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炎症性肠病
原始研究
中性粒细胞中的CARD9可以预防结肠炎，并控制线粒体代谢和细胞存活
  1. 卡米尔·丹纳1，2，3.，
  2. 克洛伊Michaudel1，3.，
  3. Jurate Skerniskyte4，
  4. 朱利安Planchais1，3.，
  5. Aurelie Magniez1，3.，
  6. Allison阿古斯1，3.，
  7. 中,米歇尔1，3.，
  8. 布鲁诺喇嘛1，3.，
  9. 格雷戈里·达·科斯塔1，3.，
  10. 玛德琳Spatz1，3.，
  11. Cyriane Oeuvray2，3.，
  12. 克洛伊Galbert2，3.，
  13. 马克西姆地方1，3.，
  14. Yazhou王1，3.，
  15. 亚莉克希亚Lapiere1，3.，
  16. 娜塔莉Rolhion2，3.，
  17. 塔蒂阿娜Ledent2，
  18. 塞德里克Pionneau5，
  19. Solenne Chardonnet5，
  20. Floriant Bellvert6，
  21. Edern Cahoreau6，
  22. 含有杏仁的巧克力6，
  23. 拉斐尔·罗斯·阿Arguello7，
  24. 卡罗尔Peyssonnaux8，
  25. Sabine路易8，
  26. 马赛厄斯·理查1，3.，
  27. 菲利普Langella1，3.，
  28. Jamel El-Benna9，
  29. Benoit Marteyn4，10，11，
  30. 哈利科尔1，2，3.
  1. 1Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, Micalis研究所，案例、法国
  2. 2索邦大学Université， INSERM UMRS-938，圣安东尼研究中心，CRSA, AP-HP, Hôpital圣安东尼，服务中心Gastroentérologie，f - 75012巴黎、法国
  3. 3.巴黎微生物医学中心(PaCeMM，巴黎、法国
  4. 4CNRS, UPR 9002, Université de Strasbourg，生物研究所Moléculaire et Cellulaire，建筑等Réactivité de l'ARN，斯特拉斯堡、法国
  5. 5索邦大学Université， INSERM, UMS PASS, Plateforme Postgénomique de la Pitié Salpêtrière (P3S)，巴黎、法国
  6. 6metatul - metabohub，国家代谢组学和通量组学基础设施(ANR-11INBS-0010)，31077年图卢兹、法国
  7. 7埃克斯马赛大学，法国国家科学研究中心，法国INSERM, CIML，马赛免疫学中心，马赛、法国
  8. 8科钦研究所，INSERM，法国国家科学研究中心，Université巴黎，卓越实验室GR-Ex，巴黎、法国
  9. 9Université de Paris, INSERM-U1149, CNRS-ERL8252，炎症研究中心(CRI)，炎症卓越实验室，Faculté de Médecine Xavier Bichat，巴黎、法国
  10. 10斯特拉斯堡大学高等研究院(USIAS)，斯特拉斯堡、法国
  11. 11巴斯德研究所，Université de Paris, Inserm 1225 Unité de Pathogenèse des Infections Vasculaires, 28 rue du Dr. Roux，75724巴黎Cedex 15、法国
  1. 对应到Camille Danne博士，Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, Micalis研究所，Jouy-en-Josas，法国;camille.danne在}{gmail.com;哈里·索科尔博士;harry.sokol在{}aphp.fr

摘要

目标炎症性肠病(IBD)是遗传易感性、肠道菌群失调和环境因素共同作用的结果，导致胃肠道免疫反应和慢性炎症的改变。Caspase招募域9 (Card9)，是IBD易感基因之一，已被证明可以预防肠道炎症和真菌感染。然而，参与CARD9抗炎症保护作用的细胞类型和机制仍然未知。

设计我们使用右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导和过继转移性结肠炎模型，在完全和条件CARD9敲除小鼠中发现哪些细胞类型在CARD9保护表型中起作用。的影响Card9通过真菌感染的体内模型和各种功能分析评估中性粒细胞功能的缺失，包括终点稀释试验、流式细胞仪凋亡试验、蛋白质组学和实时生物能量谱分析(海马)。

结果淋巴细胞并没有本质上参与CARD9对结肠炎的保护作用。中性粒细胞中表达CARD9，但上皮细胞或CD11c+细胞中不表达CARD9，可预防dss诱导的结肠炎。在CARD9缺失的情况下，线粒体功能障碍增加线粒体活性氧的产生，通过凋亡导致中性粒细胞过早死亡，特别是在氧化环境中。组织中功能性中性粒细胞的减少可能解释了真菌的遏制能力受损和对肠道炎症的易感性增加。

结论这些结果为CARD9在中性粒细胞线粒体功能中的作用及其在肠道炎症中的参与提供了新的见解，为针对中性粒细胞的新治疗策略铺平了道路。

  • 炎症性肠病
  • 肠道炎症
  • 胃肠免疫反应
  • Ibd -遗传学
  • 细胞凋亡

数据可用性声明

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2022-326917

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    关于这个话题我们已经知道了什么

    • 在炎症性肠病(IBD)中，免疫反应的改变导致加重和慢性肠道炎症。

    • Caspase招募域9 (Card9)，是IBD易感基因之一，对肠道炎症和真菌感染具有保护作用;但其中涉及的细胞类型和细胞机制仍然未知。

    这项研究补充了什么

    • 不同敲除小鼠的中性粒细胞中均有CARD9表达，而淋巴细胞、上皮细胞和CD11c中均无CARD9表达+细胞，防止肠道炎症。

    • 在缺乏CARD9的情况下，中性粒细胞通过凋亡过早死亡，这是由于线粒体功能障碍，产生过多的线粒体活性氧。

    • 中性粒细胞的生存缺陷可能解释了肠道炎症和真菌感染的易感性增加的背景下Card9体内缺乏。

    这项研究如何影响研究、实践或政策

    • 了解CARD9和中性粒细胞在慢性炎症中的作用可能会导致针对各种复杂疾病的这些关键免疫细胞的创新治疗策略。

    简介

    炎症性肠病(IBD)是遗传易感性、肠道菌群失调和环境因素共同作用的结果，导致胃肠道免疫反应和慢性炎症的改变。1 2特别是免疫系统的固有隔室参与了IBD的发展，对树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞起作用。3 - 6中性粒细胞是先天性免疫最丰富和最重要的介质之一，是专业的吞噬细胞，可引起急性炎症反应，并作为抵御入侵病原体的第一道防线。7 8中性粒细胞功能受损可能导致病原体清除受限，并引发过度淋巴细胞激活的慢性炎症反应。患有先天性中性粒细胞功能障碍的患者，如慢性肉芽肿性疾病(CGD)，通常会出现ibd样表型。9 - 12此外，在IBD患者的中性粒细胞中观察到功能缺陷，包括趋化性、迁移、吞噬或活性氧(ROS)产生受损。4个5

    CARD9是众多IBD易感基因之一，编码一种整合模式识别受体下游信号的适配器蛋白。13-18特别是CARD9通过c型凝集素感应参与宿主对真菌的防御。19日20人类的CARD9多态性与多种易感性有关，包括IBD，21而功能缺失突变与侵袭性真菌感染有关，这些真菌感染是由诸如白色念珠菌．21 - 24日CARD9被证明介导其保护功能，至少部分是通过诱导适应性Th17细胞反应。22 23 25Card9−−/由于IL-22的产生受损，小鼠更容易患结肠炎，并且肠道驻留真菌的负荷增加。25事实上，CARD9会影响肠道菌群的组成和功能，改变抗炎微生物代谢产物的产生。26日27日然而，参与CARD9对肠道炎症保护作用的细胞类型仍然未知。

    在这项研究中，我们发现CARD9在中性粒细胞中表达，但在上皮细胞或CD11c+细胞如树突状细胞中不表达，可保护小鼠免受葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎。CARD9的缺失会影响中性粒细胞抑制真菌传播的能力，特别是通过损害中性粒细胞线粒体功能和存活。的确,Card9缺失诱导线粒体的基础过度激活，增加线粒体ROS (mtROS)的生成并导致中性粒细胞凋亡。这些结果为CARD9在中性粒细胞线粒体功能中的作用及其在肠道炎症中的后果提供了新的见解。

    结果

    淋巴细胞没有内在的作用Card9-/-易患结肠炎

    此前报道CARD9主要表达于髓系细胞，尤其是树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞。14 28通过对C57BL/6小鼠各器官的qRT-PCR分析，我们证实了这一点Card9主要在骨髓、脾脏和远端小肠(回肠)等免疫器官中表达，但在近端和中端小肠、盲肠、结肠、胃和肝脏中基线表达较低，在Card9-/-组织(在线补充图S1A)．western-blot结果一致显示，在WT小鼠骨髓、脾脏和远端小肠中CARD9蛋白表达(在线补充图S1B)．来解剖Card9在细胞水平上，我们从WT小鼠的脾脏和骨髓中筛选出免疫细胞群。Card9在中性粒细胞中高度表达(Ly6G+CD11b+细胞)，巨噬细胞(CD11b .+F4/80+细胞),CD11c+细胞，包括树突状细胞和单核细胞(CD11b)嗨F4/80+细胞);但在先天或适应性淋巴细胞(CD3)中表达较低+细胞受体γδ+淋巴样细胞，CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞，CD3-CD19+B细胞)(在线补充图S1C)．因此，CARD9可能在髓系免疫区室中起主要作用。

    Lymphocytes have no intrinsic role in the Card9-/- phenotype in colitis models. (A) Weight and (B) Disease Activity Index (DAI) score of DSS-exposed Rag2-/- or Rag2-/- x Card9-/- mice. (C) Colon length and (D) histological score of colon sections at day 7. Data points represent individual mice. One representative experiment out of three. (E) Representative H&E-stained images of mid-colon cross-sections from DSS-exposed Rag2-/- (left) and Rag2-/- x Card9-/- (right) mice at day 7. Scale bars, 500 µm. (F) Weight of mice receiving naive T cells for adoptive transfer of colitis experiment. Rag2-/- received either WT or Card9-/- lymphocytes. Rag2-/- x Card9-/- mice received WT lymphocytes. Data are mean±SEM of two independent experiments. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 as determined by two-way analysis of variance with Sidak’s post-test (A, B, F) and Mann-Whitney U test (C, D). DSS, dextran sulfate sodium; LT, lymphocytes T.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    淋巴细胞没有内在的作用Card9-/-结肠炎模型中的表型。(A) dss暴露的体重和(B)疾病活动指数(DAI)评分Rag2-/-或Rag2-/-x Card9-/-老鼠。(C)结肠长度和(D)第7天结肠切片的组织学评分。数据点代表单个小鼠。三个有代表性的实验中的一个。(E) dss暴露的结肠中部横切面的代表性h&e染色图像Rag2-/-(左)和Rag2-/-x Card9-/-(右)第7天的小鼠。比例尺，500µm。(F)结肠炎过继转移实验中接受naive T细胞的小鼠体重。Rag2-/-接收WT或Card9-/-淋巴细胞。Rag2-/-x Card9-/-小鼠注射WT淋巴细胞。数据为两个独立实验的均值±SEM。*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001， ****p<0.0001由双向方差分析与Sidak后测(A, B, F)和Mann-Whitney U检验(C, D)确定。DSS，葡聚糖硫酸钠;淋巴细胞T。

    我们小组和其他人之前的研究开始调查Card9在实验性结肠炎的小鼠模型中，显示Card9缺失会增加结肠炎的易感性。25 26 29为了破译淋巴细胞和髓系细胞在肿瘤中的各自作用Card9肠损伤和炎症的易感性，我们首先用DSS诱导结肠炎Rag2-/-而且Rag2-/-xCard9-/-缺乏功能性T细胞和B细胞的小鼠。小鼠在饮用含3% DSS的饮用水7天后被安乐死，因为严重程度已经达到了Rag2-/-xCard9-/-组。事实上，疾病严重程度(由体重减轻、DAI(疾病活动指数)评分、结肠长度和组织学评分定义)在年显著增加Rag2-/-xCard9-/-与小鼠相比Rag2-/-老鼠(图1 a e)．在结肠炎过继转移模型中，其中Rag2-/-缺乏功能性淋巴细胞的小鼠接受WT或T细胞Card9-/-小鼠的结肠炎严重程度无差异(图1 f)，即Card9T细胞的表达不影响结肠炎的易感性。然而，WT转化成T细胞Rag2-/-xCard9-/-与对照组相比，受体小鼠的结肠炎加重Rag2-/-简单KO组，其减重效果显著(图1 f)．这些结果表明Card9虽然不能排除其在肠上皮细胞中的作用，但通过先天免疫室调节其对结肠炎的保护作用。

    Card9在中性粒细胞中表达，但在上皮细胞或CD11c中不表达+细胞，预防结肠炎

    基于这些发现，我们使用cre-lox技术生成了条件KO小鼠，并获得了缺陷的小鼠品系Card9或仅在上皮细胞(VillincrexCard9lox系)，仅表达cd11c的细胞，包括树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞(CD11ccrex . lox)Card9lox系)，或中性粒细胞(Mrp8crexCard9液态氧线)。为了验证其表型，我们从结肠固有层(LP)分离上皮细胞Card9Villincre而且Card9Villinwt小鼠，或使用MACS分离柱分离CD11c+或Ly6G+脾脏或骨髓的细胞片段Card9CD11cwt而且Card9CD11ccre老鼠或Card9Mrp8wt而且Card9Mrp8cre老鼠,分别。我们对这些细胞片段进行了qRT-PCR (在线补充图S2A)，并对Ly6G进行western-blot分析+和Ly6G低/ -分数的Card9WT,Card9-/-，Card9Mrp8wt而且Card9Mrp8cre老鼠(在线补充图S2B)．结果证实Card9删除仅限于预期的单元格类型(在线补充图S2A,B)．Ly6G纯度+CD11b+流式细胞术检测C57Bl/6小鼠骨髓中性粒细胞达到95% (在线补充图S2C)．

    然后，我们在肠道炎症模型中评估了这些新生成的小鼠菌株的易感性。DSS给药7天，随后再停药5天。删除Card9在上皮细胞或CD11c中+细胞不影响小鼠对结肠炎的易感性(图2 a, B而且在线补充图S2D)．但是，删除Card9与WT同窝对照组相比，中性粒细胞增加会加重结肠炎，从第8天开始体重减轻显著增加(图2 c)，第5天的DAI评分(图2 c)和组织学评分(图2 e, F)，以及结肠长度缩短(图2 d)．因此，的表达Card9中性粒细胞在预防肠道炎症方面起着至关重要的作用。髓过氧化物酶(MPO)是一种在中性粒细胞中大量表达的抗微生物酶Card9Mrp8cre相比之下,Card9Mrp8wt第12天的结肠组织，表明中性粒细胞在缺失的情况下更重要的存在或激活Card9（图2 g)．同样，炎症标志物脂脂素(Lcn2)增加了Card9Mrp8cre第12天的结肠组织(图2 h)．

    Card9 expression in neutrophils, but not in epithelial or CD11c+ cells, protects against colitis. (A) Weight and DAI score of DSS-exposed Card9Villinwt or Card9Villincre mice. (B) Weight and DAI score of DSS-exposed Card9cd11cwt or Card9cd11ccre mice. (C) Weight and DAI score of DSS-exposed Card9Mrp8wt or Card9Mrp8cre mice. (D) Colon length, (E) histological score of colon sections and (F) representative H&E-stained images of mid colon cross-sections from DSS-exposed Card9Mrp8wt (left) and Card9Mrp8cre (right) mice at day 12. Scale bars, 500 µm. (G) Myeloperoxidase (MPO) concentration in total colon tissue at day 12. (H) Lipocalin (Lcn2) expression by qRT-PCR in total colon tissue at day 12, normalised to Gapdh. Data points represent individual mice. Data are mean±SEM of three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 as determined by two-way ANOVA with Sidak’s post-test (A–C) and Mann-Whitney U test (D–H). ANOVA, analysis of variance; DAI, Disease Activity Index; DSS, dextran sulfate sodium; ns, not significant.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    Card9在中性粒细胞中表达，但在上皮细胞或CD11c中不表达+细胞，预防结肠炎。(A) dss暴露的体重和DAI评分Card9Villinwt或Card9Villincre老鼠。(B) dss暴露的体重和DAI评分Card9cd11cwt或Card9cd11ccre老鼠。(C) dss暴露的体重和DAI评分Card9Mrp8wt或Card9Mrp8cre老鼠。(D)结肠长度，(E)结肠切片组织学评分，(F) dss曝光的结肠中部横切面代表性h&e染色图像Card9Mrp8wt(左)和Card9Mrp8cre(右)第12天的小鼠。比例尺，500µm。(G)第12天总结肠组织中的髓过氧化物酶(MPO)浓度。(H)脂脂素(Lcn2)在第12天的全结肠组织中进行qRT-PCR表达，正常化至Gapdh．数据点代表单个小鼠。数据为三个独立实验的均值±SEM。*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001， ****p<0.0001由双向方差分析与Sidak后验(A-C)和Mann-Whitney U检验(D-H)确定。方差分析;疾病活动指数;DSS，葡聚糖硫酸钠;Ns，不显著。

    这些结果表明Card9缺乏中性粒细胞被有效地招募到炎症组织，但可能表现出功能缺陷，使它们无法充分控制微生物入侵者，从而维持肠粘膜内的炎症。我们之前展示了肠道菌群的总数Card9-/-KO谱系小鼠与WT相比，AhR激动剂的产生发生改变。26然而，没有观察到差异Card9Mrp8wt而且Card9Mrp8cre老鼠(在线补充图S2E)，表明这方面的表型与CARD9在中性粒细胞中的作用没有内在联系。

    Card9缺失会影响发炎结肠中被激活的中性粒细胞的数量

    为了研究WT小鼠在dss诱导炎症过程中的中性粒细胞功能，我们分析了中性粒细胞特异性基因的RNA表达Lcn2，Cxcr2而且S100A8dss诱导结肠炎第0、4、7、9、12和16天的结肠组织(图3一而且在线补充图S2F)．中性粒细胞募集在第9天达到最大值，对应于临床炎症的高峰，并在第16天保持高水平(图3一)．远端结肠的组织学切片证实了这些发现(图3 b)．事实上，炎症在Card9Mrp8cre比在Card9Mrp8wt老鼠(在线补充图S2E)，以及Lcn2，Cxcr2而且S100a8两种基因型在第9天结肠组织中的表达相似(图3 c)排除了中性粒细胞募集缺陷的假设Card9Mrp8cre老鼠。然后，我们检查了招募到结肠LP的免疫细胞群Card9Mrp8crevsCard9Mrp8wt结肠炎第9天的小鼠。令人惊讶的是，虽然两种基因型的中性粒细胞总数相似，但成熟和活化的Ly6G的百分比和计数+CD11b+中性粒细胞在结肠LP中减少Card9Mrp8cre（图3 d, E)．此外，Ly6G和CD11b表面蛋白(两种主要的中性粒细胞成熟和活化标志物)的表达水平在整个中性粒细胞群体中显著降低，如mfi降低所示(平均荧光强度)(图3 f, G)．这些发现提示中性粒细胞存在结构或功能缺陷Card9．

    Card9 deletion affects the number of mature neutrophils in the inflamed colon. (A) Relative expression of Lcn2, Cxcr2 and S1008a in distal colon tissue of C57BL/6 WT mice during a DSS colitis model relative to Gapdh. (B) Representative H&E-stained images of mid colon cross-sections from DSS-exposed WT mice at days 0, 4, 7, 9, 12 and 16 after DSS exposure. Scale bars, 50 µm. (C) Lcn2, Cxcr2 and S100A8 expression in total colon tissue from Card9Mrp8wt and Card9Mrp8cre mice at day 9 of DSS colitis by qRT-PCR analyses, normalised to Gapdh. (D) Representative flow cytometry plots of Ly6G+CD11b+ cells (neutrophils) in the colon lamina propria (LP) of DSS-exposed Card9Mrp8wt and Card9Mrp8cre mice. (E) Percentage and count of Ly6G+CD11b+ cells in the LP of DSS-exposed Card9Mrp8wt and Card9Mrp8cre mice. (F) Ly6G and (G) CD11b expression (MFI, mean fluorescence intensity) of Ly6G+CD11b+ neutrophils from Card9Mrp8wt and Card9Mrp8cre mice. Data points represent individual mice. Data are mean±SEM of two independent experiments. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 as determined by Mann-Whitney U tests. DSS, dextran sulfate sodium.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    Card9缺失会影响发炎结肠中成熟中性粒细胞的数量。(A)相对表达Lcn2，Cxcr2而且S1008a在DSS结肠炎模型中，C57BL/6 WT小鼠远端结肠组织中Gapdh．(B) DSS暴露WT小鼠在DSS暴露后第0、4、7、9、12和16天的结肠中段横切面代表性h&e染色图像。比例尺，50µm。(C)Lcn2，Cxcr2而且S100A8在全结肠组织中的表达Card9Mrp8wt而且Card9Mrp8creqRT-PCR分析DSS结肠炎第9天的小鼠，正常至Gapdh．(D) Ly6G的代表性流式细胞图+CD11b+dss暴露的结肠固有层(LP)细胞(中性粒细胞)Card9Mrp8wt而且Card9Mrp8cre老鼠。(E) Ly6G的百分比和计数+CD11b+dss暴露的LP中的细胞Card9Mrp8wt而且Card9Mrp8cre老鼠。(F) Ly6G和(G) CD11b的表达(MFI，平均荧光强度)+CD11b+中性粒细胞从Card9Mrp8wt而且Card9Mrp8cre老鼠。数据点代表单个小鼠。数据为两个独立实验的均值±SEM。经Mann-Whitney U检验，*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001。DSS，葡聚糖硫酸钠。

    白色念珠菌杀伤能力受到Card9中性粒细胞的缺失

    调查由…引起的缺陷Card9删除在Card9Mrp8cre相比之下,Card9Mrp8wt中性粒细胞，我们用Ly6G进行了几种体外实验+使用MACS分离柱从小鼠骨髓中纯化中性粒细胞。免疫荧光、扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)分析均未发现两种基因型之间有明显的结构差异(在线补充图3)．在功能方面，我们测试了中性粒细胞杀死微生物，特别是真菌的能力，因为CARD9在人类和小鼠的宿主防御真菌感染中起着至关重要的作用。20 25的确,白念珠菌杀伤能力受到很大的影响Card9中性粒细胞缺失(图4)．在96个孔板中进行的终点稀释生存试验显示，其数量是前者的两倍白念珠菌Cfu(菌落形成单位)在与Card9-/-或Card9Mrp8cre中性粒细胞与Card9WT或Card9Mrp8wt控制，分别(图4 a, B)．在琼脂平板上使用cfu计数法进行的杀灭试验证实了这一点Card9Mrp8cre中性粒细胞的杀伤能力受损白念珠菌相比之下,Card9Mrp8wt（图4 c)．Card9中性粒细胞的缺失并不影响吞噬作用本身，使用荧光素异硫氰酸酯(FITC)偶联酶聚糖(来自中性粒细胞)的流式细胞术实验表明酿酒酵母细胞壁)，或活的培养白念珠菌绿色荧光蛋白或大肠杆菌绿色荧光蛋白(在线补充图S4A,B)．此外，我们没有观察到两种基因型中性粒细胞对肉豆蔻酸酯(PMA)(一种pkc依赖的中性粒细胞激活物)或酵素(一种真菌刺激物)反应时活性氧(ROS)产生水平的差异。在线补充图S4C,E)．尽管Card9参与了自噬，30.这一细胞过程似乎不受Card9western-blots上p62和LC3BII/I比值正常显示，中性粒细胞体外缺失(在线补充图4F)．类似地，在我们的条件下，我们没有看到因zymosan反应而删除CARD9的中性粒细胞之间NETosis模式的明显差异(在线补充图4H)．

    Candida albicans killing capacity is impacted by Card9 deletion in neutrophils. (A) Representative images of C. albicans cfu number at the endpoint dilution after infection of Card9WT, Card9-/-, Card9Mrp8wt or Card9Mrp8cre neutrophils for 24 hours, using a microscope (top) or directly showing C. albicans cfu in the 96-well plate, with a photography from above (middle picture) or a scan from below the plate (bottom picture). (B) C. albicans cfu after infection of neutrophils for 24 hours. Cfu counting was performed in 96 well plates using a microscope. Data points represent individual mice. Data are mean±SEM of three independent experiments. (C) C. albicans cfu number after infection of Card9Mrp8wt or Card9Mrp8cre neutrophils for three or 24 hours. Cfu counting was performed after plating on YEPD agar plates. Data are mean±SEM of two independent experiments. (D) Experimental design of antibiotic treatments and C. albicans inoculation in mice treated with 3% DSS. (E) weight, (F) DAI and (G) colon length of DSS-exposed Card9Mrp8wt and Card9Mrp8cre mice after colonisation with C. albicans. (H–K) Fungal burden in the faeces (H), caecal content (I), caecal and colon tissue (J) and liver, spleen and kidney (K) of DSS-exposed Card9Mrp8wt and Card9Mrp8cre mice after colonisation with C. albicans. Data are mean±SEM of two independent experiments. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 as determined by one-way ANOVA with Tukey’s post-test (A), two-way ANOVA with Sidak’s post-test (E, F) and Mann-Whitney test (C, G, I–K). Genta, gentamycin. ANOVA, analysis of variance; DSS, dextran sulfate sodium.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    白色念珠菌杀伤能力受Card9中性粒细胞的缺失。(A)有代表性的图像白念珠菌感染后稀释端点处的Cfu值Card9WT,Card9-/-，Card9Mrp8wt或Card9Mrp8cre中性粒细胞24小时，用显微镜(上)或直接显示白念珠菌96孔板Cfu，上方摄影(中图)或下方扫描(下图)。(B)白念珠菌中性粒细胞感染24小时后的Cfu。用显微镜对96个孔板进行Cfu计数。数据点代表单个小鼠。数据为三个独立实验的均值±SEM。(C)白念珠菌感染后的Cfu值Card9Mrp8wt或Card9Mrp8cre中性粒细胞3到24小时。在YEPD琼脂板上电镀后进行Cfu计数。数据为两个独立实验的均值±SEM。(D)抗生素治疗的实验设计白念珠菌3% DSS处理小鼠接种。(E)体重，(F) DAI， (G) dss暴露结肠长度Card9Mrp8wt而且Card9Mrp8cre小鼠殖民后用白念珠菌．(H - K)暴露dss的粪便(H)、盲肠含量(I)、盲肠和结肠组织(J)以及肝脏、脾脏和肾脏(K)中的真菌负担Card9Mrp8wt而且Card9Mrp8cre小鼠殖民后用白念珠菌．数据为两个独立实验的均值±SEM。*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001， ****p<0.0001，经Tukey后验(A)单因素方差分析、Sidak后验(E, F)双因素方差分析和Mann-Whitney检验(C, G, I-K)确定。Genta,庆大霉素。方差分析;DSS，葡聚糖硫酸钠。

    因此，我们沿着真菌杀灭的轨迹来调查是否存在Card9中性粒细胞的表达导致免疫系统普遍受损，以控制感染。在dss诱导的结肠炎模型中，我们在第7天和第12天的粪便中检测到真菌/细菌DNA总数略有但不显著的增加Card9Mrp8cre相比之下,Card9Mrp8wt老鼠(在线补充图S4G)．这些数据表明能力的降低Card9Mrp8cre小鼠在发炎的肠道中抑制真菌的扩张。然而，由于SPF级小鼠菌群中的真菌丰度非常低，这种影响可能很难指出。因此，为了进一步揭示潜在的表型，我们在用广谱抗生素和抗真菌鸡尾酒治疗的小鼠中诱导结肠炎，并用白念珠菌增加肠道真菌负荷(图4 d)．结肠炎严重程度的增加Card9Mrp8cre小鼠维持在这种环境下(图4比)．白念珠菌盲肠内容物(图4 h,我)、结肠及盲肠组织(图4 j)Card9Mrp8cre小鼠肝脏、脾脏和肾脏的cfu数量均明显高于对照组Card9Mrp8wt老鼠(图4 k)．这些结果表明Card9在中性粒细胞中的表达对控制发炎肠道中的真菌负荷至关重要，直接易位白念珠菌从肠道到肝脏，并避免其全身传播。

    没有Card9通过增加凋亡影响中性粒细胞存活

    目的:探讨脑功能受损的机制Card9Mrp8cre杀死中性粒细胞白念珠菌尽管存在完整的吞噬、自噬和ROS产生，我们使用AnnexinV-FITC检测结合活/死染色的流式细胞仪研究了中性粒细胞的存活率(图5)．AnnexinV显示正在发生的细胞凋亡，而活/死细胞仅染色可渗透的死亡细胞。有趣的是，在37℃孵育1小时后，Card9Mrp8cre中性粒细胞AnnexinV-FITC MFI明显升高Card9Mrp8wt中性粒细胞(图5 a, B)．一致地，凋亡百分比增加(Q1, AnnexinV+LD-)和死亡(晚期凋亡/坏死)中性粒细胞(Q2, AnnexinV .+LD+)，活中性粒细胞减少(Q4, AnnexinV-LD-)，以观察Card9Mrp8cre基因型(图5 c)．此外，CD62L标记物(细胞激活时丢失的一种表面蛋白)的表面表达减少Card9Mrp8cre， CD62L的比例较低+细胞和更高比例的CD62L-细胞(图5 d)．这些结果表明过度的基底激活Card9Mrp8cre相比之下,Card9Mrp8wt中性粒细胞。得到了类似的结果Card9-/-相对于Card9WT中性粒细胞(在线补充图S5A-D)，证实了Card9中性粒细胞存活。

    The absence of Card9 impacts neutrophils survival by increasing apoptosis. (A) Representative flow cytometry plots of Ly6G+CD11b+ neutrophils purified from bone marrow of Card9Mrp8wt (left) and Card9Mrp8cre (right) mice, co-stained with AnnexinV and a Live/Dead marker. (B) AnnexinV MFI of Ly6G+CD11b+ neutrophils from Card9Mrp8wt and Card9Mrp8cre mice, incubated for 1 hour at 37°C. (C) Percentage of apoptotic neutrophils (Q1: AnnexinV+LD- cells), dead (late apoptotic/necrotic) neutrophils (Q2: AnnexinV+LD+ cells) and viable neutrophils (Q4: AnnexinV-LD- cells) among the Ly6G+CD11b+ population. (D) Percentage of CD62L+ and CD62L- neutrophils among the Ly6G+CD11b+ population. Data represent one out of two independent experiments. (E) Histogram representing Gene Ontology biological processes significantly enriched among proteins downregulated (blue) or upregulated (red) in Card9Mrp8cre compared with Card9Mrp8wt neutrophils in the unstimulated condition. (F) Morpheus heat-map representing mitochondria-related proteins significantly downregulated or upregulated in Card9Mrp8cre compared with Card9Mrp8wt neutrophils in the unstimulated condition. (E, F) Obtained from proteomics data analysis. *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001 as determined by Mann-Whitney U test (B) and two-way ANOVA with Sidak’s post-test (C–D). ANOVA, analysis of variance; MFI, mean fluorescence intensity.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    没有Card9通过增加凋亡影响中性粒细胞存活。(A) Ly6G的代表性流式细胞术图+CD11b+从骨髓中纯化的中性粒细胞Card9Mrp8wt(左)和Card9Mrp8cre(右)小鼠，用AnnexinV和活/死标记物联合染色。(B) Ly6G的AnnexinV MFI+CD11b+中性粒细胞从Card9Mrp8wt而且Card9Mrp8cre小鼠，37℃孵育1小时。(C)凋亡中性粒细胞百分比(Q1: AnnexinV+LD-中性粒细胞死亡(晚期凋亡/坏死)(Q2: AnnexinV .+LD+细胞)和活中性粒细胞(Q4: AnnexinV .-LD-细胞)+CD11b+人口。(D) CD62L的百分比+和CD62L-Ly6G中的中性粒细胞+CD11b+人口。数据代表两个独立实验中的一个。(E)表达基因本体生物过程的直方图，在基因中下调(蓝色)或上调(红色)的蛋白质中显著富集Card9Mrp8cre相比之下,Card9Mrp8wt未刺激状态下的中性粒细胞。(F)睡眠热图表示线粒体相关蛋白在Card9Mrp8cre相比之下,Card9Mrp8wt未刺激状态下的中性粒细胞。(E, F)通过蛋白质组学数据分析获得。*p<0.05， **p<0.01， ****p<0.0001由Mann-Whitney U检验(B)和双向方差分析与Sidak后验(C-D)确定。方差分析;MFI，平均荧光强度。

    为了进一步研究，我们对Card9Mrp8crevsCard9Mrp8wt中性粒细胞在37°C孵育1小时后。这种方法揭示了大量与细胞代谢途径相关的蛋白质在两种基因型之间被差异调节。事实上，基因本体论(GO)功能分析表明，在许多细胞代谢过程中，在统计上下调或上调的蛋白质中富集Card9Mrp8cre相比之下,Card9Mrp8wt中性粒细胞(图5 e而且在线补充图S5E)．特别是，我们观察到线粒体蛋白在两种基因型之间的差异调节候选者(图5 f)，表明中性粒细胞线粒体功能受到缺失的影响Card9．

    Card9通过影响线粒体功能控制中性粒细胞存活

    随后，我们在流式细胞术中使用MitoTracker Green(反映线粒体质量)和MitoTracker Red(反映线粒体膜电位)标记分析了中性粒细胞线粒体功能(图6)．在mfi方面没有观察到差异，但我们观察到MitoGreen的百分比显著增加+MitoRed-中性粒细胞(具有功能障碍或代谢不活跃的线粒体)Card9Mrp8cre相比之下Card9Mrp8wt基因型(图6)．四甲基罗丹明甲酯(TMRM)测定评估线粒体膜潜能证实凋亡，代谢应激细胞(TMRM)增加-)Card9Mrp8cre中性粒细胞(图6 b)．这些结果提示Card9Mrp8cre中性粒细胞可能是由于能量代谢的改变。海马技术的实时生物能量剖面分析表明Card9Mrp8cre中性粒细胞在细胞mitto应激试验中具有较高的基础耗氧率(图6 c)，表明氧化磷酸化活性高于Card9Mrp8wt中性粒细胞。基础呼吸和ATP生成速率均显著增加Card9Mrp8cre中性粒细胞(图6 d)．此外，海马实时ATP速率实验证明了这一点Card9Mrp8cre中性粒细胞线粒体ATP (mitoATP)的生成速率增加，而糖酵解ATP (glycoATP)的生成速率仅略有下降，这可以从ATP速率指数和能量图(图6 e)．海马糖酵解速率试验证实，海马糖酵解速率的基础细胞外酸化率有中度降低Card9Mrp8cre中性粒细胞(在线补充图S6A)．然而，对中性粒细胞上清培养24小时的代谢组学分析显示，乳酸产量下降，导致乳酸/葡萄糖比降低Card9Mrp8cre中性粒细胞(在线补充图S6B)．当我们比较Card9WT和Card9-/-上述测定中的中性粒细胞(在线补充图S6C-E)．因此,Card9中性粒细胞的缺失诱导线粒体的过度激活，并倾向于降低糖酵解活性，这是正常中性粒细胞的主要能量来源。用2DG(2-脱氧- d -葡萄糖)阻断糖酵解可增加细胞凋亡率Card9Mrp8wt但不是Card9Mrp8cre中性粒细胞;说明糖酵解对Card9Mrp8wt比Card9Mrp8cre中性粒细胞(图6 f(左)。相反，用寡菌a阻断线粒体呼吸链可增加细胞凋亡率Card9Mrp8cre但不是Card9Mrp8wt中性粒细胞，证明了线粒体作为能量来源的关键作用Card9Mrp8cre中性粒细胞(图6 f,对吧)。因此，与Card9Mrp8wt中性粒细胞主要依靠糖酵解作为能量来源，Card9Mrp8cre中性粒细胞呈现代谢改变，与功能失调状态相关的线粒体过度激活，导致细胞凋亡。事实上，我们通过MitoSOX染色显示，线粒体ROS (mtROS)的产生增加Card9Mrp8cre相比之下,Card9Mrp8wt中性粒细胞(图6克(左)。2-DG处理增加了这种差异，因为线粒体呼吸被促进了(图6克,对吧)。相反，用寡霉素阻断线粒体呼吸可减少两者之间的差异Card9Mrp8cre而且Card9Mrp8wt中性粒细胞(图6克,对吧)。这些结果表明，线粒体呼吸的增加Card9Mrp8cre中性粒细胞产生增加的mtROS，细胞凋亡的主要决定因素。31肠道炎症与高度氧化应激有关。评价氧化应激对小鼠表型的影响Card9Mrp8cre中性粒细胞，H2O2．观察到细胞凋亡和坏死率增加Card9Mrp8cre中性粒细胞在氧化应激下较基础条件下更强(图6 h)．这些结果表明，CARD9在中性粒细胞生存能力中的作用，特别是在氧化条件下，是通过对线粒体功能的影响来介导的。与年龄匹配和性别匹配的IBD对照患者和健康受试者相比，携带CARD9单核苷酸多态性(rs10781499，纯合子状态)的IBD患者的血液中性粒细胞死亡率升高。图6我)．

    Card9 controls neutrophil energetic metabolism by affecting mitochondrial function. (A) Representative flow cytometry plots and precentages of MitoGreen+MitoRed- cells (corresponding to cells with dysfunctional mitochondria) among Ly6G+CD11b+ neutrophils. Neutrophils were purified from the bone marrow of Card9Mrp8wt or Card9Mrp8cre mice, and incubated for 1 hour at 37°C. (B) Representative flow cytometry plots and percentages of TMRM- cells (corresponding to cells with dysfunctional mitochondria/apoptotic or metabolically inactive cells) among Ly6G+CD11b+ neutrophils. (C) Oxygen consumption rate (OCR) of Card9Mrp8wt and Card9Mrp8cre neutrophils measured during a Seahorse Cell Mito Stress assay. (D) Basal respiration (late rate measurement before oligomycin injection (t3) - non-mitochondrial respiration rate (t12)) and ATP production rate (late rate measurement before oligomycin (ATP synthase blocker) injection (t3) – minimum rate measurement after oligomycin injection (t6) obtained from the Seahorse Cell Mito Stress assay. (E) ATP rate index and energetic map of Card9Mrp8wt and Card9Mrp8cre neutrophils obtained from the Seahorse Real-time ATP rate assay. (F) Percentage of apoptotic cells among the Ly6G+CD11b+ neutrophil population of Card9Mrp8wt and Card9Mrp8cre genotypes after treatment with 2-DG 10 mM (left) or oligomycin 1.5 μM (right) for 1 hour. (G) Representative flow cytometry plots and precentages of MitoSOXhigh cells (corresponding to cells with high mitochondrial ROS) among Card9Mrp8wt and Card9Mrp8cre neutrophils incubated for 1 hour at 37°C. (H) Percentage of apoptotic and necrotic cells among the Ly6G+CD11b+ neutrophil population of Card9Mrp8wt and Card9Mrp8cre genotypes after addition of H2O2 0.01 mM for 1 hour to increase oxydative stress. (I) Death rate of human blood neutrophils from patients with IBD carrying the CARD9 single-nucleotide polymorphism most commonly associated with IBD (rs10781499, homozygous state, n=8) and age-matched and sex-matched control patients with IBD (n=11) and healthy subjects (n=6). Data are mean±SEM of at least two independent experiments. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 as determined by Mann-Whitney test (A, B, D, E, I) or two-way ANOVA with Sidak’s post-test (F, G, H). Norm. Unit, normalised unit; FCCP, Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone; Rot/AA, Rotenone/AntimycinA; 2DG, 2 deoxy-glucose; OligoA, oligomycinA. ANOVA, analysis of variance; IBD, inflammatory bowel disease; ROS, reactive oxygen species.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    Card9通过影响线粒体功能控制中性粒细胞能量代谢。(A) MitoGreen的代表性流式细胞仪图和百分率+MitoRed-细胞(对应于线粒体功能异常的细胞)+CD11b+中性粒细胞。中性粒细胞从骨髓中纯化Card9Mrp8wt或Card9Mrp8cre在37℃下孵育1小时。(B) TMRM的代表性流式细胞术图及百分比-细胞(对应于线粒体功能失调的细胞/凋亡或代谢不活跃的细胞)+CD11b+中性粒细胞。(C)耗氧率(OCR)Card9Mrp8wt而且Card9Mrp8cre海马细胞水渡应激试验中测量的中性粒细胞。(D)基础呼吸(注射寡霉素前的晚期速率测量(t3) -非线粒体呼吸速率(t12))和ATP产生速率(注射寡霉素(ATP合酶阻滞剂)前的晚期速率测量(t3) -注射寡霉素后的最小速率测量(t6)来自海马细胞Mito应激试验。(E) ATP速率指数和能量图Card9Mrp8wt而且Card9Mrp8cre海马实时ATP速率试验获得的中性粒细胞。(F) Ly6G中凋亡细胞的百分比+CD11b+中性粒细胞群Card9Mrp8wt而且Card9Mrp8cre2-DG 10 mM(左)或寡霉素1.5 μM(右)处理1小时后的基因型。(G) MitoSOX的代表性流式细胞仪图和百分率高细胞(对应线粒体ROS高的细胞)Card9Mrp8wt而且Card9Mrp8cre中性粒细胞在37℃孵育1小时。(H) Ly6G中凋亡细胞和坏死细胞的百分比+CD11b+中性粒细胞群Card9Mrp8wt而且Card9Mrp8cre添加0.01 mM H2O2 1小时后增加氧化应激。(I)携带与IBD最常见相关的CARD9单核苷酸多态性的IBD患者(rs10781499，纯合子状态，n=8)、年龄匹配和性别匹配的IBD对照患者(n=11)和健康受试者(n=6)的人类中性粒细胞死亡率。数据为至少两个独立实验的均值±标准差。*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001， ****p<0.0001由Mann-Whitney检验(A, B, D, E, I)或双向方差分析与Sidak后验(F, G, H)确定。Norm。单位，归一化单位;羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙;腐烂/ AA,鱼藤酮/ AntimycinA;2DG, 2脱氧葡萄糖;OligoA oligomycinA。方差分析; IBD, inflammatory bowel disease; ROS, reactive oxygen species.

    讨论

    总之，这项研究表明，在缺乏CARD9的情况下，中性粒细胞中的线粒体功能障碍会通过凋亡导致过早死亡，尤其是在氧化环境中。肠道中功能性中性粒细胞的减少影响真菌的遏制，增加肠道炎症的易感性。CARD9多态性与IBD相关。小鼠研究表明CARD9对宿主防御和肠道屏障的贡献，特别是通过IL-22的产生和肠道微生物群代谢活动的调节。25日26日然而，CARD9在疾病发病机制中的作用尚未在细胞水平上阐明。我们的研究表明Card9中性粒细胞的缺失，与上皮细胞或CD11c相反+细胞，增加了dss诱导的结肠炎的易感性。因此，我们重点研究了CARD9表达在中性粒细胞功能中的作用。事实上，中性粒细胞已经在不同的IBD和真菌感染模型中进行了研究，但它们对发病机制的直接贡献以及CARD9在这些机制中的作用仍然知之甚少。4 5 32 33

    人CARD9缺陷导致中性粒细胞真菌杀伤受损，导致抑制侵袭性真菌感染的选择性缺陷。34在人类和小鼠中，CARD9在小胶质细胞中用于中性粒细胞招募和控制中枢神经系统中的真菌感染。35 36CARD9信号也参与中性粒细胞吞噬和NETosis(中性粒细胞细胞外陷阱)功能，提高小鼠的生存到致死剂量白念珠菌．37此外，中性粒细胞中CARD9的表达促进小鼠自身抗体诱导的关节炎和皮炎，38以及中性粒细胞性皮肤病小鼠模型的炎症水平。39根据这些研究，我们发现Card9缺失影响中性粒细胞体外和体内杀死真菌的能力，但我们发现对中性粒细胞结构、ROS产生、自噬、吞噬或NETosis没有影响。我们还没有研究CARD9在趋化性中的作用，因为在CARD9缺陷患者的真菌感染的情况下，中性粒细胞固有的趋化性没有受到影响。24在dss引起的结肠炎中，Card9中性粒细胞不足并不影响它们向结肠的募集，但会减少成熟中性粒细胞的数量。我们不认为抗真菌功能受损解释了结肠炎易感性的增加，而是揭示了card9缺陷的中性粒细胞具有主要的功能缺陷。事实上，我们发现CARD9的缺失会增加小鼠和人类中性粒细胞的死亡率。这种过早死亡是由线粒体过度激活和mtROS产生增加引起的。事实上，mtROS是线粒体呼吸的副产物，是细胞凋亡的主要决定因素。31其他CARD蛋白通过CARD-CARD结构域相互作用介导凋亡信号。13除了介导炎症外，CARD蛋白家族成员CARD9最近被证明在氧化应激下抑制心肌细胞线粒体依赖的凋亡。40在这里，我们发现CARD9在中性粒细胞中介导线粒体功能和凋亡，特别是在氧化环境中。有趣的是，在活跃的UC背景下，在人类中观察到线粒体功能障碍。41需要进一步的研究来充分阐明线粒体过度激活对中性粒细胞功能的影响，特别是在体内。的影响Card9中性粒细胞线粒体功能可能不能完全解释易感性的增加Card9Mrp8cre小鼠DSS结肠炎。此外，其他类型的细胞也可能参与Card9-/-小鼠表型，解释影响Card9微生物群代谢活性的缺失，因为我们表明这并不依赖于中性粒细胞。25日26日

    与其他白细胞相比，中性粒细胞含有很少的线粒体，主要依靠糖酵解产生ATP，这对执行它们指定的任务至关重要。这允许在低氧环境中产生能量，并为中性粒细胞效应器功能提供氧气。42因此，中性粒细胞对糖酵解的依赖可能是一种适应，以允许氧气用于抗微生物反应，而不是进入氧化磷酸化。42在本研究中，我们发现在CARD9缺失的情况下，线粒体过度激活会导致中性粒细胞通过凋亡和抗微生物功能的丧失而过早死亡。DSS和抗cd40结肠炎模型添加抗ly6g抗体，特异性消耗中性粒细胞，表明中性粒细胞的缺乏强烈加剧肠道炎症并影响小鼠生存。43在人类中，嗜中性粒细胞减少症与严重的肠道炎症有关，在嗜中性粒细胞减少性小肠结肠炎的情况下44和CGD患者表型中的ibd样表型45例如。中性粒细胞中过度的氧化磷酸化和线粒体ATP生成也会损害周围组织并加剧炎症。这可以解释在缺乏营养的情况下，肠道结肠炎的易感性增加Card9特别是在炎症环境中，中性粒细胞的活性通常受到低氧压力的严格控制。在人类中，由于糖酵解功能障碍和能量稳态受损，“糖原储存病Ib型”诱导中性粒细胞功能缺陷。46这种疾病与ibd样表型相关，突出了中性粒细胞代谢在肠道健康中的重要性。46个47免疫代谢是一个核心概念，因为免疫和代谢以两种方式相互影响:(1)能量代谢影响免疫功能，这在淋巴细胞和巨噬细胞中得到了充分的证明，48但中性粒细胞并非如此;(2)我们发现一种在先天免疫中起作用的蛋白质CARD9也可以影响细胞代谢。需要进一步的研究来了解CARD9如何直接或间接地与线粒体功能相互作用。

    中性粒细胞与各种疾病有关，包括感染、心血管疾病、炎症性疾病和癌症，这使它们成为治疗干预的激动人心的靶点。49尽管中性粒细胞在疾病中具有复杂的意义，但根据病理情况，各种治疗方法旨在增强、抑制或恢复中性粒细胞功能。在中性粒细胞活性过高的炎症性疾病中，可以期望将其衰减，尽管可能仍需要保留对微生物的杀伤功能。我们的研究表明，中性粒细胞凋亡的增加并不能缓解肠道炎症，尽管这些细胞已知有助于疾病的发展。最近的研究表明中性粒细胞在表型和功能上存在显著的异质性。49因此，针对特定的亚群可以在不损害宿主防御的情况下衰减中性粒细胞的有害方面。一些中性粒细胞靶向治疗策略已经引起了人们的兴趣，特别是在IBD的背景下，生长因子粒细胞集落刺激因子(G-CSF)具有积极作用。50最近，抗gm - csf自身抗体也显示在克罗恩病发病前数年。51它为许多复杂的病理打开了有希望的选择。

    材料与方法

    老鼠

    Card9-/-，Rag2-/-xCard9-/-，Rag2-/-，Card9loxxMrp8cre,Card9loxxVillincre和Card9loxxCD11ccre小鼠C57BL/6J背景从圣安东尼研究中心获得，并在特定的无病原体条件下安置在IERP (INRAE, Jouy-en-Josas)。动物实验是根据法国当局当地伦理委员会批准的“Comité d’ethique en experimental Animale”(COMETHEA, CEEA45)进行的。

    诱导DSS结肠炎和定植白念珠菌

    给小鼠饮用添加2-3% (wt/vol) DSS (MP Biomedicals)的水，持续5 - 7天(取决于每个实验的结肠炎严重程度)，然后只喝水5天。每天监测动物的体重减轻情况。为白念珠菌小鼠定植时，给予链霉素0.4 mg/mL、青霉素G 300 U/mL和氟康唑0.125 mg/mL图4．

    组织学

    结肠标本固定，石蜡包埋，H&E染色。切片扫描并分析以确定组织学评分(在线补充表S1)．25

    粪便DNA提取及细菌和真菌总数定量

    如前所述提取粪便DNA。26使用Luna Universal qPCR Master Mix (New England Biolabs)对真菌ITS2序列进行定量，使用TaqMan基因表达测定(Life Technologies)对细菌16S rDNA序列进行定量。

    细胞制备和刺激

    用二硫异糖醇(DTT)/乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲液从结肠组织中分离上皮细胞。中性粒细胞使用抗ly6g MicroBeads UltraPure和MACS分离柱(Miltenyi Biotec)从小鼠骨髓中纯化。CD11c+使用anti-CD11c MicroBeads UltraPure和MACS分离柱(Miltenyi Biotec)从小鼠脾脏中纯化细胞。使用BD Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences)进行纯度检查和细胞计数。纯化后中性粒细胞接种于96孔悬浮板(Sarstedt)， RPMI 1640培养基(Gibco, ThermoFisher Scientific)静置30分钟，加入2%热灭活胎牛血清(FBS)、2-DG 10 mM、寡菌cine 1.5μM或H2O2 0.01M, 37℃孵育。如前所述，分离LP免疫细胞。52

    基因表达定量RT-PCR分析

    使用RNeasy Mini Kit (Qiagen)从结肠样本或细胞悬液中分离总RNA，并使用定量逆转录试剂盒(Qiagen)和Luna Universal RT-PCR试剂盒(New England Biolabs)在StepOnePlus仪器(Applied Biosystems)中与特定的小鼠寡核苷酸(在线补充表S2)．我们使用2−ΔΔCt用鼠标定量方法Gapdh作为内源性对照，WT组作为校准器。

    免疫印迹分析。使用Laemmli缓冲液裂解小鼠组织或细胞悬液，加载在SDS-PAGE上，并用抗CARD9 (a -8:sc-374569, Santa Cruz Biotechnology)或β-ACTIN (D6A8, CST)抗体进行分析。

    流式细胞仪，细胞分选和功能分析

    流式细胞仪采用LSR Fortessa X-20 (BD)和细胞分选FACS Aria仪(BD)。细胞凋亡检测，4×105中性粒细胞在Binding Buffer (Miltenyi Biotec)和Live/Dead (Zombie Aqua Fixable, bilegend)中用AnnexinV-FITC染色。对于线粒体分析，将MitoTracker Green和MitoTracker Red FM或MitoSOX Red线粒体超氧化物指示剂分别添加到中性粒细胞中，在MACS缓冲液或PBS中RT处理15分钟(ThermoFisher Scientific)。另外，中性粒细胞与TMRM在RPMI中37°C孵育20分钟(Abcam)。对于吞噬实验，105zymosan-FITC刺激中性粒细胞(50μg/ml, Fluorescein zymosanA BioParticles conjugates, fisheries scientific)，白念珠菌-GFP (MOI1:1)或大肠杆菌-GFP (MOI1:10) 45分钟。细胞表面抗体在MACS缓冲液中染色(在线补充表S2)．

    终点稀释生存试验

    分离的小鼠中性粒细胞在10点播种5细胞/孔在96孔板RPMI+2% FBS中感染白念珠菌(将OD=1的溶液连续稀释四倍(row1, MOI20:1;row2 MOI5:1……)。37°C 24小时后，用尼康TMS倒置显微镜观察菌落，并在最低稀释率下计数(第7-8行)。

    死亡分析

    纯化的中性粒细胞于10时接种于96孔板6细胞/well，并用PBS刺激，白念珠菌(MOI1)或大肠杆菌(MOI10) 90分钟，在37°C。用200μl TritonX100 0.025%溶液清洗裂解细胞。连续稀释镀在YEPD或LB板上。

    Oxydative破裂

    实验在三星LB942阅读器上进行5中性粒细胞置于200µL Hank’s平衡盐溶液(HBSS, ThermoFisher Scientific)和鲁米诺80μM (Sigma)中，并用PMA刺激(0.1µg/mL;Sigma)或调理酵素(20mg /mL酵素A从酿酒酵母;σ)。指数最大相对发光(相对光单位(RLU))计算如下:指数最大相对发光max=((血色素病患者最大相对发光)/(健康供体最大相对发光))×100。或者，加入超氧歧化酶(5单位/mL)和过氧化氢酶A(10单位/mL)来区分总ROS和细胞内ROS的产生。在550 nm处测定吸光度30分钟。

    实时生物能量谱分析

    在XF96细胞外通量分析仪(Seahorse Biosciences)上进行Mito压力测试、糖酵解速率测定和实时ATP测定。小鼠中性粒细胞在2×10进行播种5细胞/孔在RPMI+2% FBS 0.01%聚l -赖氨酸预涂板。静置2小时后，细胞在海马RPMI培养基中洗涤，在37°C无CO2条件下孵育1小时。在分析仪中按规定时间注射寡霉素1.5µM、FCCP 1µM、鱼藤酮+抗霉素0.5µM和2DG 50µM。每次实验结束后进行蛋白质标准化，蛋白质浓度和细胞表型均无明显差异。

    电子显微镜

    用。刺激纯化的中性粒细胞白念珠菌(MOI 2)或大肠杆菌(MOI 10)在37°C下放置1小时，在PBS中清洗并固定。样品制备和SEM/TEM分析在显微镜和成像平台MIMA2 (Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, Jouy-en-Josas, France，https://doi.org/10.15454/1.5572348210007727E12)．

    蛋白质组学

    将5µg蛋白质提取物进行凝胶消化。如前所述进行脱盐。53在nano洗脱- timstof ProLC-MS/MS系统(Bruker)上对肽进行分析。54使用MaxQuant V.1.6.10.43:数据库UP000000589_10090(21 994项，2020年6月17日)分析原始文件。采用ProStar Zero V.1.20.0软件进行数据过滤、归算和统计分析。54虚假发现率(FDR <5% (Pounds法)的蛋白显著，其折叠变化为>1.2。

    核磁共振

    用1D 1H-NMR对200 μ L培养基进行分析。所有核磁共振波谱记录在配备QPCI 5毫米低温探头的Bruker AvanceIII 800MHz光谱仪上。光谱采集和处理使用Bruker Topspin V.4.0软件。在D2O中加入25% TSPd4作为内标，定量葡萄糖和乳酸。

    患者及样本采集

    IBD的诊断由临床、放射学、内窥镜和组织学标准确定。患者特征在在线补充表S3．使用右旋糖酐沉淀和Ficoll密度梯度技术分离人中性粒细胞，并用AnnexinV-FITC (Miltenyi Biotec)和活/死标记(Zombie Aqua Fixable, bilegend)进行染色。数据采用CytoFlex细胞仪(Beckman)采集。

    统计分析

    采用GraphPad Prism V.7软件进行统计分析。

    数据可用性声明

    所有与研究相关的数据都包含在文章中或作为在线补充信息上传。

    伦理语句

    患者发表同意书

    伦理批准

    已获得当地伦理委员会的批准(法兰西岛人身保护委员会，IRB 00003835, Suivitheque研究，注册号2012/05NICB)。参与者在参与研究前均知情同意参与研究。

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    补充材料

    脚注

    • 推特@h_sokol

    • 贡献者CD和HS构思设计研究，进行数据分析，撰写稿件，并共同担任担保人;CD设计并进行了所有实验，除非另有说明;CM、JP、AM、AA、M-LM、BL、GDC、MS、CG、MP、YW、AL为体内、体外实验提供技术支持;JS和BM进行免疫荧光显微镜实验;CéP和SC进行蛋白质组学分析;FB、EC、AR进行代谢组学分析;TL提供小鼠，CO进行基因分型;CaP、SL和JE-B有助于ROS生成测定;RRA提供Scenith试剂盒用于中性粒细胞测试;CD、CM、JP、MLR、PL、NR、JE-B、BM、HS对实验结果进行了讨论。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 患者和公众参与患者和/或公众参与了本研究的设计、实施、报告或传播计划。更多细节请参阅方法部分。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。

    • 补充材料此内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅是作者的意见或建议，不被BMJ认可。BMJ不承担因对内容的任何依赖而产生的所有责任和责任。如果内容包括任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且对因翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏不负责。