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  • 61卷，第3期
  • 婴儿双歧杆菌35624给药诱导人外周血Foxp3 T调节细胞:骨髓和浆细胞样树突状细胞的潜在作用

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肠道微生物群
原文
双歧杆菌属对象35624给药诱导人外周血中的Foxp3 T调节细胞:骨髓和浆细胞样树突状细胞的潜在作用
免费的
  1. Patrycja Konieczna1，
  2. 大卫Groeger2，
  3. 马里奥•齐格勒1，
  4. 雷莫弗雷1，
  5. 露丝Ferstl1，
  6. 费格斯沙3.，
  7. 埃蒙·奎格利3.，
  8. 巴里•吉利2，
  9. 塞兹米·阿克迪斯1，
  10. 利亚姆O’mahony1
  1. 1瑞士过敏和哮喘研究所(SIAF)，苏黎世大学，苏黎世，瑞士
  2. 2爱尔兰科克营养健康有限公司
  3. 3.爱尔兰科克大学的营养药物中心
  1. 对应到Liam O'Mahony博士，SIAF, Obere大街22号，达沃斯广场7270，瑞士苏黎世;liam.omahony在{}siaf.uzh.ch

摘要

背景肠道稳态依赖于对微生物群的免疫耐受。

客观的(1)确定一种益生菌是否能诱导人体内的Foxp3 T细胞;(2)阐明人树突状细胞诱导Foxp3 T细胞的分子机制。

设计随后在人类志愿者中评估细胞因子分泌和Foxp3表达双歧杆菌属对象喂食。将单核细胞来源的树突状细胞(MDDCs)、髓系树突状细胞(mDCs)和浆细胞样树突状细胞(pDCs)体外培养对象的和自体淋巴细胞。分析转录因子表达、共刺激分子表达、细胞因子分泌、视黄酸和色氨酸代谢。

结果志愿者美联储对象的白细胞介素(IL)-10分泌选择性增加，外周血Foxp3表达增强。在体外，mddc、mDCs和pDCs表达吲哚胺2,3-双加氧酶并分泌IL-10，但不表达IL-12p70对象的．MDDC和mDC IL-10分泌依赖于toll样受体(TLR)-2/6，而pDC IL-10分泌依赖于TLR-9。此外，mddc和mDCs表达的RALDH2依赖于TLR-2和DC-SIGN。对象的-刺激的MDDCs、mDCs和pDCs诱导T细胞Foxp3表达。MDDC和mDC诱导Foxp3 T细胞需要TLR-2、DC-SIGN和维甲酸，而pDCs需要吲哚胺2,3-双加氧酶。

结论对象的给人选择性地促进免疫调节反应，这表明这种微生物可能对炎症性疾病患者具有治疗效用。多种模式识别受体和代谢途径之间的交叉对话决定了先天的和随后的T调节细胞的反应对象的．这些发现将营养、微生物群和胃肠道粘膜内耐受性的诱导联系起来。

  • T调节细胞
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  • 胃轻瘫
  • 肠移植
  • 胃排空
  • 肠易激综合症
  • 炎症
  • 组胺
  • 抗菌粘膜免疫
  • 分子免疫学

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2011-300936

数据来自Altmetric.com

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    本研究的意义

    关于这个主题我们已经知道了什么?

    • 共生菌群对肠道稳态很重要。

    • T调节细胞是肠道耐受所必需的。

    • 树突状细胞在肠道内诱导T调节细胞。

    • 小鼠模型显示微生物-树突状细胞相互作用诱导T调节细胞。

    新的发现是什么?

    • 双歧杆菌属对象喂养诱导Foxp3 T细胞和外周血单个核细胞白细胞介素(IL)-10分泌。

    • 对象的受刺激的人树突状细胞诱导分泌Foxp3和IL-10的T细胞。

    • 树突状细胞亚群使用不同的模式识别受体来诱导T调节细胞。

    • 树突状细胞代谢反应(如视黄酸和色氨酸代谢)是必不可少的。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 对象的将包括在介入方法，赋予最大的耐受性免疫调节活性的肠道，以保护对抗胃肠道炎症过程。

    简介

    共生菌群是最佳宿主发育和持续肠道稳态所必需的，这涉及微生物和免疫之间的相互依赖。1 - 3这就要求与病原体相比，对共生生物有区别的反应，以分别确保耐受性和保护性免疫。黏膜耐受的一个特征是Foxp3 T调节细胞的诱导和扩增，它限制了过度的促炎反应。45我们和其他人已经确定了特定的微生物，它们可以选择性地促进小鼠粘膜内的Foxp3极化。6 - 10此外，最近对炎症性疾病(溃疡性结肠炎和过敏)患者的研究表明，喂食特定的治疗性微生物可以增加CD25的比例高T细胞。1112然而，支撑微生物群对T调节细胞影响的体内机制尚不清楚，目前尚不清楚在小鼠系统中获得的机制结果是否也适用于人类。

    在胃肠道粘膜内，维持肠道稳态和耐受性需要多种细胞类型，包括上皮细胞、上皮内淋巴细胞、固有层巨噬细胞和树突状细胞。13特别是髓细胞(mDCs)和浆细胞样树突状细胞(pDCs)都与微生物密切接触，并负责向适应性免疫系统呈递微生物和膳食抗原，从而通过细胞因子和代谢物的产生影响适应性反应的极化。在14到18岁因此，诱导Foxp3 T细胞的决定受到DC模式识别受体(PRRs)激活的显著影响，该受体编程DC基因表达和随后的T细胞极化。19PRR信号通路之间的协调对于诱导适当的DC和T细胞反应是重要的。例如，zymosan识别toll样受体2 (TLR-2)导致维甲酸和白介素(IL)-10分泌导致Foxp3诱导，而dectin-1被zymosan激活导致IL-23分泌和Th17诱导。20.此外，TLR-2激活被证明可以通过traf -1依赖机制抑制皮肤内tlr -3相关的炎症反应。21此外，DC亚群可能使用不同的分子机制来协同诱导T调节细胞。2223

    双歧杆菌longum亚种对象的35624 (对象的)是一种共生微生物，最初从人类胃肠道粘膜中分离出来，并因其调节小鼠和人类炎症反应的能力而被广泛研究。6能力我们选择了这种细菌作为在人类中诱导Foxp3 T调节细胞能力的可能候选者。我们的研究结果表明，体内暴露后，IL-10反应和Foxp3表达显著升高对象的口服。此外，我们还提供了支持这种调节作用的潜在细胞和分子机制的证据，因为人类mDCs和pDCs在体外孵育后都特异性地诱导Foxp3+CD4+细胞对象的．然而，mDCs和pDCs诱导Foxp3的机制不同。mDCs诱导Foxp3 T细胞依赖TLR-2-、DC-SIGN-和维甲酸，而pDCs诱导Foxp3细胞需要吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)。

    材料与方法

    人类研究

    进行了两项健康人类志愿者研究，均获得爱尔兰科克教学医院临床研究伦理委员会的批准。每位潜在符合条件的健康成年志愿者都通过完整的临床病史回顾、体检、血液学和血清化学分析进行评估。任何评估参数的临床显著发现导致该志愿者被排除。在第一项研究中，健康的成年人被随机抽取对象的(n = 10;1×109每天活菌)或安慰剂(n=12;低温保护(没有细菌)8周。在研究完成之前，所有研究人员以及志愿者都对随机化过程保持盲目。第二项研究是在符合上述相同选择标准的健康成年人中进行的，但在这项研究中，所有受试者都被喂食对象的(n = 17;1×109每天活菌)，持续8周。

    在第1天(喂食前)和第56天(喂食后)分离外周血单个核细胞(pmcs)。用CD4-PerCP、CD25-APC、ico - pe、CTLA-4-PE和Foxp3-Alexa Fluor 488 (eBioscience, San Diego, California, USA)单克隆抗体对新分离的pbmc进行染色。重复样本使用FACSCalibur (Becton Dickinson, Oxford, England)进行评估，并使用BD CellQuest软件进行分析。此外，1×106用抗cd3 (5 μg/ml)和抗cd28 (5 μg/ml)抗体刺激pmcs 48 h。利用MesoScale Discovery多重平台同时分析PBMC上清液中的细胞因子水平。

    树突状细胞的分离和培养条件

    树突状细胞实验使用从naïve分离出来的细胞进行对象的健康的志愿者。使用MACS系统(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)分离CD14阳性的人外周血单核细胞。细胞在cRPMI培养基(Invitrogen, Carlsbad, USA)中与1000 U/ml IL-4 (Novartis, Basel, Switzerland)和1000 U/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(PeproTech, London, UK)培养5天，以生成单核细胞来源的树突状细胞(MDDCs)。通过MACS系统分离CD3、CD14和CD19缺失和CD1c阳性选择后的外周血mDCs。使用MACS系统分离CD304，外周血pDCs呈阳性富集。此外，使用抗cd123 FITC (Miltenyi Biotec)进行流式细胞分选获得了高度纯化的pDC种群。采用MACS阴性选择法分离外周血CD4 T细胞。mddc、mDCs和pDCs常规在cRPMI培养基中培养，用菌株刺激或保持不刺激。对于阻断实验，树突状细胞与对照寡核苷酸GCTAGATGTTAGCGT、TLR9拮抗剂寡核苷酸TTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG (Microsynth, Balgach，瑞士)或阻断单克隆抗体:抗tlr2(来自C Kirschning，慕尼黑，德国)、抗dc - sign (AZDN1, Beckman Coulter, Brea，美国)和IgG2B对照抗体(R&D Systems Europe, Abingdon，英国)预孵育30分钟。通过Bio-Plex多重悬浮阵列(Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA)定量细胞因子分泌。

    细菌标记和细胞结合的可视化

    对象的用羧基荧光素二乙酸酯、羧基荧光素琥珀酰亚酯(CFSE) (Invitrogen)染色，而mddc用抗cd11c PE-Cy5联合染色(BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA)。使用多光谱成像流式细胞仪在多个时间点对mddc进行可视化，Image Stream X (Amnis Corporation, Seattle, USA)，并使用IDEAS软件(Amnis Corporation)对图像进行分析。采用流式细胞仪(Gallios系统，Beckman Coulter, Nyon, Switzerland)检测CD80 FITC和CD86 PE (BD Pharmingen)的表达。mddc与cfse染色孵育对象的16小时，然后对象的通过用Lysotracker red DND-99 (Invitrogen)和延长金抗褪色试剂(Invitrogen)中的DAPI染色MDDCs来确定激活溶酶体内的定位。玻片用共聚焦显微镜分析。

    RALDH评估

    在cRPMI中，用细菌(含或不含抑制剂)刺激MDDCs、mDCs和pDCs 16-24小时。使用ALDEFLOUR试剂盒(Aldagen, Durham, USA)测定RALDH活性，流式细胞术观察阳性细胞。在代表性实验中，mddc与pkh26染色孵育对象的以共同定位细菌结合和RALDH诱导。

    HEK-293 TLR-2细胞

    HEK-Blue hTLR-2细胞和HEK-Blue Null1细胞(Invivogen, San Diego, USA)被刺激对象的24小时。两种细胞系均表达NF-κ b诱导的胚胎碱性磷酸酶报告细胞。TLR-2配体Pam3CSK4 (2.5 μg/ml, Calbiochem, Merck KGaA, Darmstadt, Germany)作为阳性对照。

    树突状细胞T细胞共培养

    用试验菌株刺激树突状细胞4小时，并与自体CD4 T细胞以1:40 (mDCs)或1:20 (MDDCs和pDCs)的比例在AIM-V培养基(Invitrogen)中共培养。5天后，用抗cd28(室内生成)、抗cd3 (Orthoclone OKT3, Janssen-Cilag)和抗cd2 (Sanquin，阿姆斯特丹，荷兰)重新刺激细胞。两天后对淋巴细胞进行渗透和CD4、CD25和Foxp3染色(eBioscience)。柠檬醛(Sigma-Aldrich, St Louis, USA)、LE135 (Tocris Bioscience, Bristol, UK)和1-甲基- l-色氨酸(Sigma-Aldrich)分别被添加为RALDH2和IDO抑制剂。

    统计分析

    采用Wilcoxon配对检验或Student t检验评价抑制剂对体外活化树突状细胞和树突状细胞- t细胞共培养的影响。此外，对来自人类志愿者研究的细胞因子和流式细胞术数据进行了D'Agostino和Pearson正态检验。喂养前后的测量使用配对数据的Student t检验进行评估，而安慰剂组和治疗组之间的比较使用Student t检验(双尾)和Mann-Whitney检验。所有数据分析均使用GraphPad Prism软件进行。

    结果

    喂养健康的人类志愿者对象的是否与体内IL-10和Foxp3的诱导有关

    健康的人类志愿者被喂食对象的或者安慰剂，持续8周。在饲养前后分别分离pmcs。对象的喂食与抗cd3 /CD28刺激的pmcs中IL-10水平显著升高相关(p=0.01)，而安慰剂组的IL-10水平没有变化(p=0.64;图1一个)．我们对更多健康人类志愿者进行了第二项研究，与之前一样，我们重新评估了PBMC IL-10水平，此外，我们量化了Foxp3的表达。我们再次观察到抗cd3 /CD28刺激的PBMC分泌IL-10同样增加(p<0.001;图1 b)，而我们观察到抗cd3 /CD28刺激的IL-2、IL-12p70、肿瘤坏死因子(TNF)α或干扰素(IFN)γ分泌无差异(图1 c)．此外，外周血CD4 T细胞表达Foxp3的百分比显著增加对象的喂养(第0周CD4+Foxp3+细胞=8.14±0.25% vs第8周CD4+Foxp3+细胞=9.19±0.34%;p = 0.003)。CD25细胞中Foxp3表达增加高和CD25中间CD4 T细胞，而CD25 - T细胞(图2)．CD4+CD25+Foxp3+细胞表现出更明显的调节表型对象的诱导性t细胞共刺激因子(ICOS)在第8周被这些细胞显著表达(图3)．细胞毒性t淋巴细胞抗原4 (CTLA-4)表达也增加，但差异无统计学意义(图3, p = 0.06)。

    图1

    双歧杆菌属对象健康人的进食与白细胞介素(IL)-10分泌增加有关。(A).体外刺激的外周血单个核细胞显示IL-10分泌增加对象的口服(n=10;P =0.01)持续8周，而安慰剂组未见(n=12;p = 0.64)。(B).健康人类志愿者IL-10分泌增加对象的在第二项研究(n=17)中重复饲喂。(C).体外抗cd3 / cd28刺激的外周血单个核细胞对象的-喂食志愿者IL-10分泌增加(p<0.001)， IL-2 (p=0.33)、IL-12p70 (p=0.26)、肿瘤坏死因子(TNF)α (p=0.42)或干扰素(IFN)γ (p=0.56)分泌无变化。*与安慰剂相比p<0.05;＊1与前处理(第0周)比较P <0.01。

    图2

    双歧杆菌属对象健康人的进食与Foxp3表达增加有关。CD25中Foxp3的表达明显增加高和CD25中间CD4 T细胞，而不是CD25负接下来是CD4+ T细胞对象的喂食。*p<0.01预处理(第0周)。

    图3

    双歧杆菌属对象喂养促进Foxp3 T细胞激活标记物的表达。喂食后对象的8周后，外周血Foxp3 T细胞诱导共刺激因子(ICOS)表达显著增加，细胞毒性T淋巴细胞抗原4 (CTLA-4;p = 0.06)。*p<0.05与前处理(第0周)比较。

    对象的诱导DC成熟和调节活性

    为了理解如何对象的诱导IL-10极化和Foxp3细胞的表达，我们关注dc作为潜在的细胞介质，它可能获得对象的在体内的粘膜和分泌诱导T细胞极化的免疫调节因子。体外实验显示，人mddc、直接分离的人mDCs和直接分离的人pDCs可以结合对象的（图4 a, B)．此外，mddc能够内化这种微生物(图4 c)．从CD80和CD86表达的增加可以明显看出mddc的成熟依赖剂量(图4 d)．髓样树突状细胞(mDC)共刺激分子表达也有类似的增加(结果未显示)。

    图4

    髓系和浆细胞样树突状细胞(mDCs, pDCs)结合并内化双歧杆菌属对象．dc高效绑定对象的通过多光谱流式细胞术成像(A)和流式细胞术可见。(B)对象的绿色为羧基荧光素二乙酸琥珀酰酯(CFSE)标记，红色为CD11c+细胞Pc5标记。大约25%-35%的单核细胞来源的树突状细胞(MDDCs)、mDCs或pDCs结合对象的37°C孵育2 h后，无论DC亚群如何。(C)共孵育16小时后，内化对象的细胞在mddc激活的溶酶体中共定位。被激活的溶酶体呈红色，对象的MDDC表面为绿色(CFSE标记)对象的被激活的溶酶体内部呈橙色(红色和绿色的结合)。大约30%的MDDC人口内化了对象的．(D)当暴露于mddc时CD80和CD86在mddc上显著上调对象的以剂量依赖的方式。以脂多糖(LPS)为阳性对照刺激。每个插图(a - d)是至少五个独立实验的代表性例子。

    对象的受刺激的MDDCs, mDCs和pDCs分泌IL-10，但不分泌IL-12p70，以应对这种细菌(图5 a - c)．并不是所有人都看到了这一点双歧杆菌当mddc与其他不相关的共孵育时，mddc分泌IL-12p70Bifidobacterial菌株和致病菌等酿脓链球菌，Staphyloccus球菌而且铜绿假单胞菌(补充图S1)。除了调节细胞因子，对象的诱导表达ALDH1A2该基因编码视网膜醛脱氢酶2 (RALDH2)，在mddc和mDCs中存在，但在pDCs中不存在(图5 d)．ALDH1A2在mddc中快速诱导，而ALDH1A2在较晚的时间点诱导mDCs。对象的没有改变ALDH1A1或ALDH1A3基因在DC亚群中的表达(结果未显示)。流式细胞术证实RALDH2在mddc和mDCs中的功能活性(图5 e)．二乙基氨基苯甲醛抑制RALDH活性完全阻断了bodipy -氨基乙酸酯阳性细胞的检测。然而，pDCs并没有上调RALDH活性对象的孵化(图5 e)．mddc对象的，表达了更高水平的RALDH代谢活性，而mddc未捕获对象的(补充图S2A,B)。此外，RALDH的诱导具有剂量依赖性，最佳剂量约为5×106后续实验使用细菌细胞(10:1细菌:MDDC细胞数)(补充图S2C)。另一种具有调节活性的代谢酶是IDO。对象的在MDDCs、mDCs和pDCs中诱导IDO基因表达，其中pDCs的表达水平相对较高(图5 f)．每个DC亚群的IDO诱导动力学不同。随着时间的推移，mddc的表达缓慢增加，而mDCs在6小时达到最大表达水平，并随着时间的推移保持表达。同样，pDCs IDO的表达在6小时达到峰值，但随后迅速下降。

    图5

    双歧杆菌属对象诱导调节树突细胞表型。IL-10分泌由单核细胞来源的树突状细胞(MDDCs)在响应对象的白细胞介素(IL)-12p70水平维持在较低水平(a;均数±标准差，n=5位供体)。同样，直接分离的髓系dc ((mDCs) B;n=3个供体)和浆细胞样dc ((pDCs) C;n=3个捐赠者)分泌IL-10，但不分泌IL-12p70对象的．(D)ALDH1A2基因表达(编码视网膜醛脱氢酶2 (RALDH2)酶)每6小时定量一次，直到18小时对象的mddc, mDCs和pDCs的刺激。(E) RALDH的功能活性是通过检测暴露于BODIPY-aminoacetate (BAA)阳性的mddc和mDCs来确定的，但不包括pDCs对象的24小时。RALDH抑制剂二乙基氨基苯甲醛(DEAB)阻断了底物的转化。在mddc、mDCs和pDC中观察到代谢酶吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的基因表达(F)。(D-F)所有实验都对至少四个供体独立重复。

    归纳ALDH1A2在发展中国家对象的35624在检测的其他双歧杆菌菌株中未见(补充图S3A)，而IDO基因表达在脂多糖和所有三株双歧杆菌菌株中均有增强(补充图S3B)。

    对象的dc的激活依赖于PRR

    为了更好的理解分子基础对象的-诱导的DC免疫调节反应，我们接下来检查了一系列PRRs所起的作用。mddc表达高水平Dectin-1;然而，Dectin-1抑制IL-10(1626±453 pg/ml vs 1522±418 pg/ml)和IL-12p70(12.5±4.8 pg/ml vs 11.9±4.1 pg/ml)的分泌对细胞因子的产生没有显著差异。阻断MDDC TLR-2导致IL-10分泌显著降低，IL-12p70和TNFα分泌显著增加(图6)．MDDC DC-SIGN的抑制没有显著改变IL-10或IL-12的分泌，尽管TNFα的分泌显著增加(图6)．阻断mDC TLR-2或DC-SIGN导致IL-10分泌显著减少，而TNFα分泌增加(图6 b)．为了证实TLR-2诱导细胞内信号级联响应对象的，我们检测了HEK-293细胞，这些细胞被改造成表达TLR-2。hek - 293TLR-2 +细胞对对象的NF-κB激活增加，IL-8分泌增加(补充图S4)。相反，在HEK中，NF-κB激活和IL-8分泌没有高于基线水平TLR-2−细胞。此外，HEK-293预孵育TLR-2 +抗tlr -2阻断抗体可显著降低NF-κB活化和IL-8分泌对象的．TLR-2可以与TLR-1或TLR-6形成异源二聚体。阻断TLR-1对对象的而TLR-6对NF-κB的激活或IL-10的分泌有一定影响，但不如TLR-2阻断显著(补充图S5)。联合抗tlr -2和抗tlr -6抗体对HEK-293 NF-κB活化和MDDC IL-10分泌的抑制作用最强。TLR-2在pDC中表达量非常低，阻断实验不改变pDC IL-10对TLR-2的反应对象的（图6 c)，而未检测到IL-12p70。然而，用抑制性寡核苷酸阻断TLR-9可以消除pDCs对IL-10的分泌对象的（图6 d)．为了评估pDCs对特定TLR-9激动剂的反应是否类似，pDCs被CpG或对象的．这两个对象的CpG刺激后IL-10和IDO基因表达增加，而IFNα基因表达仅在CpG刺激后增加(图6 e)．MDDC和mDCs表达非常低水平的TLR-9和TLR-9抑制性寡核苷酸不改变MDDC的反应对象的(结果未显示)。

    Dendritic cell (DC) cytokine production is pattern-recognition receptor dependent. (A) B infantis stimulated monocyte-derived dendritic cells were preincubated with blocking antibodies to Toll-like receptor-2 (TLR-2; n=9) or DC-SIGN (n=8) and cytokine secretion was quantified after 24 h stimulation. Blocking of TLR-2 significantly reduced interleukin (IL)-10 secretion, which was accompanied by a significant increase in IL-12p70 and tumour necrosis factor (TNF)α secretion. Blocking of DC-SIGN had no impact on IL-10 or IL-12p70 secretion but did result in increased TNFα secretion. (B) Bifidobacterium infantis stimulated myeloid DCs were preincubated with blocking antibodies to TLR-2 (n=3) or DC-SIGN (n=3) and cytokine secretion was quantified after 24 h stimulation. Blocking of TLR-2 or DC-SIGN significantly reduced IL-10 secretion, which was accompanied by a significant increase in TNFα secretion. (C) IL-10 secretion by plasmacytoid DCs (pDCs) in response to B infantis was unchanged between isotype control antibody (IC) and anti-TLR-2 blocking antibody treated cells (n=4). (D) Preincubation of pDC with blocking TLR-9-specific oligodeoxynucleotides (ODNs) significantly reduced pDC secretion of IL-10 in response to B infantis stimulation. (E) IL-10, indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) and interferon (IFN)α gene expression were quantified in pDCs after stimulation with CpG or B infantis for 0, 6, 12 or 18 h. *p<0.01 versus isotype control antibody or control ODN-treated DCs.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    树突状细胞(DC)细胞因子的产生依赖于模式识别受体。(一)对象的刺激的单核细胞来源的树突状细胞与toll样受体-2 (TLR-2;(n= 9)或DC-SIGN (n=8)，刺激24 h后定量细胞因子分泌。TLR-2的阻断显著降低了白细胞介素(IL)-10的分泌，同时IL-12p70和肿瘤坏死因子(TNF)α的分泌显著增加。DC-SIGN的阻断对IL-10或IL-12p70的分泌没有影响，但会导致TNFα分泌增加。(B)双歧杆菌属对象用TLR-2 (n=3)或DC-SIGN (n=3)阻断抗体预孵育受刺激的髓系dc，并在刺激24 h后定量细胞因子分泌。TLR-2或DC-SIGN的阻断显著降低了IL-10的分泌，同时TNFα的分泌显著增加。(C)浆细胞样dc (pDCs)对IL-10的分泌对象的同型对照抗体(IC)和抗tlr -2阻断抗体处理的细胞之间没有变化(n=4)。(D) pDC与阻断tlr -9特异性寡脱氧核苷酸(ODNs)预孵育显著降低pDC对IL-10的分泌对象的刺激。(E) CpG或刺激后，定量IL-10、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)和干扰素(IFN)α基因在pDCs中的表达对象的0、6、12或18小时。*p<0.01与同型对照抗体或对照odn处理的dc。

    除了细胞因子的产生外，MDDC TLR-2或DC-SIGN的阻断导致视网膜酸代谢的显著抑制对象的-受刺激mddc和mDCs (图7 a, B)．此外，Pam3CSK4特异性激活MDDC TLR-2可诱导维甲酸代谢，而甘露糖基化脂阿拉伯甘露聚糖(ManLam)刺激DC-SIGN可略微增加维甲酸代谢(图7 c)．相比之下，分别通过脂多糖或鞭毛蛋白特异性激活TLR-4或TLR-5，并没有诱导MDDCs中的维甲酸代谢(图7 c)．

    图7

    toll样受体-2 (TLR-2)和DC-SIGN诱导维甲酸代谢。(A) TLR-2或DC-SIGN的阻断显著减弱了视网膜醛脱氢酶2 (RALDH2)的诱导双歧杆菌属对象-刺激单核细胞来源的树突状细胞(MDDCs)。(B)抗tlr -2或抗dc - sign抗体对RALDH活性的平均抑制对mddc和髓系树突状细胞(mDCs;n = 4捐助者)。所有实验均使用同型对照抗体(IC)。(C) TLR-2 (Pam3CSK4)或DC-SIGN (ManLam)特异性配体刺激MDDCs可诱导维甲酸代谢，而TLR-4(脂多糖)或TLR-5(鞭毛蛋白)刺激不诱导维甲酸代谢。*p<0.05与同型对照抗体。BAA, BODIPY-aminoacetate。

    对象的受刺激的dc诱导Foxp3 T细胞

    作为人类dc明显分泌免疫调节介质的反应对象的，我们评估了这些dc是否也能诱导体外自体T细胞表达Foxp3。mddc与对象的洗净后再与自体CD4细胞孵育5、7或9天。与未受刺激的MDDCs相比，在共刺激或不共刺激的第7天，Foxp3诱导达到峰值(补充图S6A)。在随后的所有实验中，DCs与自体CD4 T细胞共培养7天，以评估Foxp3诱导。孵育后对象的， mddc、mDCs和pDCs诱导CD4 T细胞培养的Foxp3表达(图8)．此外，白细胞介素-10分泌增强可见于对象的-刺激DC-T细胞共培养，与未刺激dc培养的T细胞相比(图8 b)．阻断TLR-2显著减少了MDDC和mDC-T细胞共培养的IL-10分泌，对pDC-T细胞IL-10分泌无影响(图8 c)，而阻断TLR-9可显著降低pDC-T细胞分泌IL-10 (图8 d)．

    图8

    双歧杆菌属对象受刺激的树突状细胞诱导Foxp3 T细胞和白细胞介素(IL -10)分泌。对象的与未受刺激的MDDC-、mDC-或pDC-T细胞共培养相比，受刺激的单核细胞来源的树突状细胞(MDDCs)、髓系dc (mDCs)或浆细胞样dc (pDCs)诱导CD25+Foxp3+ T细胞(A)，与IL-10分泌增加相关(B, n=6个供体)。所示的流式细胞术密度图来自抗cd2 /CD3/CD28再刺激T细胞培养物。(C)阻断toll样受体-2 (TLR-2)显著减少了MDDC和mDC-T细胞共培养的IL-10分泌，但对pDC-T细胞IL-10分泌无影响(n=3个供体)。(D)阻断TLR-9显著降低了pDC-T细胞IL-10的分泌(n=4)。*p<0.05与未刺激细胞。ODN oligodeoxynucleotides。

    为了确定哪些PRRs负责优先诱导Foxp3 T细胞，mddc预先与抗tlr -2或抗dc - sign阻断抗体孵育对象的激活。当树突状细胞TLR-2反应被阻断时，CD4+CD25+Foxp3+细胞数量显著减少。在较小程度上，DC-SIGN的阻断也显著降低CD4+CD25+Foxp3+的诱导(图9)．未见T-bet或GATA-3阳性T细胞诱导超过基线。然而，mddc与其他双歧杆菌，诱导树突状细胞分泌IL-12p70，导致T-bet+ T细胞的诱导(补充图S6B)。RALDH2的诱导与粘膜相关CD103+树突状细胞诱导Foxp3 T细胞的能力增强有关。在抑制MDDC或mDC维甲酸合成(使用柠檬醛)或抑制T细胞维甲酸受体信号(使用LE135)后，通过对象的-刺激的mddc和mDCs被抑制(图9 b)．利用IDO抑制剂1-甲基色氨酸诱导Foxp3 T细胞对象的-刺激的pDCs被抑制(图9 c)．对象的在1-甲基色氨酸的存在下，受刺激的MDDC诱导的Foxp3 T细胞也部分减少;然而，这种减少在统计学上并不显著，也不像pDC-T细胞那样显著(图9 d)．

    图9

    toll样受体-2 (TLR-2)、DC-SIGN、视醛脱氢酶2 (RALDH2)和吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)是Foxp3 T细胞诱导的最佳条件。(A)诱导Foxp3 T细胞双歧杆菌属对象当用抗tlr -2或抗dc - sign阻断抗体预培养单核细胞来源的树突状细胞(MDDCs)时被阻断。相比之下，T细胞对T-bet或GATA-3的表达没有影响(平均值±SE, n=4)。(B)维甲酸生成(柠檬醛)或维甲酸信号(LE135)的抑制阻断Foxp3细胞的诱导对象的-刺激mddc和髓系DCs (mDCs;n = 3捐助者)。(C)此外，1-甲基色氨酸对pDC IDO活性的抑制显著减弱了Foxp3 T细胞的浆细胞样DC (pDC)诱导。(D) IDO抑制部分降低对象的-刺激MDDC-T细胞Foxp3诱导(n=3个供体)，但不像IDO抑制pDC-T细胞Foxp3诱导(n=5个供体)那么明显。*p<0.05与未刺激细胞。

    讨论

    诱导Foxp3 T调节细胞是黏膜免疫耐受的一个关键特征。在这项研究中，我们展示了健康人类志愿者的口服喂养对象的导致外周血中Foxp3+CD4+ T细胞数量增加，这与刺激后IL-10分泌增加有关。此外，我们的体外实验数据支持DCs对Foxp3细胞的诱导负责的假设。mDC和pDC子集都发挥了作用，但需要识别对象的通过不同的prr。mddc和mDCs对Foxp3 T细胞的诱导涉及TLR-2、DC-SIGN和维甲酸代谢。然而，pDCs对Foxp3 T细胞的诱导不依赖于TLR-2和维甲酸，但需要IDO。据我们所知，这是第一个证明人类DC亚群在暴露于一种增强自体CD4 T淋巴细胞中Foxp3表达的共生微生物时使用不同途径的报告。

    人类Foxp3 T细胞在表型和功能上是异质的，虽然相关，但组成不同的亚群。有趣的是，ICOS和CTLA-4在Foxp3群体中的表达增强表明对象的诱导效应体Treg表型。31对象的喂养与表达Foxp3的CD25细胞数量的增加有关，但对CD25−群体中的Foxp3表达没有影响。一种可能的解释是Foxp3可以促进CD25的表达，因此对象的Foxp3在CD25−细胞中的相关诱导导致CD25的表达及其包含在CD25门中。32另外,对象的可能不会在体内诱导新的CD25+Foxp3+细胞，但相反对象的可能会稳定并促进现有CD25+Foxp3+种群的扩张。

    胃肠道微环境的默认状态被认为有利于调节淋巴细胞的诱导。例如，维生素A在肠上皮细胞和特化DC亚群中产生维甲酸，导致naïve T细胞转化为Foxp3 T调节细胞。33然而，促进维生素A代谢的肠道特异性因子却很少被描述。我们描述了在mDCs中维甲酸代谢酶RALDH2的上调，这暴露于单一的共生菌株。视黄酸反应是功能性的，有助于诱导Foxp3 T细胞。因此，胃肠道内某些菌株的存在可能为肠道相关淋巴组织诱导酶(如RALDH2)提供必要的信号，这些酶是在外源抗原挑战的环境中维持肠道稳态所必需的。令人惊讶的是，pDCs诱导Foxp3+CD4+ T细胞需要色氨酸代谢，而不是维甲酸代谢对象的曝光。这些分子机制强调了饮食、胃肠道微生物群组成和肠道免疫反应调节之间的重要联系。有趣的是，其他研究人员最近对微生物群衍生的短链脂肪酸的研究结果表明，我们以前可能低估了饮食和微生物群之间关系的重要性。34此外，醋酸酯的生产(继碳水化合物发酵)也有一定的效果双歧杆菌菌株介导保护免受致命大肠杆菌小鼠感染。35

    最近关于PRR信号在黏膜稳态中的作用的研究结果强调了不同PRR功能之间的微妙平衡，并表明缺陷的PRR信号可导致炎症。36TLR-2 KO动物对葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎更敏感，而TLR-2基因变异与炎症性肠病患者的疾病表型相关。事实上，在小鼠模型中，TLR-2已被证明可以促进Foxp3的表达，以应对肠道微生物。3738我们的研究结果表明，抑制人mDC TLR-2/6的激活可以抑制IL-10的分泌和Foxp3的诱导，同时促进IL-12p70和TNFα的分泌对象的曝光。DC-SIGN激活对象的是RALDH完全活性所必需的，而阻断DC-SIGN会导致Foxp3+CD4+ T细胞显著减少。类似地，TLR-9是pDC分泌IL-10的必要条件对象的．然而，CpG刺激pDCs可导致IFNα基因表达增强，而这一结果未被观察到对象的这表明，与TLR-9单独诱导的分子途径不同，其他分子途径也参与了pDC对该细菌的反应。这些发现表明TLR-2/6, DC-SIGN, TLR-9和其他PRRs之间的交叉对话决定了对这种共生微生物的先天和随后的适应性免疫反应。在体内适当的PRR激活可能促进免疫稳态机制，从而限制促炎反应的激活并保护粘膜组织免受损伤。此外，多个PRRs的参与表明，多种细菌成分，包括脂质硅酸(TLR-2)、多糖(DC-SIGN)和DNA (TLR-9)，在体内对免疫调节程序的最佳诱导都很重要。此外，表达所有这些调控因子的共生菌可能比只表达一到两种调控因子的共生菌在Foxp3细胞的局部诱导中更有效。

    与外周血相比，mDCs和pDCs都存在于胃肠道内，数量相对较高。在小鼠中，pDCs在固有层和Peyer斑块中数量上占主导地位，而mDCs在肠系膜淋巴结中占主导地位。39在小鼠模型中，pDCs已被证明是诱导和维持口服耐受性所必需的，因为pDCs的全体性消耗阻止了对喂养抗原的耐受性诱导，而过继转移口服抗原负载的肝脏pDCs可诱导CD4和CD8 T细胞应答的抗原特异性抑制。40很可能mDCs和pDCs也会在诱导对共生微生物的耐受性方面合作对象的，但我们的数据表明，并非所有双歧杆菌诱导相同的pDC和mDC反应。

    对象的35624已被证明可以在许多小鼠模型(包括结肠炎、关节炎、呼吸道过敏和感染模型)中预防炎症性疾病。在人体中，我们现在在体内证明，口服这种细菌导致IL-10反应和CD4 T细胞中Foxp3表达升高，我们描述了支持这种调节反应的潜在细胞机制。操纵T调节细胞的数量或功能是一个令人兴奋的治疗靶点在广泛的炎症性疾病。4142更清楚地了解微生物群在体内诱导口服耐受的机制可能会导致合理的策略来操纵调节T细胞和效应T细胞，从而影响胃肠道疾病，如食物过敏、嗜酸性食管炎、肠易激综合征和炎症性肠疾病。

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    补充材料

    • 补充数据

      此网页文件由BMJ出版集团从作者提供的电子文件制作而成，并没有对内容进行编辑。

      本数据补充文件:

    • Gut的教育编辑Mairi McLean在Gut播客中与Liam O'Mahony对话

      收听播客

    脚注

    • 见注释，p331

    • 作者PK和DG均为第一作者。

    • 资金作者得到了瑞士国家基金会的资助(项目编号32030-132899和310030-127356)，克里斯汀Kühne过敏研究和教育中心，爱尔兰科学基金会和营养健康有限公司的支持。

    • 相互竞争的利益DG和BK是大学校园公司Alimentary Health Ltd的雇员。LOM, FS和EQ是Alimentary Health Ltd的顾问。FS获得GSK的研究资助。CA获得了Novartis和Stallergenes的研究支持，并为Actellion, Aventis和Allergopharma提供咨询。PK, MZ, ReF和RuF没有利益冲突。本文的内容既不受这些事实的影响，也不受这些事实的约束。

    • 伦理批准爱尔兰科克教学医院临床研究伦理委员会。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。

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