Bonferroni校正的Wilcoxon秩检验，9个细菌科的相对丰度箱线图，这9个细菌科具有歧视性(从分析中去除分类器的准确性平均下降大于0.01)，丰度显著不同。
为了确定管腔和粘液凝胶层之间差异丰富的家族，进行BCA检查，确认对照组和UC中管腔和黏膜样品的分化，并将两个队列分离(图5A).在两个队列中，科杆菌科、拟杆菌科、瘤胃球菌科和Family XIII Incertae sedis在管腔和粘液凝胶层之间的丰度存在差异(图5B, C)。在对照组中，Lachnospiraceae和Plancomycetaceae均额外显著，而在UC中，Porphyromonadaceae、Bifidobacteriaceae、Veillonellaceae、Peptostreptococcaceae和Enterobacteriaceae也差异丰富(参见在线补充表S5a、B和图S5)。随机森林算法在区分管腔和粘液凝胶菌群时存在3.45%的错误分类，UC为0.88%。
对照组和UC中的管腔凝胶和粘液凝胶样品。基于hellinger转换家族级分类单元丰度主成分分析的类间分析(BCA)，比较对照和UC (A)的管腔、粘膜和粘液凝胶微生物群。基于随机森林分类器和Wilcoxon秩检验的丰度，对照(B)和UC (C)的管腔和粘液凝胶具有区别性的细菌科。Lachnospiraceae和Planctomycetaceae为对照所特有，而UC为卟啉单胞菌科、双歧杆菌科、细孔菌科、Peptostreptococcaceae和enterobacteraceae。
此外，我们将随机森林分类器应用于个体和结直肠区域。虽然它在对个体进行正确分类方面表现非常好(平均包外误差率为0.103%)，但它无法区分盲肠、横结肠、降结肠或直肠样本(平均误分类错误率为96%)。
α多样性与炎症
使用Shannon多样性指数(H)，在任何采样技术中，来自对照组的样本和来自UC的样本之间的多样性没有显著差异(见在线补充表S6和图S6)。对于腔内和粘膜样本的choa1估计器、Simpson指数和Faith的系统发育多样性(PD)也是如此。然而，使用四个多样性指数中的两个，UC的粘液凝胶层样本的多样性与对照组相比显著增加(chao1估计量:对照组的565.8 (IQR 412.5)， UC的1355.4 (IQR 780.8)， p<0.001;对照组PD 27.5 (IQR为15.4)，UC组PD 43 (IQR为15.5)，p<0.05)。
在对照组中，采用不同采样技术(腔内、全粘膜活检或激光捕获分离粘液凝胶)所选择的四种指标在多样性上没有显著差异(见在线补充表S6)。在UC中，辛普森指数和H同样没有差异，而使用chao1估计量和PD仍然有显著差异。
为了确定局部炎症是否改变了菌群的空间结构，配对的腔内和粘液凝胶样品之间的AEM分析RDA值的差异与局部炎症的程度相关。该分析表明，粘液分离与相应的炎症程度之间没有显著相关性(见在线补充图S7A)。在腔内、粘膜或粘液凝胶样本中，局部炎症与Shannon多样性之间同样没有显著相关性(见在线补充图S7B和表S7)，这一发现得到了CAP的证实，并排除了其他变量，说明炎症的方向与腔内和粘膜样本的分离方向正交(见在线补充图S7C)。炎症似乎对腔内样本的细菌多样性比粘液凝胶层的细菌多样性有更大的比例影响，但当进行非参数ANCOVA时，这没有达到统计学意义。
讨论
我们表明，当在不同位置采样时，人际变异是人类远端肠道菌群组成中最重要的变量。与时间稳定性一样，当在多个空间点采样时，个体比其他人更像自己，这表明任何对空间或区域差异的考虑都必须取决于一个人的标志性菌群。因此，粪便采样，清楚地展示了人际差异，抓住了这一最重要的方差组成部分。在我们的对照志愿者和严重的、药物难治性UC患者中都注意到了这一点。
在多个地点对每个个体进行采样，使我们能够通过单独建模每个个体内部的空间变异(AEM)并比较个体间的结果，来寻找空间变异的保守模式，否则人际变异会被掩盖。AEM是一种相对较新的技术，用于模拟生态中的空间过程，如河流网络或洋流，其中方向性流动是群落组合的驱动力。像这样的特征向量技术特别允许采样网格的空间表示，因此模型“知道”，例如，盲肠和横结肠是相邻的。更准确地说，它创建了一组适合数据的模式，例如大规模的纵向或横断面模式，以及代表局部差异的小规模模式(参见在线补充图S2的说明性示例)。每个空间模式都被视为一个唯一的变量，分别进行评估，就像在其他多变量技术中一样，只保留那些符合数据的模式。这个分析的拟合值用圆形图形表示，负值用白色表示，正值用黑色表示，每个值的大小用圆的面积表示。视觉上，空间梯度是由黑到白表示的。此外，这种方法适用于我们的采样网格，因为它允许我们模拟结肠内的流动方向。如上所述，在我们的抽样集中有生理、解剖和病理的影响，我们希望尽可能多地纳入捕获的方差(图3)．我们的研究结果表明，腔内和粘液凝胶菌群之间存在一定程度的分离，而传统的黏膜菌群取样方法——全黏膜活组织检查位于这两种方法之间。分类学分析发现，一组细菌科在对照中占了这种分化，另外5个科只在UC中重要(卟啉单胞菌科，双歧杆菌科，细孔菌科，胃链球菌科和肠杆菌科)。有趣的是，这五个科中的三个(双歧杆菌科、Peptostreptococcaceae和enterobacteraceae)也是区别对照和UC的细菌科(图4)．因此，UC患者的管腔和粘液凝胶之间的空间分化与对照组重叠，同时具有额外的独特成分。由于UC中有很大程度的炎症和溃疡，粘附菌群的LCM样本可能更接近生物膜，而不是健康的粘液凝胶层。34然而，没有观察到局部炎症与分离程度或微生物多样性之间的直接联系，这表明UC中观察到的变化更多的是场效应，而不是仅限于严重炎症的区域(参见在线补充图S7)。
虽然我们的研究没有明确区分对照和UC之间的分类差异，但之前有许多研究都关注了这个问题，我们的结果在Akkermansiaceae的减少和Clostridiaceae和Enterococcaceae成员的相对增加方面是相似的。4，35-37Akkermansiaceae的显著减少是值得注意的Akkermansia muciniphila最近被证明可以防止肥胖，减少肠道炎症，同时增强结肠屏障和粘液凝胶层。38，39为了尝试纠正来自同一个体的多个采样，我们使用了随机森林分类器，这是一种前沿的机器学习方法，之前已应用于微生物群研究。7这使我们能够根据预测能力的顺序，而不是简单地依赖原始丰度的统计显著性，来权衡那些在两个队列中最具区别性的细菌家族。随机森林正确区分所选群体的能力与我们其他分析的结果密切相关，分类器在分类个体(人际变异性)方面表现几乎完美，在分类对照组与UC和对照组与UC中的管腔与粘液凝胶方面表现非常好，但在区分结直肠区域方面表现极差。除了在内部验证我们的发现，这让我们能够分离出那些负责在我们的空间模型中观察到的模式的细菌类群。
我们的研究有许多局限性。首先，为了在对照组志愿者中广泛取样，我们必须从接受结肠镜检查的人中招募，他们都在术前做过肠道准备。在我们机构接受结肠切除术的患者没有常规的术前肠准备，这已经成为国际上的标准做法。这种差异可能解释了在对照志愿者中看到的多样性减少，因为迄今为止的大多数研究都注意到，与对照组相比，IBD的多样性减少。虽然这意味着多样性不能解释两个群体之间的差异，但它限制了两个群体之间的直接比较。然而，我们认为这种限制并不会过度影响我们的结论，因为之前描述的健康和UC之间的许多分类差异在我们的研究小组中是明显的。此外，对儿科新发IBD患者的研究表明，多样性的减少仅限于克罗恩病，而不是UC的一个特征，至少在刚接受治疗的患者中是这样。40最后，我们研究的患者数量较少;然而，为了广泛采样并对每个样本进行深度排序，我们希望将精力集中在有限的数量上。减少位点数量将完全降低我们对空间方差建模的能力，而减少测序深度将降低分类学分辨率，从而降低我们发现的稳健性。
结论
在我们的研究中，结肠菌群中大约一半的差异可以用人际差异来解释。在个体内，管腔和粘膜间室之间的差异是明显的，而没有证据表明细菌组成的纵向模式。在分类学水平上，不同的细菌类群解释了对照志愿者和UC之间的差异，以及两个队列中的腔内和粘膜群落。对照组和UC中区分管腔和黏膜群落的细菌类群有重叠，UC中独特的类群有空间分化。
致谢
作者感谢都柏林圣詹姆斯医院组织病理科的Paul Smith博士、Orla Shields教授和John O’leary教授使用他们的LCM平台。
参考文献
脚注
调整通知这篇文章已经被修正，因为它在网上首次发布。现在已经添加了开放获取许可证。
贡献者构思和设计实验:AL, GL, PRO, DCW, ND, JCC, KS, DO。进行实验:AL, GL, OO, AB, AM。分析和解释数据:AL, GL, PRO, DCW, ND, JCC, FS, GD, HMM, JH, RPR, PDC。贡献的试剂/材料/分析工具:JH, DO, HEM。写论文:AL, PRO。
资金爱尔兰科学基金会资助(批准号:09年/ IN.1 B2606)。
相互竞争的利益一个也没有。
病人的同意获得的。
伦理批准圣文森特大学医院，爱尔兰都柏林埃尔姆公园。
数据共享声明所有资料均可按要求提供。
来源和同行评审不是委托;外部同行评议。