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摘要
客观的减少FODMAPs(可发酵低聚糖、双糖、单糖和多元醇)对肠易激综合征有临床益处，但其机制尚不完全清楚。我们的目标是检测可能预测低FODMAP饲粮反应的微生物特征，并评估微生物群的组成和功能变化是否可以为其作用模式提供见解。
设计我们使用宏基因组学来确定IBS病例和家庭对照组(n=56对)的粪便微生物群的高分辨率分类学和功能概况。采用低FODMAP饮食4周后，研究了41对小鼠的临床反应和菌群变化。
结果对基线肠易激综合征病例的无监督分析发现了两种不同的菌群分布，我们称之为肠易激综合征P(pathogenic-like)和肠易激综合症H(健康)亚型。肠易激综合症P厚壁菌门和氨基酸和碳水化合物代谢基因丰富，拟杆菌门则减少。肠易激综合症H微生物群与对照组相似。低FODMAP饮食，肠易激综合征H和对照菌群未受影响，但IBSP特征转向与健康相关的微生物组，拟杆菌门增加(p=0.009)，厚壁菌门减少(p=0.004)，初级代谢基因正常化。IBS患者对低FODMAP饮食的临床反应更大P与肠易激综合征比较H(p = 0.02)。
结论50%的肠易激综合征病例表现出“致病性”肠道微生物特征。这转向了低FODMAP饮食的健康状况;和肠易激综合症P病例对食疗的临床反应性增强。降低FODMAP在肠易激综合征中的有效性P可能是由于肠道菌群和代谢产物的改变。菌群特征可以作为指导肠易激综合征治疗的生物标志物;和调查肠易激综合症P物种和代谢途径可能有助于了解IBS的致病机制。
- 肠道微生物
- 饮食
- 肠易激综合症
数据可用性声明
数据可在一个公共的、开放访问的存储库中获得。原始测序数据可在ENA研究登录号:erp021923下访问，处理后的数据作为补充材料提交。复制分析所需的源代码和脚本提交在http://github.com/kevinVervier/IBS．
这是一篇开放获取的文章，按照创作共用署名4.0未移植(CC BY 4.0)许可发布，该许可允许其他人复制、重新发布、混合、转换和基于此作品的任何目的，只要原始作品被正确引用，提供许可证链接，并说明是否进行了更改。看到的:https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．
来自Altmetric.com的统计
本研究的意义
关于这个问题，我们已经知道了什么?
肠易激综合征患者通常对低FODMAP(可发酵寡糖、双糖、单糖和多元醇)饮食有反应。
肠道菌群与肠易激综合征有关。
肠易激综合征患者体内的菌群可能因饮食而改变。
新的发现是什么?
我们能够根据肠道菌群种类和代谢基因特征对肠易激综合征患者进行分层。
我们发现了一种独特的肠道菌群亚型，与其他肠易激综合征患者相比，该亚型对低FODMAP饮食的临床反应增强。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
微生物群特征作为生物标志物的潜在发展，可用于管理低FODMAP饮食推荐的IBS病例。
如果肠易激综合征中的细菌P亚型在IBS中发挥了致病作用，可能是通过它们的代谢活性，这为新疗法和评估它们的中间表型提供了一个靶点。
简介
肠易激综合征影响全球10%-15%的人口。1它影响生活质量2并产生巨大的卫生经济成本。3.肠易激综合征的病理生理学包括内脏神经敏感性的改变，4肠道通透性5和心理因素。6一些证据表明肠道微生物群是肠易激综合征的关键病因。例如，在感染性肠胃炎发作后，患肠易激综合征的风险增加了6倍，7益生菌和饮食干预可以减轻症状8 9粪便移植治疗肠易激综合征有疗效报道。10最近使用16S核糖体RNA谱的研究表明，与对照组相比，肠易激综合征受试者的肠道菌群发生了改变。尽管早期研究的结果差异很大，但最近的研究更一致地表明，与对照组相比，肠易激综合征患者中拟杆菌门菌的数量有所减少。11 - 13然而，肠道菌群和肠易激综合征症状之间的机制联系仍然知之甚少。
肠易激综合征症状可以通过低纤维饮食来治疗，以减少结肠微生物发酵产生氢气和甲烷，从而导致腹胀。9最近，避免发酵低聚糖、双糖、单糖和多元醇(FODMAPs)的饲粮已被证明是有效的。14日至17日机制是有争议的，18但可能涉及到微生物群组成和代谢物生产的调节。19低FODMAP饮食对许多患者来说是具有挑战性的，通常需要更多的时间准备饭菜，食谱调整和更少的方便食品的选择。它对健康的长期后果尚不清楚。因此，人们认识到有必要更好地了解低FODMAP饮食是如何起作用的，20.最理想的是确定预测反应的生物标记物。
为了准确地将肠道菌群结构的变化与饲粮(包括低FODMAP饲粮)联系起来，需要对微生物丰度进行详细的分类分析和量化。健康成年人的肠道菌群是多样化的，主要由拟杆菌门和厚壁菌门门的数百种细菌组成，放线菌门和变形菌门的细菌种类较少。21它由饮食形成，影响免疫、新陈代谢和认知。22日23日虽然16S rRNA研究为肠道菌群和肠易激综合征提供了有价值的见解，但它们无法实现物种层次的分类学解析。微生物培养和宏基因组测序技术现在可以进行详细的分类和功能表征。24
本研究的目的是通过对肠易激综合征患者和家庭对照组在低FODMAP饮食前后的高分辨率宏基因组学和功能分析，确定对低FODMAP饮食反应的生物标志物，并深入了解治疗成功的微生物变化。
材料和方法
主题
一项前瞻性单中心病例对照研究招募了2016年至2019年的参与者。我们纳入了符合罗马IV标准的成年人(18-68岁)25腹泻型或混合型肠易激综合征(分别为IBS- d型和IBS- m型)的家庭对照。研究对象是通过社交媒体活动从英国剑桥大学医院的门诊招募的。
我们排除了患有其他胃肠道疾病、怀孕、已经在遵循限制性饮食的患者(包括那些已经低摄入量的FODMAPs)，以及服用益生菌或在1个月内服用过可能改变肠道菌群的药物的患者，如抗生素、质子泵抑制剂、结肠镜肠道制剂或二甲双胍。26
研究过程总结在图1．由一名顾问和一名营养师评估参与者的适宜性。随后的三次研究访问由两名在低FODMAP饮食管理方面受过训练和有经验的资深消化病学营养师中的一名监督。收集所有参与者的7天饮食日记(记录前一周的饮食摄入量)，并使用IBS严重程度评分系统(IBS- sss)获取症状严重程度评分。27饮食FODMAP评分采用先前发表的定性方法进行评估28如补充材料(FODMAP评分部分)所述。
肠易激综合征微生物组研究流程图:就诊1-3时提供粪便样本的肠易激综合征受试者和每个家庭对照组的配对数。可发酵低聚糖、双糖、单糖和多元醇;*IBS- sss, IBS严重评分系统。
粪便样本
在随访1时，参与者和他们的家庭控制组被要求提供粪便样本，同时保持他们的正常饮食，在低FODMAP饮食4周后(在随访2时)，在FODMAP饮食改善后的IBS受试者12周后(以确定单个FODMAP触发因素)，或在IBS患者和所有家庭对照组中恢复正常饮食(来访3)。样品被密封并立即放置在参与者的家庭冰箱中，然后在48小时内用干冰快递到惠康桑格研究所，在- 80°C下存储，然后加工。DNA提取使用MP Biomedicals FastDNA SPIN Kit for Soil。
宏基因组测序
为了分析病例和对照组的粪便样本的分类组成，我们使用Illumina Hi-Seq 4000平台进行鸟枪宏基因组测序(读取长度150 bp，片段大小450 bp，平均1200万对端读取);没有评估总细菌负荷。原始测序数据保存在ENA研究登录号:ERP021923。配对端读取文件使用Kraken2定制数据库进行分类，该数据库由2754个高质量的人类GI基因组组成(在线补充表1)从“人类肠道细菌培养集”下载的784种与人类肠道微生物组有关的物种，24可耕种的基因组参考29国家生物技术信息中心(NCBI)。使用CheckM评估参考基因组的质量，30.我们保持组件>90%的完整性和<5%的污染。欧洲蕨31用于获得精细化的种级宏基因组图谱。在我们的平台上，平均有1020万个测序reads按种级进行了分类，对应的阅读分类率为86% (在线补充图1)．病例与对照组的指定读取计数无差异(配对Wilcoxon p=0.7)。采用R语言进行统计分析。32分类剖面采用中心对数比(CLR)变换归一化33函数估计零值之后cmultRepl函数zCompositionsR包。34
为了进行无监督分析以识别肠易激综合征病例的亚群体，我们仅从基线肠易激综合征病例样本中应用k-means聚类算法对clr转换的分类概况进行分析。最优k值是通过最大化平均轮廓分数使用fviz_nbclust函数的factoextraR包35谁来评估之间值的聚类质量k= 1 - 10。附加的聚类分析仅使用家庭对照样本，也使用病例和对照的组合样本。
各组间的alpha多样性比较采用配对Wilcoxon符号秩检验。我们用了艾奇逊距离33它是CLR变换剖面的欧氏距离，用来估计样本之间的贝塔多样性。用Wilcoxon秩和检验对两两Aitchison距离进行差异显著性估计。
在适当的情况下，使用联列表上的Fisher精确检验或Wilcoxon秩和检验寻找聚类分配和临床元数据之间的关联(表1)．通过使用MaAsLin2软件应用广义线性混合模型，我们测试了分类/功能丰度与IBS聚类之间的相关性。36为了解释非独立样本，随机效应模型通过匹配受试者与IBS和家庭控制，以及来自同一个人的纵向样本。原始数据和源代码的分析可在http://github.com/kevinVervier/IBS．
使用FastTree V.2.1.10生成极大似然树37用GTDB-Tk V.1.3.0软件进行蛋白比对38与classify_wf函数和默认参数。使用交互式生命树(iTOL) V.5对树进行可视化和注释。39
功能宏基因组学和基因组学分析
使用HUMAnN3对每个宏基因组进行功能分析40使用默认参数来量化MetaCyc路径。41使用MaAsLin2进行路径富集36(阈值在q值<0.1)。利用MetaCyc数据库对丰富的路径进行了广泛的分类。
为了识别参考基因组中富集的MetaCyc通路中存在的基因，我们首先从MetaCyc数据库和UniProt中收集了每个通路中每个基因对应的蛋白质序列。42BlastP43然后在基于544个基因组(作为2754个参考基因组的一个子集)的蛋白质数据库中对每个蛋白质序列执行截断E值为1e-10的操作。该基因组收集了544个基因组，其中包括IBS相关细菌的420个基因组(56种)，代表IBS集群P以及124个与健康相关的细菌基因组(34种)，代表集束肠易激综合征H(肠易激综合征见下文P/肠易激综合症H描述)。基因富集量计算采用单侧Fisher精确检验，p值调整采用Hochberg法。
结果
组总结
该队列总结为图1．病例中以女性为主(73%)，IBS-M是最常见的亚型(59%)。14例(25%)报告在肠胃炎发作后出现症状。56例患者基线时的IBS-SSS中位值为272例，其中45例(88.2%)评分为中度(IBS-SSS >175 - n=25)或重度(IBS-SSS >300 - n=20)，与在消化内科诊所就诊的典型人群一致。28在对照组中，IBS-SSS得分中位数为7.5(范围0-196)。受试者的平均年龄为38.7岁(18-68岁)，对照组为44.6岁(18-74岁)。
肠易激综合征病例和家庭对照肠道菌群的比较
对234例粪便样本进行宏基因组测序，然后对序列reads进行参考基因组作图。24我们将家庭控制纳入其中，减少了环境暴露(宠物、流行饮食、卫生制度)带来的混乱，这很重要，因为肠道微生物可以经常在同居的人之间传播。44事实上，我们观察到，与所有病例和所有对照之间的总体变异率相比，来自同一家庭的样本具有更保守的微生物群组成(在线补充图2Ce-05 Wilcoxon p = 6.02)。为了在后续分析中解释这一潜在的混杂因素，我们在可能的情况下应用了成对比较。
我们首先专注于了解细菌种类的组成变异，以确定肠易激综合征病例肠道微生物群的潜在致病失衡。我们使用Chao1指数来比较物种数量(丰富度)和Shannon指数来比较不同物种的相对丰度(alpha多样性)。肠易激综合征患者的丰富度并不低(配对Wilcoxon p=0.12) (在线补充图2A)，但我们确实观察到肠易激综合征患者的α多样性较对照组低(配对Wilcoxon p=0.0092;在线补充图2B)．我们还使用Aitchison距离测量了基线菌群样本之间的beta多样性，并观察到肠易激综合征病例与对照组相比明显有更多的分类变异性(在线补充图2C，成对Wilcoxon p=1.3E-79)。
基于肠道菌群组成亚型的肠易激综合征病例分层
从肠易激综合征病例中观察到的基线微生物群多样性的高变异性，使我们有必要通过微生物组剖面探索可能的分层，以识别在我们最初的分析中未检测到的区别信号。因此，我们对56对肠易激综合征的基线样本进行了无监督数据聚类——一种无假设的方法，旨在识别微生物群亚型。该分析揭示了最佳的数据分离是通过划分为两个不同的微生物群分类学集群实现的，每个集群有28个病例(图2一个，在线补充图3A,B)．
微生物群分布的多样性分析。(A)肠易综合征病例和健康对照的Beta多样性分析:对前两个组成部分的主坐标分析确定了病例中两个不同的聚类，描述为聚类1 (cl1，红色)和聚类2 (cl2，蓝色)。家庭控制的总体分散用灰色表示。方差由PC1: 10%， PC2: 8%解释。(B)使用120个核心基因生成的2754株人类肠道细菌的系统发育树。外圈是富含cl1的细菌(红色;N =420个基因组)和富含cl2的细菌(蓝色;基因组n = 124)。每个聚类选出前5个流行科。分支颜色区分放线菌门的细菌门(黄色; n=363 genomes), Bacteroidetes (green; n=675 genomes), Firmicutes (dark blue; n=1562 genomes) and Proteobacteria (purple; n=154 genomes).
当考虑与家庭对照配对的病例(在线补充图3C,D)，但当只聚类家庭对照时，我们无法观察到很强的分离(在线补充图3E、F)，表明在这些簇中捕获的大部分信号来自肠易激综合征病例的可变性。单是肠易激综合征病例的主坐标分析就捕捉到前两个分量的较大变异性(在线补充图4， PC1: 14%， PC2: 9%)。2组病例的微生物组组成明显比1组病例的家庭对照更相似(Wilcoxon p=0.0037，在线补充图5)．与之前在所有肠易激综合征病例中观察到的总体变异性相比，每个类群内的微生物群多样性更为保守(在线补充图6e-08 Wilcoxon p = 2.2)。我们发现两组患者在年龄、性别、体重指数(BMI)、肠易激综合征亚型、感染后肠易激综合征或伴随用药方面无显著差异(表1)．组群1的基线症状严重程度评分似乎略高于组群2 (IBS-SSS中位数=302 vs 249)，但这没有统计学意义(Wilcoxon p=0.17)。
第1组病例的细菌种类(丰富度)似乎略低于第2组病例(Wilcoxon p=0.033)，但在各自对照组之间没有观察到这种差异(Wilcoxon p=0.57) (在线补充图7A)．来自同一聚类的病例和对照组显示了相似的丰富度(配对Wilcoxon聚类1 p=0.073，聚类2 p=0.69)。IBS组1的Shannon多样性(alpha多样性)明显低于组2 (p=0.0002)，但在各自的对照组之间没有发现这种差异(p=0.078) (在线补充图7B)．与家庭对照相比，群集1的病例alpha多样性较低(配对Wilcoxon p=0.0029)，而群集2未观察到这一点(配对Wilcoxon p=0.41)。总的来说，我们的研究结果表明，与簇2相比，簇1中的细菌种类较少，且丰度分布倾向于更小的细菌集合。
Read丰度分析发现，基线时两种IBS亚型的细菌种类之间存在显著差异(MaAsLin2 q值<0.1;在线补充表2)．在两种IBS亚型中，共有87种物种的数量存在显著差异(第1组56种，第2组31种)，但在相应的家庭对照组之间没有观察到这种显著差异。在IBS群集1中，我们观察到来自厚壁菌门的细菌显著增加，包括已知的人类病原体(艰难梭状芽胞杆菌，Paeniclostridium sordellii，perfringens梭状芽胞杆菌，链球菌anginosus) (在线补充图7C)和显著消耗的倍数拟杆菌而且Parabacteroides物种(在线补充图7D)．系统发育分析显示，第一组厚壁菌门的优势种与第二组细菌门的优势种有明显区别(图2 b)．然而，我们没有观察到这两个门在组间的丰度有显著差异(MaAsLin2 q-value: Firmicutes: 0.2, Bacteroidetes: 0.78)，这表明在一个种子集的差异，而不是整体的Firmicutes/Bacteroidetes的不平衡。
因此，我们确定了具有不同菌群特征的IBS亚型:簇1包含较低的细菌多样性，在拟杆菌门的共生物种中减少，而在厚壁菌门的物种中增加，包括人类病原体;群集2与健康家庭对照组没有区别。我们将集群1称为IBSP微生物组类型为其致病特性，群集2为肠易激综合征H微生物组类型，因为它与健康家庭对照相似。
肠易激综合征肠道菌群中初级代谢基因的富集P病人
拟杆菌门和厚壁菌门的细菌种类在进化和生理上是不同的，对肠道微生物群贡献不同的核心功能。因此，我们推断肠易激综合征的功能能力P微生物群可能与肠易激综合征症状有关。为了识别两种肠易激综合征亚型微生物群之间的功能差异，我们对肠易激综合征基线样本的宏基因组中编码的功能容量进行了分析P和肠易激综合症H病人。这种分析独立于以前的分类学分析。我们发现IBS中109个功能通路显著富集，13个功能通路显著缺失P与肠易激综合征相比H微生物(在线补充表3)．进一步的功能分类表明，IBS中的大多数富集通路P微生物群(78.7%)可分为与初级代谢相关的五大功能类别(图3)．这一信号在一项包括对照样本的分析中得到了复制，其中53个显著发现中的51个已经在112个通路中报告了。这表明肠易激综合征之间的功能差异P和肠易激综合症H患者不能归因于环境/生活方式因素。
肠易激综合征的功能和分类特征P受试者基线微生物。饼图显示在肠易激综合征中明显富集的通路分布P并根据他们的MetaCyc功能类别着色。候选路径的选择用行表示(颜色如饼图所示)。IBS之间的物种丰度显著不同P和肠易激综合症H研究对象以柱状表示，并按门着色(拟杆菌门为绿色，厚壁菌门为蓝色)。对于每一个途径和物种的组合，它们各自丰度的Spearman相关性被报告(从红色的强阳性到蓝色的强阴性)。
因为氨基酸生物合成(25%)和碳水化合物代谢(15.7%)是区分肠易激综合征的两个主要功能类别P和肠易激综合症H接下来，我们在肠易激综合征中进行了靶向功能富集分析P物种层面的微生物群。在氨基酸的生物合成方面，这发现了参与色氨酸、苏氨酸和组氨酸生物合成的基因显著富集(在线补充图8)．碳水化合物代谢当量分析发现，参与乳糖代谢、果糖代谢和海藻糖代谢的基因显著富集，以及两种短链脂肪酸(SCFA)的生物合成:丁酸和丙酸(在线补充图9)．
我们的研究结果表明，肠易激综合征的细菌在氨基酸的生物合成和简单膳食糖的代谢方面具有独特的功能P在肠易激综合征的细菌中所占比例不足H集群。将成分(图2 b)和功能性(图3)的特征确定了一个与肠易激综合征相关的候选物种的子集P集群(图3)，并在重要途径中富集。观察到这些途径的丰度与已知致病能力的细菌种类的丰度之间存在很强的正相关关系(c . 固执的，p . sordellii，c . perfringens)和一种与UC相关的病原体(Faecalicatena gnavus,以前叫瘤胃球菌属gnavus45)．IBS中耗竭的共生物种P患者没有编码这些通路。
低FODMAP饮食干预可纠正肠易激综合征P微生物组
共有41例IBS病例和他们的家庭对照组在4周内遵循低FODMAP饮食，并在饮食期间提供粪便样本。在基线和饮食上，肠易激综合征患者之间的FODMAP评分没有显著差异P和肠易激综合症H和预期的一样，每组饮食组的得分都显著下降(在线补充材料1-FODMAP评分，Wilcoxon p=<0.00001)。在低FODMAP日粮中IBS-SSS显著降低(日粮中IBS-SSS平均值为278，日粮中为128)(图4一)．这在患有肠易激综合征的患者中都观察到了P和肠易激综合症H类型微生物(图4 b)，但反应程度的差异在肠易激综合征中更为明显PIBS患者(ΔIBS-SSS)P= 194和肠易激综合症H= 114;Wilcoxon p = 0.02) (图4 c)．反应率定义为IBS-SSS >下降50点27第1次和第2次访问之间有相同的趋势，但没有达到统计学意义(14/16 (87.5%)IBSP与13/20(65%)的IBS相比H；χ2测试p = 0.12)。
36名接受饮食干预并提供IBS-SSS的受试者的临床反应。(A)合并肠易激综合征的反应P和肠易激综合症H在来访3时，15名受试者的饮食前和饮食中也包括IBS-SSS。(B)饮食前反应和饮食中根据菌群饮食前的反应。(C)各组患者IBS-SSS从饮食前值到饮食后值的变化。采用配对Wilcoxon检验评估组间差异的统计学意义(****p<0.0001， ***p<0.001， *p<0.05, ns: p>0.05)。柱高表示均值，误差柱表示SE。肠易激综合征严重程度评分系统。
IBS-SSS在低FODMAP饲粮结束后的第1,3个月仍低于来访时(IBS-SSS饲粮后的平均值为117)，但此时获得的FODMAP数据量不允许用足够的功率进行分析。
对比基线(饮食前)粪便样本和低FODMAP饮食4周获得的粪便样本的分类概况，显示肠易患综合症的微生物群组成发生了显著变化P但不是肠易激综合征H病例或健康对照(图5一个)．与肠易激综合征之间的差异相比P和肠易激综合症H在基线时，beta多样性分析显示IBS的微生物组谱P病例变得更加类似于肠易激综合征H对照组和健康对照组在低FODMAP饮食时。这明显表现为在所有肠易激综合征病例中微生物组组成的可变性降低P+肠易激综合症H与饮食前比较(在线补充图10，配对Wilcoxon检验p=1E-19)。同样明显的是，饮食对肠易激综合征患者的菌群组成产生了更大的变化P相比之下,肠易激综合症H，同一病例在两个时间点(基线和饮食中)的样本概况之间的距离更大(在线补充图10，配对Wilcoxon检验p=0.03)。
饮食干预前和期间的微生物组贝塔多样性。(A)肠易激综合征病例的主坐标分析分为两组，显示饮食引发肠易激综合征的转移P(红色)只在肠易激综合征中见不到H受试者(蓝色)或健康对照组(灰色)。(B, C)饮食干预对分类丰度的影响。线性混合模型识别了IBS之间的差异丰富的物种P和肠易激综合症H饮食前和饮食中。中心对数比(CLR)转换丰度的代表物种显示。(B)病原物种，如艰难梭状芽胞杆菌，在肠易激综合征中会减少P在饮食干预。(C)的成员拟杆菌属在IBS中更为丰富P在饮食干预。(D, E)饮食干预对通路丰度的影响。代表路径的相对丰度显示。(D) IBS中可发酵海藻糖二糖的降解程度降低P在饮食干预。(E)肠易激综合征中糖酵解变少P在饮食干预。采用Wilcoxon检验评估组间差异的统计学意义(****p<0.0001， ***p<0.001， **p<0.01， *p<0.05, ns: p>0.05)。盒须显示中位数和IQR。
饮食干预改变了肠易激综合征的分类组成P情况下通过增加拟杆菌水平( 皮肤,b . stercorirosoris)，以及降低病原体水平(包括c . 固执的，链球菌parasanguinis，Paeniclostridium sordellii)对肠易激综合症患者的影响H（图5 b, C)和家庭控制(在线补充图11)．肠易激综合征的功能概况P微生物组也受到饮食干预的影响，例如，产生海藻糖二糖(图5 d)，糖酵解降低到与肠易激综合征患者相当的水平H患者和健康对照者(图5 e)．
在低FODMAP饮食结束后，参与者恢复了正常饮食，尽管有些情况下限制了被确定为触发他们症状的食物(在线补充材料1，饮食干预部分)。尽管3个月随访的数据限制了在这个时间点得出的结论的强度，但与完全饮食限制时相比，两组病例的微生物群多样性似乎没有显著变化(Wilcoxon p=0.12，在线补充图12)，在这些时间点之间，任何细菌类群的丰度都没有显著变化。因此，肠易激综合征的转变P达到健康水平的菌群似乎稳定了至少3个月，并与持续的症状良好相关(图4一)．
讨论
我们在肠易激综合征病例中定义了两种肠道微生物组亚型，基于物种和编码微生物功能的不同特征，以及对低FODMAP饮食的不同临床反应。尽管早期的微生物组文献在涉及肠易激综合征的类群和亚型的存在方面相当不一致，11可能反映了临床异质性、对照选择和方法学等因素，我们的工作与近期更多研究的观察结果一致12日13:杰弗瑞等利用霰弹枪16S rRNA基因的微生物组分析和代谢组学提供IBS微生物组亚型的证据，确定螺杆菌科物种和氨基酸生物合成富集。我们的结果不仅在更大的IBS队列中复制了这种分层，而且基于鸟枪宏基因组数据，他们受益于更大的分类学分辨率(确定了选定的厚壁菌门物种的增加和一个亚群中拟杆菌门物种的减少)和分析微生物组中编码的功能的能力。此外，饮食干预使我们能够描述每个患者亚型的临床反应;在同样的饮食干预后，纳入家庭控制是我们研究的一个独特特征，旨在纠正已知的混杂环境影响。46
我们把肠易激综合征的微生物组亚型称为肠易激综合征p(致病性)和肠易激综合症H(健康)。总的来说，虽然认识到安慰剂效应可能的作用，但我们研究中75%的肠易激综合征病例在低FODMAP饮食后得到改善，以IBS- sss下降超过50点为衡量标准;但肠易激综合征患者的症状反应程度更高P相比之下,肠易激综合症H微生物组。肠易激综合症P微生物群与肠易激综合征明显不同H病例和健康家庭对照，肠易激综合征中不同的细菌种类和基因家族富集P这使我们能够提出潜在的致病机制。
在不良肠易激综合征中P微生物群中，我们看到了一系列进化上不同的厚壁菌门物种的显著富集，包括已知的人类病原体(c . 固执的，c . sordellii而且c . perfringens)，一种与UC相关的病原体(Faecalicatena gnavus,以前叫r . gnavus45)和以前未被确定为人类病原体的已知肠道物种(c . clostridioforme而且Fusicatenibacter saccharivorans)．有趣的是，我们还发现肠易激综合征患者的情况有所改善P乳酸菌的微生物群链球菌parasanguinis而且链球菌timonensis通常在口腔中发现。
在功能层面，肠易激综合征P微生物群在参与碳水化合物代谢的基因和途径中富集。这可能导致厌氧糖酵解和相关的二氧化碳、氢气和甲烷的产生在这些微生物群的个体中增加，从而导致肠道膨胀加剧，导致症状增加。在被确认为fodmap的单糖中，有乳糖和果糖，因此我们的功能性微生物分析提供了一个候选细菌列表，供进一步分析(在线补充图9)．二糖海藻糖不是FODMAP，但如果不能接触到刷缘酶海藻糖酶，例如，由于食物残渣的稠度，它可能进入结肠通过发酵发挥FODMAP样的特性。虽然没有明确禁止，但在低FODMAP饮食中排除的食物和这种双糖含量高的食物(如蘑菇)之间存在交叉。值得注意的是，特定的血统c . 固执的已经进化到渴望代谢海藻糖，从而增加它们的数量47这是一种特定的“致病”细菌种类可能引发肠易激综合征症状的途径。海藻糖可以通过促进特定“致病”细菌种类的生长而引发肠易激综合征症状。
从FODMAP碳水化合物中提取的己糖的微生物代谢在肠道中通过厌氧糖酵解产生丙酮酸。丙酮酸是合成短链脂肪酸的关键代谢物。48我们的通路分析(在线补充图9)预测有几种细菌种类在肠易激综合征中富集P微生物群落包含将丙酮酸转化为丁酸(经典途径)和/或丙酸(丙烯酸酯途径)的基因。49丁酸和丙酸是结肠中与GPR受体41、43(丙酸)和109A(丁酸)结合的主要代谢物:这些SCFAs调节肠染色质细胞中的色氨酸水解酶基因转录，促进色氨酸生成5-羟色胺(5HT);5HT被认为是IBS症状产生的关键因素。50 51此外,在肠易激综合症P在微生物群中，我们观察到色氨酸生物合成基因的富集，这将促进这一机制。
我们还发现肠易激综合征的浓缩P编码组氨酸、精氨酸、鸟氨酸、色氨酸、丙氨酸和苏氨酸等氨基酸生物合成的基因的微生物群(在线补充图8)．有趣的是,李等52发现肠易激综合征患者粪便样本中苏氨酸、色氨酸和苯丙氨酸以及氨基酸代谢物尸胺和腐胺水平升高，为氨基酸代谢改变提供了直接证据。组氨酸是组胺的前体，与肥大细胞释放后肠易激综合征症状的产生有关;组胺本身也能激活这些细胞。53
尽管我们在肠易激综合征中检测到更高水平的特定病原体P我们没有证据表明它们通过已知的毒素毒力因子引起肠易激综合征症状。相反，数据表明在不同厚壁菌门物种中初级代谢途径丰富。我们的分析表明有增加氨基酸生产的潜力;和SCFA通过代谢FODMAP碳水化合物。这类代谢物及其衍生物在结肠内的高浓度可能是有害的，如果在错误的肠道生态位内产生，则可能是病态的，这是一种代谢毒性，导致肠易激综合征症状。我们研究的一个关键发现是肠易激综合征P和肠易激综合症H微生物菌群对低FODMAP饮食干预有不同的细菌群落反应，这为确定作用模式提供了基础。因此，有可能去除诱导饮食成分使病原体饥饿，导致其生长和代谢减少，从而减轻症状，并伴随着共生或共生物种的扩大，导致与健康相关的微生物组。饮食、微生物群和肠易激综合征症状之间的联系P是令人信服的，但需要在将候选生物体引入动物模型后进行研究，以证明这种关系是因果关系。
虽然病例/对照组(n=21)在再次进食FODMAPs 12周后提供了随访样本的数量相对较少，而且有些继续排除特定的含fodmap的食物，但有趣的是，注意到他们的症状(图4一)和微生物(在线补充图12)明显稳定。这证实并可能有助于解释低FODMAP饮食所带来的持久好处。
我们观察到肠易激综合征的不同反应P和肠易激综合症H低FODMAP饮食的微生物组亚型，表明一些肠道微生物组更受饮食干预的影响。根据我们的分析，不清楚肠易激综合征是如何或是否H微生物群有助于肠易激综合征症状，因为它们与家庭对照微生物群难以区分，而且在低FODMAP饮食的反应中没有显著变化。肠易激综合征的症状HFODMAP降低的病例仍有一定改善，这表明这种反应要么与菌群中的非细菌成分有关，如病毒，要么与菌群没有机械联系，或许相反，这反映了膳食成分及其代谢产物对肠道神经元功能或渗透负荷的直接影响，或者在这一组中仅仅是安慰剂效应。
以前的一些研究表明存在微生物定义的IBS亚型，对干预的反应不同。在最近的一项粪便菌群移植研究中，对治疗有反应的肠易激综合征患者显示出类群富集，如拟杆菌，与IBS-SSS的减少呈正相关，与链球菌等病原的减少呈正相关。54在其他研究中，通过商业试剂盒评估的粪便微生物图谱与对低FODMAP饮食的不同反应相关55；粪便挥发性有机化合物的分布(假设反映了微生物组的差异)预测了对低FODMAP饲粮或益生菌的反应。56
我们的研究确实有局限性。样本量相对适中:严格的纳入标准、伴随药物的限制以及需要遵循低FODMAP饮食的家庭控制的要求参与阻碍了招募。饮食信息仅限于低FODMAP饮食干预阶段的最后一周:参与者可能会在必须报告饮食摄入量的那一周遵循更严格的饮食。在这项研究的设计中，除了饮食之外，不可能排除其他可能影响观察到的益处的因素，包括在研究研究中被评估的心理影响、其他研究中描述的安慰剂效应和转诊偏差。我们基于微生物组谱、低FODMAP饮食的转变和临床反应的不同IBS集群的发现，应该在来自不同地理分布和不同饮食习惯的其他人群中得到验证。
发现一种与改善对低FODMAP饮食的反应相关的微生物特征“生物标志物”，如果得到验证，可能会更好地分层和选择可能从该饮食中受益的患者。在肠易激综合症P研究对象，有可能考虑治疗策略，以相同的方向操纵微生物群，实现相同的症状改善，但不需要经历同样严格的饮食限制。此外，对相关微生物的更深入研究可能使我们有机会更好地了解饮食、菌群、代谢物和人类肠道-大脑轴之间的相互作用，这种相互作用导致世界上10%以上的人口出现肠易激综合征症状。
数据可用性声明
数据可在一个公共的、开放访问的存储库中获得。原始测序数据可在ENA研究登录号:erp021923下访问，处理后的数据作为补充材料提交。复制分析所需的源代码和脚本提交在http://github.com/kevinVervier/IBS．
伦理语句
病人同意发表
伦理批准
剑桥中央研究伦理委员会参考文献15/LO/2128予以批准。
致谢
我们要感谢参与研究的患者和家庭控制人员。还有Tracy Papworth, Max Delvincourt, Chris Cederwall和You Yi Hong，他们对患者的识别和招募做出了贡献。该研究由阿登布鲁克慈善信托基金(ACT)、剑桥大学和威康桑格研究所共同资助。该研究也得到了英国国立卫生研究院剑桥生物医学研究中心(BRC-1215-20014)的支持。本文仅代表作者个人观点，不一定代表国家卫生条例或卫生和社会福利部的观点。
参考文献
补充材料
脚注
KV和SM是共同第一作者。
TDL和MP是联合资深作者。
贡献者TL和MP策划了这项研究。SM、MB、NP、CJK和JdlRN进行临床研究和患者评估。粪便标本分别为AA、HB、AN、MS和AZ。KV和NK分析了宏基因组学数据并报告了结果。KV和SM生成了图形和表格。AK和TR对科学讨论做出了贡献。KV, SM, TL和MP撰写了手稿。KV和SM作为担保人对整体内容负责。所有作者讨论了结果并通过了稿件。
资金该研究由阿登布鲁克慈善信托基金(ACT)、剑桥大学和威康桑格研究所(098051)共同资助，并得到英国国立卫生研究院剑桥生物医学研究中心(BRC1215-20014)的支持。
相互竞争的利益TR已获得AbbVie、Arena、阿斯利康、BMS、Celgene、Ferring、Galapagos、Gilead、GSK、LabGenius、Janssen、Mylan、MSD、诺华、辉瑞、山德士、武田和UCB的研究/教育资助和/或演讲/咨询费用。SM获得了艾伯维的研究/教育资助和/或演讲/咨询费。MP获得了武田、吉利德和辉瑞的研究/教育资助和/或演讲/咨询费。TDL是Microbiotica的联合创始人和CSO。
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