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摘要
目标在超重或中度肥胖中，肠道微生物基因丰富度(MGR)降低和组成变化与不良代谢有关，但在重度肥胖中缺乏特征。减肥手术(BS)可以改善严重肥胖患者的代谢和炎症，并与肠道菌群的改变有关。在这里，我们描述了严重的肥胖相关的生态失调(即MGR、微生物群组成和功能特征)，并评估了BS是否可以挽救这些变化。
设计纳入了61名重度肥胖受试者，他们都是可调节胃束带(AGB, n=20)或roux -en- y胃旁路术(RYGB, n=41)的候选者。24名受试者在获得学士学位后1、3和12个月进行随访。使用散弹宏基因组学和液相色谱质谱(LC-MS)分析肠道菌群和血清代谢组。包括确认组。
结果75%的患者存在低基因丰富度(LGC)，并与躯干脂肪量增加和共病(2型糖尿病、高血压和严重程度)相关。LGC改变了78个宏基因组物种，其中50%与不良体成分和代谢表型相关。九种血清代谢物(包括戊二酸，3-methoxyphenylacetic酸而且组氨酸)和含有参与其代谢的蛋白质家族的功能模块与低MGR密切相关。BS患者术后1年的MGR增加，但大多数RYGB患者术后1年的MGR仍然较低，尽管代谢改善比AGB患者更大。
结论我们发现了严重肥胖患者肠道菌群的主要改变，包括MGR的降低和与代谢恶化相关的功能途径。由于缺乏bs后的完全拯救，需要采取额外的策略来改善严重肥胖患者的肠道微生物生态系统和微生物-宿主相互作用。
试用注册号NCT01454232．
- 肠道
- 肠道细菌
- 胃手术
- 肥胖
- 肥胖手术
数据来自Altmetric.com
本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
中度肥胖的特征是微生物基因丰富度(MGR)降低(20%-40%的患者)，与代谢风险改变和宏基因组物种(MGS)特征的转移相关。
这一点还没有在严重肥胖中进行过研究。
一些受试者数量有限的研究显示了肠道菌群的变化，但在6个月的随访后，没有一项研究精确地探索MGR并结合相关宏基因组学和代谢组学特征。
新的发现是什么?
这是首次对严重肥胖进行的综合研究，表明MGR降低的患者患病率非常高(75%)，这与明显的代谢并发症有关。
我们描述了新的代谢组学和MGS特征，这些特征是在严重肥胖中发现的特定的MGR下降。
减肥手术(包括可调节胃束带和roux -en- y胃旁路手术(RYGB))改善了MGR，但在大多数患者中可以部分恢复，尽管所有患者的代谢得到显著改善和体重减轻，但大多数患者仍保持低MGR。
rygb后代谢产物(如甘氨酸、乙酰甘氨酸和甲基丙二酸)的增加与身体成分的改善有关。
重要的是，即使rygb后的较长时期(即5年)也不会进一步增加MGR。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
我们的研究结果质疑特定的干预措施(专门的饮食、益生元/益生菌或肠道菌群转移)是否有助于重度肥胖患者在减肥手术前或手术后考虑进一步改善MGR和代谢健康。
简介
在复杂的肥胖原因中1及其相关疾病2(2型糖尿病(T2D)和心脏代谢疾病)，肠道菌群似乎是一个相关的贡献者，可能是生活方式改变和宿主生物学之间的关键因素(综述，见参考文献)3.)．在超重和中度肥胖中发现了肠道生态失调，4个5肠道菌群组成的显著改变(特定菌群的富集或减少)和微生物基因丰富度(MGR)证明了这一点，4个5这与代谢改变(胰岛素抵抗，低度炎症和脂肪细胞肥大)有关。4个5然而，尽管重度肥胖(体重指数(BMI) >35 kg/m²)和病态肥胖(BMI >40 kg/m²)在全球范围内有所进展，男性和女性分别达到2.3%和5%，但在极端形式的肥胖中，肠道菌群特征却很少被探索。虽然一些严重肥胖的患者代谢仍然健康，6总体而言，BMI达到>35 kg/m²时，慢性疾病的发病率显著上升。1此外，健康的肥胖者往往会随着时间的推移出现代谢改变和合并症。6
此外，重度/病态肥胖者是减肥手术(BS)的唯一合格候选人，这种治疗在世界范围内急剧增加7因为它能降低心血管风险，改善代谢状况。8通过比较可调节胃束带(AGB)和roux -en- y -胃旁路手术(RYGB)， BS代表了一个很好的模型，可以理解肠道对改善健康的贡献，AGB是一种由于胃容量减少而单独诱导热量限制的手术(相当于成功的饮食干预)，而roux -en- y -胃旁路手术(RYGB)则相反，它极大地重新安排了消化道结构，并在减少食物摄入量的同时增加了肠道吸收不良。9MGR由饮食干预调节，在超重/中度肥胖者中，在短期饮食限制(增加纤维)后，MGR增加30%。5很少有研究使用全鸟枪宏基因组学(WGS)来研究微生物群的进化。10 - 12在bs之后的几个时间点进行了随访。特别是，MGR在bs后的进化及其与其他特征(临床改善或全身代谢组学)的关系几乎没有得到评估。重要的是，这些有益的联系中有50%取决于bs后的饮食改变，13因此，确认有必要比较不同BS技术(即AGB和RYGB)后微生物群的变化，其中总热量的食物减少没有差异。14
在本文中，我们使用WGS，旨在检查(1)MGR是否在严重肥胖中恶化，以及它与合并症加重的关系;(2)不同BS类型是否可以不同地纠正严重肥胖相关的肠道微生物特征，包括MGR、组成和功能的变化。
材料与方法
临床组
我们前瞻性地纳入了61名重度肥胖妇女(巴黎Pitié-Salpêtrière医院肥胖部门的微胖症(MB)) (图1一个)，如所述。15根据国际BS指南(即BMI≥40 kg/m²或≥35 kg/m²，至少有一种严重的肥胖相关共病)和患者的偏好，将患者分配为AGB或RYGB，随后由多学科小组验证该决定。RYGB常用于病情更严重的个体。
重度肥胖的MGR。(A)研究流程图:基线(MB或MB+MO)和MB随访队列。采用两个独立的确认队列(EROIC和ATOX)进行数据确认。(B) MGR在MB基线队列中的双峰分布。(C) AGB和RYGB患者的基线MGR，包括每个手术组的四个肠型特征。AGB，可调节胃束带;HGC，高基因计数;LGC，低基因计数;MB, Microbaria;微生物基因丰富度经理; MO, MICRO-Obes; RYGB, Roux-en-Y-gastric bypass.
在基线(T0)和术后1个月(T1)、3个月(T3)和12个月(T12)的随访中进行临床、人体测量学和生物学评估。16T2D，葡萄糖不耐受状态和血脂异常状态(定义见在线补充材料和方法)。双x线吸收仪估计体成分(Hologic Discovery W, V.12.6软件，2;贝德福德,马萨诸塞州),16其中包括总无脂质量、总脂肪质量、躯干脂肪质量(均以千克或%为单位)和女性脂肪分配。患者填写调查问卷，记录一般健康状况、药物、出生方式和布里斯托大便量表(BSS)。在所有描述的时间点，在夜间禁食12小时后采集血液样本，使用葡萄糖稳态和血脂常规技术测量生化参数。在T0时对一部分患者(n= 21,34%)进行口服糖耐量试验(OGTT)，以评估葡萄糖和胰岛素曲线下面积(AUC)，并使用Stumvoll指数来表征糖耐量。17所有患者都经历相同的准备过程，平均持续6-12个月，他们最初被建议有一个均衡的饮食。他们的T0访视平均在手术前3个月进行。我们不建议他们改变饮食或减肥，而是建议他们稳定体重。
补充材料
每次来访均采用标准化方法收集粪便。18没有患者在bs前接受抗生素治疗3个月，也没有任何急性或慢性胃肠道疾病史。所有受试者均签署知情书面同意书，并在ClinicalTrial.gov (NCT01454232)．
为了在更广泛的BMI和代谢并发症范围内检查肠道微生物群，我们使用了先前描述的方法5MICRO-Obes (MO)队列(图1一个)，年龄相似，主要由女性(84%)组成，她们是超重/中度肥胖患者，没有T2D或任何医疗。增加了两个确诊和独立队列，包括接受RYGB的严重肥胖患者。我们在术后T0、3、12个月和5年对10名接受RYGB手术的严重肥胖患者(即ATOX队列)进行了进一步随访，对他们进行粪便采样并进行WGS，以分析MGR和宏基因组物种(MGS)相关特征。该队列最初设计用于描述长期微生物群进化的特征。因此，我们在1岁时只能接触到4名患者，在5岁时可以接触到整个组。另一个独立的确认队列包括147名严重肥胖患者(即EROIC队列:64名T2D患者和83名非T2D肥胖患者)，在术后T0和12个月进行了随访，我们对这些患者进行了血液采样和代谢组学分析(图1一个)．
使用相同的WGS方法和生物信息学处理对MB、ATOX和MO肠道菌群进行测序。在两个队列中也获得了相似的临床表型。
定量宏基因组学分析肠道菌群
参与者在每次访问前24小时内收集两支20毫升的粪便样本。样品要么立即保存在−80°C，要么在无氧条件下短暂保存在家用冰柜中，然后运输到实验室，在实验室中按照指南立即在−80°C冷冻。18
从182 MB样本中提取总粪便DNA，测序和分析。DNA提取使用淬火溶液来保护DNA不被DNA酶降解，并使用打珠步骤来确保特别健壮的细胞的裂解。19日20为每个样本制备条形码片段库，使用SOLiD 5500xl测序仪生成DNA测序数据。样本平均获得6872万个35碱基长单读(SD 26M)。同样的方法也适用于ATOX。
初步分析，从reads质量清洗到390万个基因参考目录的reads映射，21使用Meteor Studio进行。5二级分析，从基因丰度标准化到MGS投影，21并进行统计分析momrR包。在线补充材料和方法详细描述生物信息学处理。
血清代谢组学
在基线时对58 MB患者进行血清代谢组学检测(图1一个)．使用冷乙腈以12.5µg/mL提取血清样本，其中含有16种氨基酸的标记混合物，并按照在线描述进行处理补充材料和方法．
LC-MS分析在UPLC Waters Acquity (Waters, Saint-Quentin-en-Yvelines，法国)和Q Exactive (Thermo Fisher Scientific, Illkirch，法国)上进行。如所述，采用色谱条件筛选微生物群衍生的代谢物。22数据经过整理、规范化和注释，得到242种不同的代谢物。详细的预处理和处理步骤在网上报道补充材料和方法．
统计分析
使用公共包和内部包对R进行统计分析。当变量呈现非正态时，进行非参数统计。所有试验均采用Benjamini-Hochberg校正多次试验。当假分娩率(FDR) <5%时，结果被认为是显著的(除非另有说明)。对不同时间的样品进行配对测试。图形是用R core和ggplot情节。
结果
重度肥胖患者肠道菌群丰富度及临床表型
在61例BMI为>35 kg/m²的肥胖女性(MB)中，MGR呈现双峰分布。4个5使用与之前相同的方法和基因截断(48万)4个5为了创建低基因计数(LGC)/高基因计数(HGC)类，绝大多数患者(75%)属于LGC组(图1 b)，与超重/中度肥胖相比，体重显著增加。4个5在基线时，RYGB和AGB患者具有相似的总体临床特征和BMI，除了在RYGB患者中dexa量化的躯干脂肪量增加和阻塞性睡眠呼吸暂停的患病率(在线)补充表1)．AGB患者的MGR明显高于RYGB患者(p=0.013) (图1 c)．
补充材料
LGC与代谢改变呈负相关:甘油三酯(p=0.049)、尿酸血症(间接胰岛素抵抗标记物，p=0.038)、全身炎症标记物纤维蛋白原(p=0.048)和中性粒细胞计数(p=0.042)(在线)补充表2)．4个5除了先前的研究结果外，MGR被认为与有害的身体成分(即躯干脂肪量(r=−0.27 p=0.04))呈负相关，与血糖正常的患者相比，T2D患者的MGR显著降低(p=0.014)。MB队列包括9例T2D患者(在61例患者中)，其中8例接受二甲双胍治疗，这是国际T2D治疗推荐的第一种控制葡萄糖稳态的治疗。23唯一一名没有使用二甲双胍的患者不需要任何抗糖尿病药物来保持糖化血红蛋白低于6.5%的目标。高血压患者的MGR降低(p=0.05)，我们观察到LGC患者代谢综合征特征(国际糖尿病联合会(IDF)定义)的趋势(p=0.058)补充表2)．BSS显示，大便较软与MGR降低相关(p=0.005, r=−0.42)(在线)补充表2)．我们没有观察到出生方式(阴道或C节)、质子泵抑制剂(PPI)的使用或吸烟对MGR的任何影响。
补充材料
除了MGR之外，为了进一步了解微生物组的组成，我们使用了Holmes的dirichlet多项混合物(DMM)方法等24以描述MB队列的肠型组成。我们在此显示了最近描述的相同的四种肠型的存在25解释了40%的微生物组组成的变化(R2= 0.4;置换多变量方差分析(PERMANOVA)检验)(在线补充图1)，但基线时肠型组成与BSS无显著相关性(Fisher检验p=0.97 (AGB)和p=0.57 (RYGB))。有趣的是，我们观察到B2肠型患者的MGR值较低，而瘤胃球菌肠型患者(尽管数量较少)的MGR值确实较高。基线时T2D患者中B2肠型最多。
补充材料
基因丰富性随肥胖加重而恶化
我们进一步旨在通过检查其分布和生物临床关系，了解MGR在超重到病态肥胖的更广泛的BMI范围内的情况。为此，我们汇集了我们中心检查的MB和MO(超重/中度肥胖)队列的临床信息5（图1一个)．与MO患者相比，MB患者更年轻，所有女性都表现出较差的身体成分(即总脂肪和躯干脂肪量增加)，并有更频繁的心脏代谢并发症:T2D，高血压(HTA)，胰岛素抵抗增加(空腹和OGTT期间)，C反应蛋白(CRP)和白细胞介素-6 (IL6)增加(表1)．
在整个人群中(MB+MO, n=110名受试者，BMI (26-61 kg/m²)，脂肪-质量(16.5-81 kg))， MGR与脂肪-质量(p=0.0002)、瘦素(p=0.0072)、空腹胰岛素(p=0.00019)、稳态模型评估胰岛素抵抗(HOMA-IR) (p=0.00005)、甘油三酯水平(p=0.0024)和全身炎症(IL6和CRP (p=0.019和p=0.038)呈负相关。MGR在MO、AGB和RYGB患者中分别下降，与BMI、总脂肪量和躯干脂肪量呈显著负相关(图2一个)，与雌核脂肪分布呈正相关(p=0.037)。MGR随着HTA及其严重程度(通过达到正常血压的药物数量来证明)、葡萄糖不耐受和T2D (图2 b)．MGR与葡萄糖不耐受相关参数(OGTT葡萄糖AUC和OGTT Stumvoll指数)和皮下脂肪细胞体积呈负相关，与脂联素(图2 c)．MGR没有性别影响，证实了之前的观察结果。4个5
MO+MB受试者的MGR与生物临床特征之间的联系。(A) MGR与人体测量参数的关系。(B) MGR与代谢共病(高血压及高血压治疗和糖尿病)的关系;N, non-diabetes;IG，葡萄糖不耐受;D,糖尿病。(C) MGR与OGTT衍生的糖耐量参数(75 g葡萄糖OGTT后葡萄糖的AUC和Stumvoll指数)、脂联素和脂肪细胞体积的关系。Pearson的相关性被执行(p=p值，q=FDR和r2；统计方法包括线性模型(lm)、皮尔逊和斯皮尔曼相关性、t检验和适当时的Kruskal-Wallis。AGB，可调节胃束带;AUC，曲线下面积;DXA, x射线吸收仪;MB, Microbaria;微生物基因丰富度经理;密苏里州,MICRO-Obes;OGTT，口服葡萄糖耐量试验;RYGB, roux -en- y胃旁路手术。
在这些受试者中，我们考虑了所有786个MGS，它们代表了至少有500个基因的共丰基因组。21通过主坐标分析(PCoA)分析，还在MGS丰度水平上观察了肥胖与肠道微生物群之间的关联。前两个主成分描述了总方差的23%，第二个主成分主要与MGR(在线)相关补充图2A,B)，显示了重要的生态系统差异根据肥胖程度和富裕程度。从超重到病态肥胖，MGR的损失与不良的身体成分、脂肪细胞肥大和明显的代谢并发症有关。
补充材料
与丰富度相关的宏基因组物种与严重肥胖的代谢恶化有关
我们检查了786个MGS中的一些21与严重肥胖的临床表型相关的参数特别相关。其中约29% (n=226)与MGR显著相关(FDR<0.05)。我们重点研究了与mgr相关性最强的MGS (n=78, FDR<0.001;图3一和在线补充表3)，其中只有18个以前发现与LGC有关4在不太肥胖的人身上。78个MGS中绝大多数与MGR呈正相关(r>0.47)， 3个呈负相关(r<−0.51);其中19个在物种水平上进行了注释。富集分析(Fisher’s test)与MGS总目录(n=786)比较表明，Firmicutes (FDR<6.7e-05)是与MGR相关的最常见门，Clostridiales (FDR<5.5e-06)在目水平上最常见。重要的是，我们在由接受RYGB的严重肥胖个体组成的ATOX独立队列中证实了低MGR的MGS特征(图1一个)．大多数MGS(50/78)与低MGR(在线)相关补充图3)．我们还证实了低MGR与增加的BMI和躯干脂肪量之间的显著相关性。同样，在有合并症(T2D、HTA、使用抗高血压药物)的患者中，MGR显著降低(数据未显示)。
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基线mg相关MGS。(A)与mgr相关的MGS丰度和代谢变量(身体成分、肥胖和代谢特征)以及与mgr相关的血清代谢物之间的Spearman成对相关系数的热图。(B)与mgr相关MGS相关代谢参数的维恩图。(C)代谢表型与目标血清代谢物的Spearman成对相关系数热图。P值显著性用*表示，FDR显著性用#表示。BMI，身体质量指数;糖化血红蛋白;在HTA、高血压;微生物基因丰富度经理;MGS，宏基因组物种。
我们发现了这78种与mgr相关的MGS与临床变量之间的相关关联补充表3): 5个和7个MGS分别与BMI和脂肪量显著相关(其中2个抵制多次测试:顾:373 Coprococcus_sp5而且顾:115 Eubacterium_sp_CAG_115)．16种MGS与躯干脂肪分布相关，包括两种bmi相关的MGS，顾:373 Coprococcus_sp5而且顾:115 Eubacterium_sp_CAG_115（图3一)，少数与T2D、HTA或代谢综合征相关，见图3 b．
观察MGS表型关联的总体模式，我们观察到相关的MGS亚群与代谢参数和肥胖特征呈正相关，如总脂肪量和躯干脂肪量、甘油三酯和血红蛋白A1c (Hba1c)(其中包括GU:6 vulgatus拟杆菌，183丹毒而且顾:373 Coprococcus_sp5，后者还与一组临床合并症(代谢综合征，HTA, T2D)相关，一组与BMI、总脂肪和躯干脂肪、甘油三酯和糖化血红蛋白呈负相关(顾:115 Eubacterium_sp_CAG_115，谷:121瘤胃球菌菌而且顾:82 Faecalibacterium_6) (图3一)．厚壁菌门的五种MGS与三种不同的代谢改变(T2D、代谢综合征和HTA)相关，即顾:373 Coprococcus_sp5，195 Faecalibacterium 1，顾:66 Lachnospiraceae，GU:82 Faecalibacterium 6，Eubacterium sp CAG:86而且顾:163梭菌的(在线补充表3)．尽管样本量较小，但在确认队列(ATOX组)中，我们观察到与mgr相关的MGS与代谢临床变量之间相似的关联趋势:GU:6 vulgatus拟杆菌与糖化血红蛋白呈正相关(在线补充图4)．
补充材料
在严重肥胖中，在与mgr相关最多的MGS中，50%与代谢变量相关，其中20.5%与不良身体成分和代谢改变相关。
与MGR相关的代谢产物和相关的细菌功能
在基线时，我们确定了9种血清代谢物(占测量代谢物的4%)与MGR显著相关(Spearman相关性，FDR<0.05)(在线)补充表4和在线补充图5)．一个代谢物(戊二酸)负相关(r=−0.4;P <0.0017)， 8种代谢物(3-methoxyphenylacetic酸，phloretate，hippurate，3-hydroxyphenylacetate，组氨酸和三个未知项)与MGR正相关(0.4
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我们定义了包含上述代谢产物代谢的KEGG库中蛋白质家族的功能模块。基于3.9M基因目录的功能注释，将这些模块投射到目标MGS上。21这些投影显示了目标MGS与戊二酸、海马酸和l -组氨酸的功能联系。琥珀酸-半醛脱氢酶/戊二酸-半醛脱氢酶(K00135)将戊二酸-半醛氧化为戊二酸，在75个阳性mgr链接的MGS中只有3个编码。GU:347编码两种参与d -赖氨酸降解为酮己二酸的酶(K00128, K00832)，根据C-13标记实验，可以通过脱羧转化为戊二酸乙酰辅酶a假单胞菌putida．26日27日78个MGS中有9个MGS编码海马酸水解酶，该酶负责海马酸降解为甘氨酸和苯甲酸。其中，3种MGS中有2种与MGR呈负相关(GU:183和GU:373)。假设海马酸盐是微生物来源，这一结果以及海马酸盐血清水平与MGR的正相关，将与这些MGS在降低LGC患者海马酸盐中的作用相一致。观察到l -组氨酸生物合成(8个靶标MGS具有完整的途径)和降解(8个靶标MGS具有4个途径中的3个ko)的最完整的功能谱(在线)补充图6)．
补充材料
通过观察与临床变量的联系，3-methoxyphenylacetic酸与雌核脂肪分布呈正相关，与躯干脂肪量和甘油三酯呈负相关。组氨酸HTA和/或代谢综合征患者(在线补充表4)．戊二酸随着糖化血红蛋白的升高而增加，糖尿病患者和血糖受损患者(图3 c)．总的来说，我们在重度肥胖中显示了低MGR、相关MGS、系统代谢物浓度和相关MGS代谢途径之间的新关系。
减肥干预后部分微生物恢复
我们调查了MGR是否会改变MB队列患者亚群(10 AGB和14 RYGB)的bs后，并在bs后1、3和12个月进行随访(图1一个)．与基线时的61例患者相比，这个子集具有相似的临床特征(在线补充表1(右)及经改善的经理职位(表2)．RYGB患者比AGB患者更能改善其身体成分、代谢和炎症情况(表2)学士后1年。28
在两例手术中，MGR在M3时从基线开始升高，并在M12时达到统计学意义(图4 a, B)．尽管RYGB后的代谢改善比agb后更大，但即使在M12, RYGB在1年随访期间的MGR仍显著降低(图4 b, C)．在基线时，与AGB患者相比，RYGB患者具有更多的非生物微生物组(平均AGB- mgr =430 322个基因，SE=32 556;平均RYGB-MGR=340 743, SE=30 347)，这些差异维持在M12位点(平均AGB-MGR=526 922个基因，SE=19 899;average RYGB-MGR=418 822, SE=13 650) (图4 b)．这表明两种手术后丰富度的恢复模式相似(M12时，平均MGR在rygb和agb后分别增加了1.39倍和1.27倍)，两组之间没有显著差异(Wilcoxon p=0.86)。我们还观察到MGR进化的个体间差异，在随访期间，一些患者保持相当稳定，而两组手术中的其他患者则表现出显著增加(图4 b)．基线HGC患者在bs后保持稳定或进一步增加。4例患者在M12时由LGC转入HGC(其中3例来自AGB组;30%)。所有T2D患者(在基线时接受二甲双胍治疗)术后的MGR在第一年随访中也有所增加，其中一名患者在M3前仍接受二甲双胍治疗，因此表明bs后丰富度的恢复与二甲双胍治疗无关(图4 b)．重要的是，我们观察到大多数患者在RYGB后改变了肠型组成;特别是，大多数B2患者在基线时转换为B1肠型(图4 b)．
减肥手术后的微生物组成。(A)从基线到第1个月(M1)、第3个月(M3)和第12个月(M12)， RYGB和AGB中MGR的平均变化。(B)在M1、M3和M12进行动力学随访的24例患者的丰富度和肠型组成的演变。(C) MGR在AGB (n=10)和RYGB (n=14)患者中肠型分布在M12，并进行动力学随访。(D)在另一个独立的RYGB (ATOX)队列中证实了5年的丰富度演化。* AGB和RYGB之间的意义。*基线与M12之间的显著性。AGB，可调节胃束带;微生物基因丰富度经理;RYGB, roux -en- y胃旁路手术。
独立减肥组(ATOX)证实了bs后MGR的增加。MGR从基线上升到1年，与MB患者的模式相似。最有趣的是，MGR在rygb后的1至5年内稳定下来，这表明第一年看到的主要肠道菌群变化之后不会发生。与MB患者一样，尽管MGR不断增加，但很少有患者在1年或5年切换到高MGR (图4 d)．
在生态系统层面，无论时间点如何，RYGB患者彼此之间的相似性都比AGB患者更大补充图7A)．对于每个患者，我们计算所有时间点和不相关样本之间的受试者内相似性(在线)补充图7A,B)．BS改变了肠道微生物生态系统，从M1到M12的轨迹可以看出，这些改变发生在整个随访过程中，AGB和RYGB之间存在显著差异(p<0.013)。RYGB对微生物组的改变程度高于AGB(样品内相似性较低，p<0.001)。
补充材料
接下来，我们检查了具体的MGS更改。在上述786例MGS中，RYGB和AGB手术后12个月分别有11例和2例MGS发生显著改变(p<0.01);其中之一(225病毒丁酸单胞菌)被两种干预措施(图5一个和在线补充表5)．78例MGR-linked MGS中，全组只有3例M12时显著升高(FDR<0.05) (顾:99 Roseburia顾:225Butyricimonas virosa顾:359Butyricimonas)(在线补充表3)，但在每个手术亚组中测试时均无显著性。重要的是，MB中rygb后显著修改的11个MGS中有10个在ATOX确认队列中遵循相同的模式(在线补充图8)．
补充材料
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减肥手术后MGS显著改变。(A)两种手术后基线和T12之间的12 MGS有显著差异。棕色:RYBG (11 MGS);米色:AGB (2 MGS;1为RYGB-MGS所共有的)。*显著p值(棕色为RYGB，米黄色为AGB, T0和T12之间)。(B) MGS δ与临床结果改善之间的Spearman成对相关系数热图。*显著p值;#显著的罗斯福。AGB，可调节胃束带; BMI, body mass index; HbA1c, haemoglobin A1c; MGS, metagenomic species; RYGB, Roux-en-Y-gastric bypass.
在这12个MGS中，我们发现他们在bs后的变化与M12和基线之间临床变量的变化有显著的关系(图5 b和在线补充表5)．这些MGS中有一半与至少两个肥胖和身体组成变量有关。在这些物种中，224 Hungatella hathewayi，GU:649形核梭杆菌而且GU:588 Dialister sp与BMI、雌肌或躯干脂肪的变化呈最强烈的负相关谷:203拟杆菌，古:25 Anaerostipes hadrus而且古:235 Coprobacillus sp与这些表型的变化呈正相关。的变化224 Hungatella hathewayi也与糖化血红蛋白水平和古:235 Coprobacillus spHTA分辨率降低。重要的是，5个与mgr相关的基线MGS在bs后发生了变化。
在循环代谢物中，有30种在M12时发生bs后显著修饰，减少50%(主要与氨基酸、支链氨基酸、苯丙氨酸和色氨酸途径代谢物有关)。其中，只有一个(Unk_107.0486，仍未知)与基线时的MGR显著相关(在线)补充表6,在线补充图9)．在我们确认组(EROIC) (图1一个)，我们可以绘制30个注释代谢物中的18个，这些代谢物在MB队列中显著修改。在有或没有T2D的患者中，所有人都遵循类似的bs后模式补充图10)．
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bs后1年(MB组)这些代谢物的变化与生物临床参数的变化显著相关(主要与肥胖和身体成分有关;在线补充图11)．我们观察到一组代谢产物(如甘氨酸，乙酰甘氨酸，甲基丙二酸)在rygb后增加，与机体肥胖和脂肪细胞直径的减少呈显著负相关。甲基丙二酸和甘氨酸的变化也与两种bs修饰的MGS的变化显著相关(即，谷:203拟杆菌而且顾:235 Coprobacillus_sp)，这也与身体成分的改善有关。在EROIC确认队列中，我们确认了rygb 1年后18个代谢物的代谢物变化和临床变量改善之间的相同关联趋势。在两组中，增加bs后的乙酰甘氨酸和甘氨酸与改善体重和身体成分呈负相关补充图12)．
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讨论
在这里，我们报告了两个独立队列中证实的与特定mgs相关特征相关的MGR的显著降低。我们描述了相关的微生物组功能改变和低mgr相关代谢组学特征。我们在重度肥胖中发现了最近在40个体重过轻到中度肥胖的个体中发现的四种肠型。25因此，很少有严重肥胖患者携带瘤胃球菌肠型(即那些表现出较高MGR的患者)。基线时与代谢合并症相关的MGS与bs后1年发生显著变化的MGS不同。引人注目的是，尽管bs后体重显著减轻，代谢得到改善，但低MGR并没有完全恢复。两种手术类型后MGR均显著升高，但大多数患者在1年后MGR仍处于低水平，此时bs后的改善达到峰值。这种表型即使在5年后也保持相似。在许多bs后患者中观察到肠型的转换，B2肠型减少与低细菌负荷相关。25
低MGR在重度肥胖中更为普遍(75%的患者有LGC)，而在瘦肉或超重/中度肥胖中，LGC为23%4到40%5的主题。因此，在炎症性肠道疾病中，MGR的降低似乎是疾病严重程度的标志。在确认LGC、代谢改变和低级别炎症之间的关联时，4个5我们发现了MGR和躯干脂肪之间的新联系，与BMI本身相比，躯干脂肪是一种有害的脂肪库，与心脏代谢风险(特别是T2D状态)更密切相关。29MGR与脂肪细胞大小之间的负相关进一步说明了与脂肪组织表型之间的相互作用，类似于我们报道的减少之间的联系Akkermansia muciniphila脂肪细胞肥大。30.由于本文所包括的大多数T2D患者(8/9)在基线时接受了二甲双胍治疗，我们无法将该药物与T2D状态在低MGR时的影响分开。然而，在我们的研究中，T2D患者接受了抗糖尿病药物的治疗，这表明与Forslund之前研究的受试者相比，T2D患者的疾病更为严重等s和Wu等在该研究中，研究了二甲双胍对菌群组成的混杂效应。31日32然而，在Forslund等的研究中,32使用二甲双胍或不使用二甲双胍的患者MGR无显著差异;因此，我们不认为观察到的低MGR与药物有关，而是可能是疾病严重程度的标志。
Vandeputte等25报道B2型肠型与细胞数量减少、细胞水分增加和基因丰富度降低有关。在这里，我们没有观察到肠型和与细胞湿度相关的布里斯托大便评分之间的任何关系，但我们观察到BSS和MGR之间的关联，如先前报道的那样。33我们没有评估细胞计数，但有趣的是，B2患者在RYGB组中，是MGR最低的患者。因此，肠型可以作为细胞计数测量的代理。25值得注意的是，之前的数据显示，严重肥胖患者的转运时间较慢(而不是增加)，34BS之后没有修改。35BSS可能是肠道炎症的间接标记物，如前所述，BSS升高与钙保护蛋白(一种肠道炎症标记物)之间的关系。36这与我们实验室之前的一项工作相一致，在该工作中，我们证明了与瘦人相比，严重肥胖的特点是肠炎症增加，可见空肠免疫细胞浸润。37最后，这也与先前的结果一致，在BSS评分高于3的患者中观察到MGR下降，这涉及到大多数MB队列。38我们没有像其他地方报道的那样观察到与吸烟、出生方式或PPI之间的联系，我们认为这可能是由于严重肥胖受试者的微生物组状态已经发生了很大变化。
重要的是，在786个参考基因编目的MGS中，有三分之一与MGR连接(其中n=78;10%)也与合并症高度相关，其中大多数似乎是严重肥胖的特定特征。一半的MGS与躯干脂肪量和代谢改变有关，如甘油三酯增加和葡萄糖耐量受损。在使用分层聚类方法分组的MGS中，一个聚类包括b . vulgatus，与不良代谢有强烈的正相关，证实了相关研究结果b . vulgatus还有胰岛素抵抗。39在接受益生元治疗的肥胖女性中，b . vulgatus随着脂肪量的减少和葡萄糖稳态的改善而降低。40增加b . vulgatus诱发啮齿动物结肠炎等不良健康后果。41b . vulgatus在活动性克罗恩病患者中富集42并诱导产生一种糖蛋白参与炎症引发的粘膜防御。43深入分析b . vulgatus维生素对新陈代谢的贡献现在得到了证实。在同一个MGS星团中，我们还发现顾:373 Coprococcus_sp.x5．啮齿类动物的数据表明Coprococcus食用果糖的动物增加，导致代谢综合征。Coprococcus动物在抗生素治疗或粪便转移后减少，这改善了它们的代谢表型。44与此相反，另一个MGS集群由树干脂肪显著减少的物种组成。该类群包括梭菌属(Lachnospiraceae和Ruminococcaceae)Blautia，Faecalibacterium，具有抗炎作用，45和其他厚壁菌门。这一观察结果为理解这些MGS与不良身体成分和代谢之间的潜在相互作用或不平衡铺平了道路。为了进一步探索这些与代谢恶化相关的细菌类群，还需要对其他具有未知注释的MGS簇进行更多的研究。
我们还强调了代谢组学与MGR及其MGS特征的相互作用。3-Methoxyphenylacetic酸，与MGR呈正相关，与躯干脂肪量和b . vulgatus，似乎受到多酚的影响。3-Methoxyphenylacetic酸生产结果多酚和类黄酮发酵。46这种代谢物是否通过肠道微生物群对食物成分的加工介导有益的健康影响需要进一步评估。组氨酸是一种必需氨基酸，存在于富含蛋白质的饮食中，肥胖人群的血清组氨酸会降低，47这与我们的结果一致，组氨酸随着肥胖严重程度的降低而降低。它与16个包含编码组氨酸产生/降解途径的mg相关MGS基因相关。我们发现组氨酸降解途径中关键酶的变化(KO1745, KO1712, KO1468, KO1479)可能导致l -谷氨酸(γ -氨基丁酸(GABA)的前体)的产生，12这与促炎细胞因子和炎症性疾病的下调有关。48戊二酸也与mgr相关的MGS呈负相关，与HbA1C呈正相关49这可能是一个有趣的目标，可以进一步研究它与低级别炎症维持和代谢改变的潜在联系。
如果以前的研究证明了bs后肠道菌群组成的变化，大多数是使用分辨率较低的技术(定量PCR, 16S rDNA测序)在参考文献中进行的50-53在小的主题组或只有一个时间点后bs。很少有研究使用全宏基因组测序10 - 12 54在配对患者中结合大规模多组学方法，在几个时间点随访1年，当体重减轻和代谢改善出现低谷时，也没有比较不同技术的效果。
通过WGS，我们发现重度肥胖患者的低MGR和相关功能改变在bs后1年仅得到部分恢复，这些变化仅涉及基线时的宏基因组和功能特征改变。两种手术后，MGR仅呈进行性升高，且在1年后变得显著，这与先前的报道一致:(1)8例RYGB患者在1年内MGR无显著升高10；(2)在与我们规模相似的队列中，使用散弹枪测序，增加袖后3个月的MGR12；(3)利用16s -焦磷酸测序技术提高rygb 6个月后的丰富度。50值得注意的是二甲双胍，它代表了糖尿病治疗的第一线23而不是T2D严重程度的标志，大多数T2D患者在基线时给予(8/9)。尽管使用了二甲双胍，但这些患者的MGR仍升高，这表明低MGR不能完全归因于二甲双胍。
我们工作的一个主要发现是，尽管MGR显著增加，但大多数患者在bs后1年仍保持低MGR，甚至在rygb后更高，尽管生物临床改善对agb后观察到的患者更重要。这些结果对肠道菌群变化在解释体重减轻和代谢改善方面的整体贡献提出了质疑。然而，我们发现细菌种类与1年后代谢性状的改善有关。此外，肠道菌群贡献的证据来源于粪便转移实验。将rygb操作的小鼠或人类的粪便转移到无菌小鼠体内，可以获得一些临床改善。11 52然而，在粪便转移后代谢改善或体重减轻幅度方面的影响总是比手术本身观察到的要小得多。总之，这些因素可能表明，尽管肠道微生物群成分可能有助于代谢改善的某些方面，但还涉及许多其他机制。值得注意的是，因果成分的改变可能与激素分泌、胆汁酸可用性的变化有关53或者其他机制9与bs后代谢改善有关。我们的研究还表明，除了增加MGR之外，rygb后肠型的转换可能是改善代谢结果的一个重要特征。
当观察MGS剖面时，AGB引起了一些重大的修改，其中一些与rygb后看到的方向相反。与RYGB相比，AGB仅限制食物摄入，诱导体重减轻，对消化道生态或激素变化的影响有限。8袖胃切除术12已被证明能显著改变肠道菌群。rygb后，9个MGS显著增加，2个MGS在M12时下降，但与临床变量和基线MGR相关的MGS不相似。这表明由消化生理的外科改变引起的肠道微生物群的特定开关。9在rygb后发生变化的MGS中，h . hathewayi(厚壁菌门Clostridiales成员)与改善躯干脂肪量和HbA1c有关。该物种以前没有与代谢性疾病联系起来，但与败血症有关，在血液中增加。55Alistipes shahii并与代谢改善相关，证实了先前的数据。50rygb后有两个物种显著减少，包括a . hadrus丁酸酯一种产生丁酸盐的物种当将该物种的一个菌株添加到结肠炎诱导的啮齿动物模型中时，它加剧了疾病的严重程度，并伴有严重的生态失调。56相反，在健康小鼠中添加这种菌株显示出有利的结果。这些观察结果表明，特定的菌株可能与不良后果相关，当存在于一个非生物菌群。
BS显著调节了30种代谢物，其中一些与MGS变化和临床改善相关。手术后甘氨酸增加与先前观察到的肥胖患者bs后尿代谢组甘氨酸水平增加一致。57与瘦人相比，甘氨酸减少肥胖。58我们发现乙酰甘氨酸与改善肥胖有关h . hathewayi这与糖化血红蛋白有关。乙酰甘氨酸与T2D发病风险降低有关59；因此，我们可以假设rygb后乙酰甘氨酸水平的升高可能与bs后健康状况的改善和T2D发病率的降低/T2D缓解有关。8最后，在这些改善胰岛素抵抗的bs后患者中，我们观察到支链氨基酸的减少，这与支链氨基酸(BCAA)增加与胰岛素抵抗之间的已知关系相似。39
我们承认我们的研究存在一些局限性。我们显示了MGS、代谢物和临床代谢和肥胖表型之间的许多关联，这些关联应该在体外或无菌小鼠模型中进一步测试。然而，我们研究的优势在于使用多组数据进行高通量分析，这些数据来自于bs后不同动力学时间点随访的高表型受试者。此外，我们可以获得独立的队列，在那里我们可以重复我们的发现。我们还显示，MGR在1年内增加，然后在5年内进一步稳定。另一个限制是缺乏可用的食物摄入量数据。然而，在bs后1个月和3个月，AGB组和RYGB组在总热量、脂类或碳水化合物摄入量方面的食物减少没有差异，143个月和12个月时袖和RYGB之间也没有变化。16因此，我们不认为在bs前以及bs后1年观察到的MGR或微生物群特征的差异源于两个手术组之间的饮食差异。
综上所述，重度肥胖以极低的MGR为特征。此外，低MGR以特定的MGS特征为特征，该特征与临床特征有关，如内脏脂肪、脂肪细胞肥大、代谢和炎症后果。我们发现了与MGR降低相关的新的宏基因组特征、功能修饰和血清代谢物，并证明这四种肠型也存在于严重肥胖中。目前尚不清楚这种低MGR是肥胖及其持续时间的原因还是结果，但它代表了肠道微生物群改变的良好生物标志物，最终对患者分层有用。与宿主遗传相比，饮食和肥胖等生活方式因素在很大程度上解释了微生物组组成的变异性，60但这需要在严重肥胖中加以解释。在BS后，观察到肠型改变，但大多数患者的MGR仍然非常低，尽管消化道发生了改变，临床有重大改善。粪便转移实验等干预措施显示，基线时MGR较低的代谢综合征患者MGR增加，代谢改善。61因此，这项工作的一个视角是在BS干预之前或期间使用旨在恢复肠道微生物生态系统的策略，并研究这些干预措施是否可以进一步改善BS后的MGR和/或临床结果。
致谢
作者要感谢Valentine Lemoine女士招募患者和Florence Marchelli博士，她为患者的临床和生物学数据收集和数据库的建立做出了贡献。作者感谢Jean-Michel Oppert教授和Christine Poitou教授为招募病人和Pitié-Salpêtrière医院营养部门的辅助人员所做的贡献。这项调查是在人类营养临床中心(巴黎-法兰西岛)进行的。作者感谢蒂莫西·斯沃茨对手稿的英文审阅。
参考文献
脚注
JA-W、EP和EB贡献相同。
贡献者JA-W和KC构想了这项研究。JA-W、EP和KC共同起草稿件，并对稿件的最终内容负主要责任。EP、EB、JA-W、EOV、J-DZ、MCD、BDK对数据进行分析，进行统计检验，并绘制表格和图表。JLB和J-MC进行了减肥手术。NP、ELC、FL、SDE和JD生成宏基因组数据，确定微生物组组成。FI和LH生成代谢组学数据。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。
资金该项目得到了“临床研究计划”的支持(PHRC Microbaria AOM10285/P100111 to KC)。JA-W获得了来自Appert研究所，Nestlé研究和Aviesan国家生命科学联盟santé ITMO santé publique的资助。合作伙伴获得了欧盟第七框架计划(FP7)的资助，用于在资助协议health - f1 -2012-305312 (MetaCardis)下的研究、技术开发和演示，以及法国“avenir”投资基金和MetaGenoPolis资助anr -11- dpbbs -0001。临床调查在Pitié-Salpêtrière医院人类营养研究中心(CRNH Ile de France)进行。
相互竞争的利益没有宣布。
病人的同意不是必需的。
伦理批准获得Pitié-Salpêtrière医院研究伦理委员会(CPP Ile-de-France)的伦理批准。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。
调整通知这篇文章在Online First发表后已被更正。Lyamine Hedjazi的名字已被更正。