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食管
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基于全基因组甲基化分析的Barrett食管和食管腺癌亚型
  1. 明于1，
  2. 肖恩·K马登1，
  3. 马修Stachler2，3.，
  4. Andrew M Kaz1，4，5，
  5. 杰西卡·艾尔斯1，
  6. 人家郭1，
  7. 凯利T卡特1，
  8. 琥珀Willbanks1，
  9. 大J政府1，
  10. 墨索里尼米奥利里1，
  11. Xinsen徐3.，
  12. 亚当低音3.，6，
  13. Apoorva K棉布7，8，
  14. Amitabh翟7，9，10，
  15. 罗宾·艾略特10，11，
  16. 约瑟夫E威利斯10，11，
  17. 桑福德D马科维茨8，10，
  18. 威廉·M Grady1，4
  1. 1临床研究部门，弗雷德·哈钦森癌症研究中心，西雅图，华盛顿美国
  2. 2病理学系，布里格姆妇女医院和哈佛医学院，波士顿，麻萨诸塞州美国
  3. 3.内科肿瘤学系，丹娜-法伯癌症研究所，波士顿，麻萨诸塞州美国
  4. 4医学系的，华盛顿大学医学院，西雅图，华盛顿美国
  5. 5胃肠病学节，普吉特健全医疗保健系统，西雅图，华盛顿美国
  6. 6伊莱和艾德·L·布罗德研究所，剑桥，麻萨诸塞州美国
  7. 7胃肠病学分工，克利夫兰医疗中心，克利夫兰，俄亥俄州美国
  8. 8医学系的，凯斯西储大学，克利夫兰，俄亥俄州美国
  9. 9的肿瘤，克利夫兰大学医院医疗中心，克利夫兰，俄亥俄州美国
  10. 10凯斯综合癌症中心，凯斯西储大学，克利夫兰，俄亥俄州美国
  11. 11病理学系，克利夫兰大学医院医疗中心，克利夫兰，俄亥俄州美国
  1. 对应到美国华盛顿西雅图Fred Hutchinson癌症研究中心临床研究部于明博士和William M Grady博士;myu在}{fredhutch.org，wgrady在}{fredhutch.org

摘要

客观的目的:鉴定食道腺癌(EAC)及其前体巴雷特食管(BE)的DNA甲基化亚型。

设计我们对来自无癌患者(n=59)、EAC (n=23)、正常鳞状食管(n=33)和正常基底(n=9)的非发育不良BE样本进行全基因组DNA甲基化分析，并使用递归分割混合模型确定甲基化亚型。我们评估了9个BE和22个EAC样本的基因组改变，对243个EAC相关基因进行了大规模并行测序，并与转录组数据进行了整合分析，以识别表观遗传抑制基因。我们还用5-Aza-2'-脱氧胞苷(5-Aza-dC)、短发夹RNA敲除和抗癌疗法对EAC细胞系进行了体外实验。

结果我们鉴定并验证了EAC和BE的四种甲基化亚型。高甲基化子型(HM)的EAC具有最多的激活事件ERBB2(p<0.05, Student’s t检验)和最高的全局突变负荷(p<0.05, Fisher’s精确检验)。PTPN13在HM亚型中，异常甲基化优先沉默，在57%的EACs中。在EAC细胞系中，5-Aza-dC处理恢复正常PTPN13显著降低其启动子甲基化(p<0.05, Welch 's t检验)。抑制PTPN13在SK-GT-4 EAC细胞系中的表达促进了增殖、菌落形成和迁移，并增加了ERBB2/EGFR/Src激酶通路的磷酸化。最后，EAC细胞系对拓扑替康、SN-38和palbociclib治疗表现出亚型特异性反应。

结论我们鉴定了BE和EAC中的甲基化子类型。我们进一步证实了EAC甲基化子类型的生物学和临床相关性，这可能最终有助于指导EAC患者的临床管理。

  • 发育不良
  • 胃肠道癌症
  • 甲基化

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2017-314544

来自Altmetric.com的统计

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    本研究的意义

    关于这个问题，我们已经知道了什么?

    • 食管腺癌(EAC)的发病率是所有癌症中上升最快的之一，当被发现时，它通常已经处于晚期，通常对目前使用的治疗方法没有反应。

    • 因此，需要更有效地确定EAC患者的最佳治疗策略。

    • EAC的遗传和表观遗传改变有望更准确地选择EAC和可能的巴雷特食管(BE)患者的治疗。

    • 我们对这些分子变化的理解最近取得了重大进展。

    • EAC和BE中所见的病变间分子异质性的特征及其对理解EAC和BE的生物学和临床护理的意义是一个活跃的研究领域。

    新的发现是什么?

    • 根据DNA甲基化谱，我们在BE和EAC中发现了四个不同的亚型。

    • 我们对EAC中DNA甲基化亚型的分子特征研究发现，EAC中基因组改变的频率增加表皮生长因子受体/ ERBB2高甲基化子和中间甲基化子(HM/IM)亚型的基因。

    • PTPN13该基因编码一种非受体型酪氨酸磷酸酶，通过对EAC的甲基组和转录组进行亚型特异性分析发现。

    • PTPN13在HM EAC的一个亚群中，其表达被异常的甲基化沉默，并可能通过调节致癌的ERBB2/EGFR信号，发挥肿瘤抑制基因的作用。

    • 我们发现对拓扑异构酶1抑制剂、拓扑替康和SN-38以及palbociclib (CDK4/6的靶向抑制剂)的亚型特异性反应在体外EAC的研究。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 基于DNA甲基化的分子亚型的发现可能为了解BE和EAC的分子异质性以及表观遗传改变在EAC肿瘤发生中的功能作用提供了依据。

    • 我们对EAC细胞系的研究显示，甲基化亚型对传统和靶向治疗有明显的敏感性，如果在临床研究中得到验证，这可能用于改善未来EAC患者的精准医疗。

    简介

    食管腺癌(EAC)是美国癌症相关死亡的一个重要原因，5年生存率为15%。1另外令人关注的是，EAC的发病率死亡率在过去三十年中急剧上升。2因此，迫切需要提高我们对EAC分子病理学的理解，并利用这一理解来提高我们预防和管理EAC的能力。

    几乎所有的EAC都起源于巴雷特食管(BE)，这是一种以食管远端肠上皮化生为特征的恶性前病变，被认为是继发于慢性胃食管反流。3.过去半个世纪的研究已经完善了我们对BE→EAC序列的理解，并表明它是一个多步骤的过程，包括非发育不良的巴雷特食管(NDBE，或BE)发展到低级别不良增生，高级不良增生，然后是EAC。4驱动这一序列的主要机制是遗传和表观遗传改变的积累。最近对BE和EAC基因组的研究表明，多个基因的突变，包括TP53，CDKN2A，SMAD4，ERBB2，PIK3CA而且ELMO1，在EAC中常见，也存在于BE中，尽管其频率低于EAC。5 - 9特别注意,TP53突变似乎在BE进展中发挥作用，可能是通过影响基因组稳定性。10 - 12此外,Stachler等11发现了EAC的两类分子，它们因全基因组加倍和突变模式的存在而不同。最近,Secrier等13根据突变特征显示EAC有三种不同的分子亚型。这些研究表明EACs之间存在病灶间的分子异质性，就像其他癌症包括结直肠癌、乳腺癌和脑胶质瘤一样。14 - 16

    除了遗传改变外，表观遗传改变在be和EAC中也很常见。启动子区CpG岛DNA甲基化是一种特殊的表观遗传修饰，可导致肿瘤抑制基因的沉默，并可能驱动癌症的形成。17迄今为止发表的大多数关于BE和EAC中DNA甲基化的研究都局限于对候选基因的小组评估，但已经确定异常甲基化的基因在BE和deac中都存在，它们可能有助于BE→EAC的起始和进展。在18到22岁最近的研究使用HumanMethylation27和HumanMethylation450 (HM450)阵列来识别BE和EAC中的全局甲基化改变，但这些研究通常缺乏验证队列。20 23日24癌症基因组图谱(TCGA)最近发表的一篇论文发现，包括EAC在内的食管癌中存在DNA高甲基化等分子特征。25但这种DNA甲基化特征是否存在于BE中，EAC和BE的甲基化亚型是否存在，尚需进一步研究。

    因此，为了确定基于DNA甲基化模式是否存在BE和EAC的分子亚型，我们使用HM450阵列对59个BE、23个EAC、33个正常鳞状上皮(SQ)和9个眼底样本进行了全基因组DNA甲基化分析。我们确定了四种不同的甲基化亚型。我们评估了基因组的改变，并整合了甲基化组和转录组数据，以表征甲基化亚型。使用EAC原始组织样本和EAC细胞系，我们评估了EAC中基于甲基化的分型是否可以为表观遗传改变的功能作用提供新的见解，并可能有助于指导EAC的治疗决策。

    材料和方法

    在线补充的方法包含实验设计，方法，试剂和分析的细节。

    补充材料

    初级组织样本采集

    经机构审查委员会批准，所有初级EAC样本均来自克利夫兰大学医院医疗中心(克利夫兰，俄亥俄州)。新鲜冷冻正常食管组织(n=7)来自GICaRes生物库(华盛顿大学医学院;经机构审查委员会批准后。通过Barrett食管转化研究网络(BETRNet)获得了33例BE患者的正常SQ、9例EAC患者的基底、59例无癌患者的NDBE样本和23例EAC样本，以及一组独立的16个新鲜冷冻EAC活检样本的福尔林固定石蜡包埋(FFPE)切片和核心。所有FFPE BE/EAC样本均由胃肠道病理学专家复查，并确定为>70% BE或EAC(见网上)补充表1浏览BETRNet样本的人口统计信息)。

    补充材料

    EAC细胞系

    建立的EAC细胞系ESO26, OE33, SK-GT-4, FLO-1, OACM5.1C和OE19通过Sigma Aldrich从欧洲认证细胞培养集合购买。细胞按照储存库的说明在标准条件下培养。JH-EsoAd1是赫克托·阿尔瓦雷斯好心送的礼物。26细胞株在送到我们实验室之前经过了供应商的鉴定。

    DNA制备及HM450阵列数据采集与预处理

    DNA提取和亚硫酸氢盐转换如前所述进行。27DNA样本按照制造商的说明(Illumina)在HM450阵列上处理和运行。在R (V.3.2.2)中读取、预处理和批量校正原始强度数据。经过后续过滤，共得到426 718个探针进行分析。其他HM450阵列数据集包括2015年11月13日从TCGA获得的87个EAC和11个相邻正常组织样本的1级HM450阵列数据(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)和125个EAC样本来自基因表达综合(研究ID: GSE72872)。23

    子类型识别

    在BETRNet EACs中发现了变化最大的探针(mvp, n=1515)。使用MVP甲基化数据进行递归分区混合模型(RPMM)聚类(RPMM R包，V.1.2.0)以识别甲基化亚型。28

    BETRNet样本的靶向测序

    如前所述，使用Picard工具和Burrows-Wheeler校准工具对DNA文库进行预处理。29 30使用MuTect V.1.1.4对单核苷酸变异进行突变分析。31日32我们使用了体细胞Indel检测器工具，它是用于Indel调用的GATK工具的一部分。选择可能的体细胞非同义突变进行描述在网上补充的方法．调用拷贝数变量，然后进行切线归一化，使用工具ReCapSeg V.1.4.4对高方差捕获间隔进行预先过滤。33

    TCGA样本的外显子组测序分析

    完整的外显子组测序文件从TCGA下载并用作MutSig (http://www.broadinstitute.org/cancer/cga/mutsig)及GISTIC (www.broadinstitute.org/cancer/cga/gistic)分析如前所述。34 35

    抑制基因和通路的综合分析

    TCGA EAC样本中Level 3基因表达数据来自Firehose (https://confluence.broadinstitute.org/display/GDAC/Home)．我们应用严格的工作流程来识别表观遗传和转录组抑制的显著的、实质性的和生物学上有意义的证据(在线)补充的方法)．对于差异调节的基因集，我们使用PANTHER (http://www.pantherdb.org)和大卫(https://david.ncifcrf.gov/)．36 37

    定量methylation-specific PCR

    PTPN13采用甲基化特异性定量PCR (qMS-PCR)方法验证临床样本和EAC细胞系中的HM450阵列结果，使用C-L-less-C1方法控制输入DNA量。详细的方法包括qMS-PCR测定引物序列和相对甲基化的计算PTPN13是否在网上提供补充的方法．

    RNA提取

    RNA提取从原代组织样本和EAC细胞系进行如上所述。19

    定量实时聚合酶链反应

    的mRNA水平PTPN13采用SYBR qRT-PCR法检测。TaqMan基因表达测定GUSB表达(Applied Biosystems)用于cDNA加载的规范化。详细的方法和引物序列在网上提供补充的方法．

    5-Aza-2脱氧胞苷(5-Aza-dC)治疗

    如前所述，用5- aza -2 '脱氧胞苷(5-Aza-dC)处理OE33和ESO26细胞系19网上有描述过补充的方法．

    小发夹RNA转染敲除基因

    基于pgipz的短发夹RNA (shRNA)的靶向性构建PTPN13mRNA由Fred Hutchinson研究中心(西雅图，华盛顿)的基因组共享资源核心提供。如前所述进行慢病毒转染。38每个的目标序列PTPN13shRNA结构经直接测序确认，已在网上公布补充的方法．

    细胞增殖检测

    在第0天，细胞以每孔1000个细胞的密度被镀到96孔板上。每天到第4天，加入CellTiter 96水溶液非放射性细胞增殖试验试剂(Promega, USA)，在37°C培养1小时。使用平板阅读器(Molecular Devices, Sunnyvale, California)在490 nm处测量光密度。

    集落形成试验

    细胞被胰蛋白酶化成单细胞悬浮液。在6孔板的每孔中分别镀50和100个细胞，并保持14天以形成菌落。菌落用甲醇固定，用0.01 (w/v)结晶紫染色。在每个细胞系上进行两次独立实验。

    细胞迁移/入侵检测

    细胞活力测量在FlouroBlok插入8毫米孔(24孔格式;Corning Incorporated, Corning, New York)，在相同的插入物上测量细胞侵袭性，插入物中含有100µL或300µg/mL的基质，按制造商说明在无血清培养基中稀释。简单地说,细胞(5×104)分别播种到无基质和有基质的插入膜上。在37°C孵育24小时后，人工去除没有迁移或侵入氟blok插入物气孔的细胞。膜被清洗、固定和染色。在对膜进行荧光成像后，用计算机程序对膜底部的细胞进行计数。在每个细胞系上进行三次独立实验。

    西方墨点法

    Western blotting实验如前所述进行。39有关抗体的详细信息可在网上查阅补充的方法．

    体外药物敏感性试验

    体外药敏试验如前所述进行。40具体方法可在网上查阅补充的方法．以下化合物被用于药物治疗:SN-38和拓泊替康(Sigma Aldrich)和帕波ciclib (Selleckchem)。这些化合物被稀释到二甲基亚砜(DMSO) (Sigma Aldrich)的工作浓度。

    统计分析和数据可视化

    应用R/Bioconductor、MutSig、GISTIC、PANTHER和DAVID统计软件进行分析。R/Bioconductor库包括minfi、va、qvalue、RPMM、ggplot2和ComplexHeatmap。基本脚本可在GitHub (https://github.com/GradyLab)．二项检验用于评估浓缩程度。多种分子数据类型(如启动子甲基化与基因表达)之间的相关性使用斯皮尔曼检验，除非另有说明。我们使用Fisher精确测试评估基因组事件计数数据。采用Benjamini-Hochberg法和错误发现率法对p值进行调整。用学生t检验(1)比较的平均(平均)差异PTPN13甲基化或基因表达，(2)比较两组间增殖和迁移数据。当两组方差不相等且样本量不相等时，采用Welch的t检验。报告的p值是双面的;P <0.05被认为是显著的。GraphPad Prism V.7.0 (GraphPad Software, La Jolla, California)用于计算药敏实验中的p值和EC50值。

    结果

    BE和EAC的全基因组DNA甲基化分析揭示了不同的甲基化亚型

    基于DNA甲基化改变的分子亚类最近已在几种癌症类型中被确认，包括结直肠癌和胶质瘤。16 41在此，我们进行了研究，以确定DNA甲基化亚型是否存在于EAC及其前体BE中。

    首先，我们将基于模型的聚类方法(RPMM)应用于通过BETRNet收集的n=23个EAC样本的HM450数据集。RPMM适用于β分布数据集，包括HM450平台，28它已经被用于确定结肠癌和乳腺癌的分子亚型。41 42我们使用1515个最可变的CpG探针进行聚类(mvp， β-值SD>0.25;在线补充表2)．有趣的是，两个启动子中基因内CpGs的mvp显著富集(55%，p<10)−15)和基因体区(37%，p<10−6)， CpG岛的探针进一步富集(70%，p<10)−15)．

    补充材料

    采用RPMM聚类发现EAC样品中有四种甲基化亚型(图1一个)，根据MVP甲基化模式分别表示为高甲基化(HM)、中间甲基化(IM)、低甲基化(LM)和最小甲基化(MM)。考虑到平均β值>0.6为高甲基化，HM拥有最多的高甲基化CpG探针(n=981)，其次是IM (n=181)， LM (n=58)和MM (n=39)。为了验证子类型分配，我们还使用1515个mvp进行了多维缩放(MDS)，发现RPMM中的子类型指定与二维MDS聚类模式(在线)基本一致补充图1)．

    补充材料

    Heatmaps of methylated CpGs in EAC and BE cases show distinct clusters based on methylation patterns. The clusters were identified with recursive partition modelling using β-value methylation at the 1515 most variable CpG probes (MVPs). (A) MVP heatmap of BETRNet samples, including EACs used for MVP discovery (n=23), NDBE from cancer-free patients (n=59), a representative subset of normal SQ tissues from patients with BE (n=11) and normal fundus (n=9) from patients with EAC. (B) MVP heatmap of independent validation samples from TCGA, including EACs (n=87) and matched normal tissues (n=11). Methylation is measured as β-values from unmethylated or 0 (dark blue) to methylated or 1 (yellow). Methylation subtype annotation: high methylator (HM, yellow); intermediate methylator (IM, coral); low methylator (LM, grey) and minimal methylator (MM, blue). BE, Barrett’s oesophagus; BETRNet, Barrett’s Esophagus Translational Research Network; EAC, oesophageal adenocarcinoma; NDBE, non-dysplastic Barrett’s oesophagus; SQ, squamous; TCGA, The Cancer Genome Atlas.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    EAC和BE病例中甲基化cpg的热图显示基于甲基化模式的不同聚类。利用1515个最可变CpG探针(mvp)上的β值甲基化的递归分区模型识别聚类。(A) BETRNet样本的MVP热图，包括用于发现MVP的EACs (n=23)、无癌患者的NDBE (n=59)、BE患者的正常SQ组织的代表性子集(n=11)和EAC患者的正常眼底(n=9)。(B) TCGA中独立验证样本的MVP热图，包括EACs (n=87)和匹配的正常组织(n=11)。甲基化用β值从未甲基化或0(深蓝色)到甲基化或1(黄色)来测量。甲基化亚型注释:高甲基化(HM，黄色);中间甲基化体(IM，珊瑚);低甲基化产物(LM，灰色)和最小甲基化产物(MM，蓝色)。是,巴雷特食管;Barrett食管转化研究网络; EAC, oesophageal adenocarcinoma; NDBE, non-dysplastic Barrett’s oesophagus; SQ, squamous; TCGA, The Cancer Genome Atlas.

    值得注意的是，MM中的甲基化模式与正常SQ和眼底的甲基化模式相似(图1一个和在线补充图2一个)．病理学家对样本的回顾没有发现亚型之间的肿瘤细胞含量百分比有任何差异，MM亚型样本的肿瘤纯度通过Infinium PurifyR(在线补充的方法并在线补充图3)．我们发现，与相邻的EACs相比，正常匹配的组织中mvp的甲基化水平一致较低(n=7对;在线补充图2 b)．

    补充材料

    补充材料

    为了验证我们在来自BETRNet队列的EAC样本中甲基化亚型的发现，我们使用了来自TCGA的87个EAC和11个正常匹配样本的独立集合(见在线)补充表3查看TCGA EAC队列信息)。用预处理后的mvp (n=1479/1515)进行聚类分析，再次发现HM、IM、LM和MM亚型对应4个不同的聚类(图1 b)．与BETRNet EAC队列相似，与LM和MM亚型相比，这些亚型在很大程度上反映了HM和IM的全局高甲基化补充图4)．

    补充材料

    补充材料

    最后，我们观察到可用的人口统计学特征(年龄、性别或TCGA EACs中的烟草使用情况;与甲基化亚型成员关系(p>0.1,斯皮尔曼的测试)。然后，我们在TCGA (87 EACs)和基因表达综合(gse72872,123 EACs)的独立数据集中进行生存分析，但发现与肿瘤病理分期调整或不调整均无显著相关性(p>0.1, Cox比例风险测试)(在线)补充图5)．

    补充材料

    BE中的甲基化亚型

    为了研究已知的EAC前体BE中甲基化亚型的存在，我们将基于rpm的聚类应用于59个来自无癌患者的NDBE样本。值得注意的是，通过在EAC中识别出的相同mvp，我们再次在NDBE中识别出了四个亚型(图1一个和在线补充图6)．HM、IM、LM和MM亚型中高甲基化MVP的数量(平均β值>0.6)分别为751、88、37和32个，MM be的MVP甲基化模式与匹配的SQ和眼底相似(图1一个)．

    补充材料

    EAC和BE甲基化亚型的体细胞基因组改变

    为了进一步描述EAC甲基化亚型，我们评估了BETRNet EAC队列的基因组改变。我们使用了大规模并行测序和靶向测序面板，其中包含胃食管癌中243个最常改变基因的所有外显子(在线)补充表4 - 5)．10 11我们在29个候选基因中共识别出62个可能致病的体细胞突变，74个基因水平的拷贝数增益(其中28个被认为是高水平扩增，log)2比>2)，335个基因级单拷贝缺失和64个基因级多拷贝缺失。我们还发现TP53所有甲基化亚型的突变。虽然每个亚型的样本数量较少，但其频率较高ERBB2在HM组中发现了事件(COSMIC突变或扩增)(6/ 7,86%)，但在IM和MM亚型中仅发现1例(在线)补充表5)．评估高频率的临床相关性ERBB2在HM亚型的基因组改变中，我们使用标准的ERBB2/HER2免疫组化分析(在线)评估了BETRNet EACs的一个亚群(n=18)中的ERBB2表达补充的方法)．尽管研究结果的重要性受到ERBB2免疫组化试验样本数量的限制，但我们观察到在HM亚型病例中HER2表达增加的频率最高(HM: n=2/5或40%;IM: 1/3或33%;LM: 0/6;MM: 0/2)。

    补充材料

    接下来，我们用上面描述的测序面板(在线)评估了NDBE样本子集(n=9)的基因组改变补充图7)．我们认识到样本的数量是有限的，可能会影响我们的结果的解释，所以我们没有发现BE样本的甲基化亚型之间的基因改变频率有显著差异。

    补充材料

    来证实我们的发现ERBB2事件中，我们使用TCGA EAC样本的外显子组测序数据。总有可能ERBB2激活基因组改变(复发性COSMIC突变或扩增)发生在7/25 (28%)HM亚型、8/26 (31%)IM亚型、1/20 (5%)LM亚型和2/16 (12.5%)MM亚型(在线)补充表6)．为了确定扩大测序覆盖范围的更多样本是否能够发现特定甲基化亚型独有的其他改变，我们接下来评估了TCGA EAC样本集中的突变和拷贝数改变是否存在亚型特异性事件。我们观察到功能丧失增加的趋势ARID1AHM亚型(6/ 25,24%)与IM亚型(2/ 26,8%)、LM亚型(1/ 20,5%)和MM亚型(1/ 16,6%)比较(p= 0.1-0.2, Fisher精确检验)。放大的CDK6在5/26(19%)的IM样本中发现，而其他所有亚型仅在≤1个样本中发现。高层MDM2扩增罕见，但仅在MM亚型中发现(3/ 16,19%)。

    补充材料

    值得注意的是，我们还观察到EAC甲基化亚型之间总体突变负载的显著差异(图2一个)．总体平均突变负荷最高的是HM亚型(10.9 mut/MB)，其次是IM亚型(6.87 mut/MB)。LM (5.19 mut/MB)和MM (5.54 mut/MB)亚型负荷最低(HM vs IM, LM和MM p=0.11, 0.01和0.03，学生t检验)。两个HM样本是突变负载非常高的异常值(在线补充图8)．去除这些样本后，HM亚型的突变负载为7.78 mut/MB，但仍显著高于LM和MM亚型的突变负载(p分别=0.02和0.03,Student 's t检验)。与其他亚型相比，HM亚型的小插入或缺失突变比例也更高(IM、LM和MM分别为15.4% vs 6.0%、7.5%和6.9%;p<0.0001 HM vs任何其他亚型)。

    补充材料

    Characterisation of methylation subtypes in EAC. (A) Mutation loads (mut/MB) calculated using MutSig, and with statistical analysis comparing HM with other subtypes (two-tailed Student’s t-test, p<0.05 is considered statistically significant). (B) BETRNet EAC sample gene alterations detected using sequencing of a panel of genes functionally important in EAC. (C) Venn diagram comparing epigenetically repressed genes across subtypes. (D) Venn diagram comparing differentially expressed miRNAs (DEmiRs) in pairwise subtype comparisons. (E) Volcano plots of miR and DEmiR expression and differential expression test result (t-test, p-unadjusted) in three subtype comparisons (HM vs IM, LM and MM, respectively). The x-axis is the difference in mean expression between subtypes (HM minus IM, LM or MM mean, respectively), while the y-axis is the −log10 (p-unadjusted) from t-tests. COSMIC, catalogue of somatic mutations in cancer; HM, high methylator; IM, intermediate methylator; LM, low methylator; MM, minimal methylator; RTK, receptor tyrosine kinase; TF, transcription factor.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    EAC中甲基化亚型的特征。(A)使用MutSig计算突变负载(mut/MB)，并对HM与其他亚型进行统计分析(双尾Student 's t检验，p<0.05认为有统计学意义)。(B)利用在EAC中具有重要功能的一组基因测序检测到的BETRNet EAC样本基因改变。(C)跨亚型表观遗传抑制基因的维恩图比较。(D)在两两亚型比较中差异表达miRNAs (DEmiRs)的维恩图。(E)三个亚型比较(HM vs IM, LM和MM) miR和DEmiR表达的火山图和差异表达检验结果(t检验，p未调整)。x轴为子类型间均值表达式的差值(分别为HM - IM, LM或MM均值)，y轴为−log10从t (p-unadjusted)。COSMIC，癌症体细胞突变目录;嗯,高methylator;IM,中间methylator;LM、低methylator;毫米,最小methylator;RTK:受体酪氨酸激酶;TF,转录因子。

    总之，纵观BETRNet和TCGA EAC队列，我们确定了32个HM, 31个IM, 26个LM和20个MM样本。对BETRNet和TCGA EAC队列的联合分析表明，结果与在个别数据集中观察到的结果基本一致(表1和在线补充表7)．我们观察到循环的COSMICERBB2与IM亚型(3/ 31,10%)、MM亚型(0/20)或LM亚型(0/26)相比，HM亚型的突变数量较多(6/ 32,19%)(Fisher精确检验，HM vs LM和HM vs MM的p=0.03)。的数量ERBB2与LM亚型(1/ 26,4%)相比，HM亚型(9/ 32,28%)的扩增样本显著增加(Fisher精确检验，p=0.02)。ARID1A甲基化亚型之间的相关性也很强，HM亚型最高(7/ 32,22%)，其次分别是IM亚型(3/ 31,10%)、LM亚型(3/ 26,11%)和MM亚型(1/ 20,5%)。

    补充材料

    把这个表:
    表1

    在合并的BETRNet和TCGA EAC队列中，跨甲基化亚型所选基因的基因组改变频率

    EAC亚型特异性基因及其通路抑制的综合分析

    我们分析了TCGA EACs的HM450甲基化和RNA-seq数据集，以确定启动子甲基化和miRNA表达在EAC甲基化亚型中的差异调节基因(在线)补充图9和在线补充的方法)．

    补充材料

    HM EAC病例表观遗传抑制基因总数最多(n=69个，Spearman 's r <0, p-adjusted <0.05)，亚型特异性数量最多(n=50个，72%)。图2 c,在线补充表8)．其中假定的肿瘤抑制因子与各种癌症类型有关，包括PTPN13，TUSC1，RGS6，TIAM1而且大块43-47(在线补充图10)．hm特异性抑制基因的基因富集测试显示在癌症中重要途径的富集(在线补充表9)．相比之下，使用相同的搜索标准，我们在MM病例中没有发现表观遗传抑制基因，而在LM病例中只有三个。

    补充材料

    补充材料

    补充材料

    我们还比较了甲基化亚型中差异表达的miRNAs及其推测的靶基因(图2 d, E,在线补充的方法,在线补充数据11 - 13和在线补充表10)．与MM亚型相比，HM亚型中miRNAs抑制的差异表达靶基因的基因富集分析(二项检验，p校正<0.05;在线补充表11 - 14)揭示了HM亚型中癌症通路的亚型特异性抑制，包括WNT通路和细胞粘附和信号通路(详情见在线补充结果和方法)．

    补充材料

    补充材料

    异常甲基化的PTPN13在EAC的一个子集中导致其转录抑制

    我们决定专注于一个特定的基因，PTPN13，研究基因沉默对EAC的功能影响。PTPN13之所以选择它，是因为它的启动子高甲基化与HM和IM亚型中主要的抑制基因表达相关。PTPN13编码一种非受体型蛋白质酪氨酸磷酸酶。它被认为是乳腺癌的肿瘤抑制基因48和非小细胞肺癌。49我们采用qMS-PCR方法进行评估PTPN13在一组独立的临床样本中，包括正常食管(n=7)和EAC (n=16)的基因启动子区甲基化。我们检测到低水平PTPN13正常标本甲基化(中位数0.07±0.012)，显著升高PTPN13EAC样品的甲基化(Welch’s t检验，p=0.03)。使用相对甲基化水平>0.1作为甲基化的截止阈值PTPN13，PTPN1356%的EAC样本中甲基化(图3一)．我们进一步分析了PTPN1314个具有有效mRNA的EAC样品的mRNA表达水平与样品的mRNA表达水平相关。PTPN13启动子甲基化状态(图3 b)．我们观察到71.4%的PTPN13甲基化的EAC样品显示低mRNA水平(归一化表达<0.5)(在线)补充图14)．值得注意的是,这PTPN13基因表达在EAC样本中是异质性的，可能反映了基质和肿瘤组织的混合和小样本量。细胞角蛋白对正常SQ上皮细胞污染的评估KRT-14)基因表达50显示这两个异常值的污染水平很高(在线补充图14 b)．相比之下，71.4%的未甲基化EAC样本显示高mRNA水平(规范化表达>8)(在线)补充图14)．确定DNA甲基化在调控PTPN13我们处理了已经甲基化的ESO26和OE33细胞系PTPN135-Aza-dC未检测到mRNA水平。所示图3 c, D5-Aza-dC处理恢复PTPN13两种细胞系中的基因表达和这种基因表达的恢复与启动子DNA甲基化的显著降低相关(Student 's t检验，p<0.5)。

    补充材料

    Aberrant methylation of PTPN13 in a subset of EAC leads to its transcriptional repression. (A) The relative methylation of PTPN13 (normalised to C-Less-C1 control) in normal oesophagus tissues (n=7) and EAC biopsy samples (n=16) was determined using qMS-PCR. The average relative methylation, depicted as a line, is significantly elevated in EAC compared to normal oesophagus (Welch’s t-test, p<0.05). The red dots indicate EAC samples with methylated PTPN13 (see online supplementary methods). (B) The relative DNA methylation level (normalised to C-Less-C1 control) (y-axis) and mRNA expression (normalised to GUSB) of PTPN13 (x-axis) for 14 EAC biopsy samples with available RNA. The mRNA expression was determined using quantitative real-time PCR with GUSB as control gene (see online supplementary methods). The red dots indicate EAC samples with methylated PTPN13. (C–D) A significant transcriptional re-expression of methylated PTPN13 following 5-Aza-dC treatment in OE33 and ESO26 cell lines. Cells were treated with 5 and 10 µM 5-Aza-dC for 72 hours. *Student’s t-test, p<0.05. (E–F) A significant decrease in the relative methylation level of PTPN13 following 5-Aza-dC treatment in OE33 and ESO26 cell lines. *Student’s t-test, p<0.05. 5-Aza-dC, 5-Aza-2’Deoxycytidine; EAC, oesophageal adenocarcinoma; qMS-PCR, quantitative methylation-specific PCR.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    异常甲基化的PTPN13在EAC的一个子集中导致其转录抑制。(A)相对甲基化PTPN13(归一化至C-Less-C1对照)在正常食管组织(n=7)和EAC活检样本(n=16)中使用qMS-PCR进行检测。平均相对甲基化(用一条线表示)在EAC中明显高于正常食管(Welch 's t检验，p<0.05)。红点表示甲基化的EAC样品PTPN13(见在线补充的方法)．(B)相对DNA甲基化水平(归一化至C-Less-C1对照)(y轴)和mRNA表达量(归一化至GUSB)PTPN13(x轴)为14个含有有效RNA的EAC活检样本。用实时荧光定量PCR法测定mRNA的表达GUSB作为对照基因(见网上补充的方法)．红点表示甲基化的EAC样品PTPN13。(C-D)甲基化的显著转录重表达PTPN13 f在OE33和ESO26细胞系中进行5-Aza-dC处理。细胞用5和10µ的m5 - aza - dc处理72 h。*学生的t检验,p < 0.05。(E-F)相对甲基化水平的显著降低PTPN13在OE33和ESO26细胞系中进行5-Aza-dC处理。*学生的t检验,p < 0.05。5-Aza-dC 5-Aza-2'Deoxycytidine;EAC,食管腺癌;qMS-PCR，甲基化特异性定量PCR。

    Inhibition of PTPN13 promotes proliferation, colony formation, migration and key kinase phosphorylation events i n EAC cells. (A) The relative DNA methylation level (normalised to C-Less-C1 control) (y -axis) and mRNA expression (normalised to GUSB) of PTPN13 (x -axis) in seven EAC cell lines. The PTPN13 mRNA level in SK-GT-4 cells is higher than other lines. (B) Daily proliferation assays in SKGT4-PTPN13-shRNA cells versus non-specific scrambled control (NSC) or parental cells. ** Student’ s t-test, p < 0.01. (C) Colony formation assays in NSC cells (two wells on the left) versus PTPN13-shRNA (two wells on the right) at 50 cells or 100 cells seeded per well (original magnification 10×) reveals PTPN13 suppresses colony formation. (D) Compared with mock or NSC cells, transfection with PTPN13-shRNA promoted migration. * Student’ s t-test, p < 0.05 in SK-GT-4 cells. (E) Western blotting revealed enhanced tyrosine phosphorylation in a panel of key kinases including ERBB2-Tyr1268, EGFR-Tyr1068 and Src-Tyr416 in the basal state, which increased with EGF stimulation, in PTPN13-shRNA SK-GT-4 cells compared with NSC cells.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    抑制PTPN13促进EAC细胞增殖、集落形成、迁移和关键激酶磷酸化事件。(A)相对DNA甲基化水平(归一化至C-Less-C1对照)(y轴)和mRNA表达(归一化至GUSB)PTPN13(x轴)在7个EAC细胞系。的PTPN13SK-GT-4细胞的mRNA水平高于其他细胞系。(B) SKGT4-的每日增殖测定PTPN13-shRNA细胞与非特异性打乱对照(NSC)或亲代细胞的比较。**学生t检验，p < 0.01。(C) NSC细胞中的菌落形成测定(左侧两个孔)与PTPN13-shRNA(右侧两孔)每孔50或100个细胞(原始放大倍数10倍)显示PTPN13抑制菌落形成。(D)与模拟细胞或NSC细胞相比，转染PTPN13shrna促进迁移。*学生t检验，SK-GT-4细胞中p < 0.05。(E) Western blotting显示，在基础状态下，ERBB2-Tyr1268、EGFR-Tyr1068和Src-Tyr416等关键激酶的酪氨酸磷酸化增强，在EGF刺激下，酪氨酸磷酸化增强PTPN13-shRNA SK-GT-4细胞与NSC细胞比较。

    抑制PTPN13在EAC细胞中增加细胞生长、集落形成和迁移

    直接考察的功能作用PTPN13在EAC中，我们测定了启动子甲基化和基因表达PTPN13在7个EAC细胞系中我们发现PTPN13在四种EAC细胞系(ESO26, FLO-1, OE33和ESO51)中没有检测到mRNA水平的甲基化，SK-GT-4有更高的PTPN13mRNA水平高于其他细胞系(图4一)．因此，我们选择SK-GT-4进行shRNA敲除研究，以调查其影响PTPN13EAC细胞上的损失。我们用四个PTPN13具有确定目标序列的-特异性shRNAs，对于大多数实验，使用的是实现>减少85%的那个PTPN13转染SK-GT-4细胞与非特异性匆忙对照(NSC)的mRNA水平对比(在线)补充图15)．以确定抑制的功能后果PTPN13在EAC细胞中，我们进行了几次体外试验。与亲代SK-GT-4细胞或SK-GT-4 NSC细胞相比，SK-GT-4细胞稳定转染PTPN13-shRNA在第4天生长显著增加(学生t检验，p<0.01;图4 b)．SK-GT-4PTPN13-shRNA克隆与SK-GT-4-NSC对照细胞相比，形成菌落的能力也有所增加(图4 c)．此外,抑制PTPN13与模拟转染细胞或NSC细胞相比，SK-GT-4细胞的迁移显著增加(Student 's t检验，p<0.05;图4 d)．然而，我们没有观察到细胞入侵能力的显著差异。总的来说，这些结果表明抑制PTPN13促进细胞生长，集落形成和迁移。

    补充材料

    Treatment response in EAC cell lines representative of different methylation groups. (A) DNA methylation subtypes in EAC cell lines were determined by clustering on the HM450 array data (online supplementary methods). In vitro drug sensitivity curves for JH-EsoAd1 and OE33 (HM cell lines) are compared with SK-GT-4 (LM) and OE19 (MM) after 72  hours of exposure to the topoisomerase inhibitor topotecan (B) or SN-38, the active metabolite of irinotecan (C). Cell survival rate (%) is expressed as the percentage of growth relative to DMSO-treated control cells (± SD for the three experiments). DMSO, dimethyl sulfoxide .
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    不同甲基化组代表的EAC细胞系的治疗反应。(A)通过聚类HM450阵列数据确定EAC细胞系中的DNA甲基化亚型(在线)补充的方法)．将JH-EsoAd1和OE33 (HM细胞株)与sk - tt -4 (LM)和OE19 (MM)在暴露于拓扑异构酶抑制剂拓扑替康(B)或伊立替康的活性代谢物SN-38 (C) 72小时后的体外药敏曲线进行比较。细胞存活率(%)表示为相对于dmso处理的对照细胞的生长百分比(±SD为三个实验)。DMSO，二甲基亚砜。

    抑制PTPN13在EAC细胞中导致ERBB2/EGFR酪氨酸激酶信号增强

    PTPN13编码一种非受体型蛋白质酪氨酸磷酸酶。其在EAC中的生物学作用尚未阐明。因此，我们确定是否抑制PTPN13会影响EAC中一组关键激酶的酪氨酸磷酸化状态。所示图4 e时，EGFR-Tyr1068、ERBB2-Tyr1248和Src-Tyr416的磷酸化水平增加PTPN13与NSC对照细胞株相比，EGF刺激能进一步增强SK-GT-4细胞。这些数据表明抑制PTPN13增强EGFR/ERBB2和Src激酶信号。我们还评估了原发性EAC组织中PTPN13蛋白表达和EGFR磷酸化情况。在有限的样本量(n=14)下，我们在两个甲基化EACs中观察到EGFR Tyr1068位点的激活PTPN13减少基因/蛋白质表达(在线补充图16)．进一步，我们检测了PTPN13和phospho-ERBB2 (Tyr1248)在EAC组织微阵列中的蛋白表达。免疫组化分析显示，7.7%的病例(3/39 EAC核)pERBB2 (Tyr1248)表达强(评分2+)，PTPN13表达弱或无(评分≤60)。相比之下，41% pERBB2 (Tyr1248)弱或不存在(评分≤2)的病例(16/39)PTPN13表达强(评分>60)(在线)补充表15)．

    补充材料

    补充材料

    EAC甲基化亚型的细胞毒性化疗疗效不同

    鉴于甲基化亚型之间观察到的不同基因组特征，我们假设来自不同甲基化亚型的EACs对抗癌化疗的反应可能不同。因此，如前所述，我们对可用的EAC细胞系进行DNA甲基化分析，并确定每个细胞系的甲基化亚型(图5一个,在线补充表16和在线补充的方法)．然后，我们测试了两种常用的化疗药物SN-38(伊立替康的活性代谢物)和拓扑替康(都是拓扑异构酶I抑制剂)在代表甲基化亚型的细胞系中的生长抑制效果:JH-EsoAd1和OE33 (HM)， sk - tt -4 (LM)和OE19 (MM)。两株HM细胞株对SN-38和拓扑替康反应相似，与SK-GT-4和OE19细胞株相比，HM细胞株对两种化疗药物均表现出明显的敏感性(图5 b, C)．

    补充材料

    然后我们评估这些细胞系是否对靶向治疗有不同的敏感性。靶向细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的药物目前正在临床试验中进行评估，具有治疗EAC的潜力。考虑到甲基化亚型的基因组改变概况，我们选择评估palbociclib，一种高度特异性的CDK4/6抑制剂。我们发现JH-EsoAd1和OE33 (HM细胞系)对palbociclib反应相似，而OACM5.1C (LM细胞系)对palbociclib更敏感(在线)补充图17)．palbociclib有效阻断CDK4/6活性的能力是通过抑制Rb磷酸化来确定的补充图18)．

    补充材料

    补充材料

    讨论

    用于描述癌症基因组和表观基因组的高通量方法的发展揭示了源自同一组织的癌症之间的分子异质性，为它们的生物学以及自然史和治疗反应中的临床异质性提供了更深入的了解。51-53我们现在通过识别和表征BE和EAC中的DNA甲基化亚型，进一步深入了解这种分子异质性(图1)．值得注意的是，NDBE中的甲基化亚型反映的MVP甲基化模式与EAC中的相似。我们对甲基化和基因组改变的联合分析允许进行一些初步观察。首先，与其他亚型相比，HM亚型表现出明显更高的整体突变负载(图2一个)．其次，对DNA甲基化和基因表达，以及差异microRNA和靶基因表达的综合分析，揭示了基因和网络失调模式的hm特异性差异(图2)．此外，我们的综合分析确定了一系列HM亚型特异性表观遗传沉默的候选基因，包括候选肿瘤抑制基因，PTPN13，是一种非受体型酪氨酸磷酸酶。采用联合正交试验(qMS-PCR和实时定量PCR)对EAC原代组织样本进行独立队列分析，验证了我们的发现PTPN13正常食管组织中甲基化一致较低，EACs显示启动子高甲基化和丢失PTPN13mRNA在EAC原代组织和EAC细胞系中的表达。我们提供的证据表明启动子甲基化导致了PTPN13使用DNMT1抑制剂5-Aza-dC (图3)．

    为了进一步阐明这一HM亚型特异性特征的生物学相关性，我们研究了PTPN13EAC细胞的一些标志性行为的损失和显示PTPN13抑制细胞增殖，菌落形成和迁移。此外,抑制PTPN13导致基础状态下EGFR/ERBB2和SRC激酶关键酪氨酸位点的磷酸化增加，并在EGF刺激下进一步增加(图5)．此外，EAC活检样本的western blotting显示，在一个异常亚群中，EGFR-Tyr1068磷酸化增加PTPN13mRNA和蛋白质水平的高甲基化和沉默表达(在线)补充图16)．EAC组织微阵列中PTPN13和pERBB2-Tyr1248的免疫组化分析表明，ERBB2 (Tyr1248)染色的强磷酸化只存在于PTPN13染色弱或不存在的EACs中(在线)补充表15)．总的来说，这些研究结果支持这样的结论PTPN13是一种HM亚型特异性肿瘤抑制基因，在HM EACs中被表观遗传沉默。有趣的是，我们对DNA甲基化亚型的分子特征研究发现，在HM/IM亚型中，EGFR/ERBB2基因基因组改变的频率增加(表1)．总的来说，我们的甲基化数据PTPN13而且表皮生长因子受体/ ERBB2基因组改变揭示了在EAC的一个子集中激活致癌的ERBB2/EGFR信号的新的分子机制，这突出了ERBB2/EGFR信号通路在EAC的一个子集的病理生理中的重要性。

    我们的实验评估了EAC细胞培养对两种拓扑异构酶I抑制剂和palbociclib (图5和在线补充图17)表明甲基化亚型可能对传统和靶向治疗有明显的敏感性。虽然这些在体外我们的初步研究结果表明，基于DNA甲基化的亚型具有潜在的临床相关性，最终可以用作预后标记或优化特定个体EAC的治疗选择。

    任何HM450数据分析的一个重要考虑因素是组织样本或组织样本中细胞类型含量的异质性会对结果产生偏差的程度。我们仔细考虑了样品中正常组织含量的变化是否可以解释BE和EAC中不同亚型甲基化的差异。专家病理分析显示，在BETRNet和TCGA队列中的所有EAC样本中含有70%的肿瘤组织。从EACs的计算分析来看，HM亚型和MM亚型之间的肿瘤纯度无显著差异。我们进一步观察到甲基化亚型成员与重要组织学(肿瘤细胞核百分比、肿瘤坏死百分比和肿瘤重量)或临床特征(年龄、性别、烟草使用和存活)之间没有显著相关性。基于这些反褶积分析，特定组织学或临床特征的意外肿瘤富集不太可能混淆亚型成员。

    总之，我们通过综合分子特征识别了BE和EAC的四种不同的DNA甲基化亚型。我们的综合分析与泛函相结合在体外研究揭示了一种新的分子机制，EAC细胞通过表观遗传沉默酪氨酸磷酸酶PTPN13激活致癌激酶通路，特别是在HM亚型中。药物治疗实验提供了证据，这些亚型可能对传统化疗药物和靶向治疗有不同的反应。因此，这些亚型的识别为EAC癌变的生物学机制提供了新的认识，有望有助于EAC精准医疗的推广。

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    补充材料

    参考文献

    1. ↵
      2. 节俭美联社，
      3. PandeyaN，
      4. 怀特曼直流
      ．食道腺癌病因学的现状与展望．前肿瘤防治杂志2012；2：11．doi: 10.3389 / fonc.2012.00011
      OpenUrl CrossRef PubMed
    2. ↵
      2. 户珥C，
      3. 米勒米，
      4. 香港CY，等
      ．食道腺癌发病率和死亡率的趋势．癌症2013；119：1149- - - - - -58．doi: 10.1002 / cncr.27834
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    3. ↵
      2. SpechlerSJ
      ．Barrett食管与食管癌风险:一项临床综述．《美国医学会杂志》2013；310：627- - - - - -36．doi: 10.1001 / jama.2013.226450
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    4. ↵
      2. 保尔森TG，
      3. 里德BJ
      ．重点检查Barrett食管和食管腺癌．癌症细胞2004；6：11- - - - - -16．doi: 10.1016 / j.ccr.2004.06.021
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    5. ↵
      2. 里德BJ
      ．反应:re:食管(Barrett’s)癌前组织中9p和17p染色体的克隆扩增和杂合度缺失．美国国立癌症研究所2000；92：1182年,一个- - - - - -3.．doi: 10.1093 / jnci / 92.14.1182a
      OpenUrl CrossRef PubMed
    6. ↵
      2. MaleyCC，
      3. 阿斯个人电脑，
      4. 李X，等
      ．遗传不稳定和克隆扩展的结合预测食道腺癌的进展．癌症Res2004；64：7629- - - - - -33．doi: 10.1158 / 0008 - 5472. -能- 04 - 1738
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    7. ↵
      2. MaleyCC，
      3. 阿斯个人电脑，
      4. 芬利JC，等
      ．遗传克隆多样性预测食道腺癌的进展．Nat麝猫2006；38：468- - - - - -73．doi: 10.1038 / ng1768
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    8. ↵
      2. 里德BJ，
      3. 李X，
      4. 阿斯个人电脑，等
      ．巴雷特食管和食管腺癌:是时候进行新的合成了．Nat牧师癌症2010；10：87- - - - - -101．doi: 10.1038 / nrc2773
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    9. ↵
      2. 李X，
      3. 阿斯个人电脑，
      4. 桑切斯CA，等
      ．Barrett食管肿瘤进展中基于单核苷酸多态性的全基因组染色体拷贝改变、杂合性丧失和非整倍性．癌症Prev Res2008；1：413- - - - - -23．doi: 10.1158 / 1940 - 6207. - capr - 08 - 0121
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    10. ↵
      2. Dulak我，
      3. StojanovP，
      4. 彭年代，等
      ．食道腺癌的外显子组和全基因组测序确定复发的驱动事件和突变复杂性．Nat麝猫2013；45：478- - - - - -86．doi: 10.1038 / ng.2591
      OpenUrl CrossRef PubMed
    11. ↵
      2. Stachler医学博士，
      3. Taylor-Weiner一个，
      4. 彭年代，等
      ．Barrett食管与腺癌的配对外显子组分析．Nat麝猫2015；47：1047- - - - - -55．doi: 10.1038 / ng.3343
      OpenUrl CrossRef PubMed
    12. ↵
      2. Ross-InnesCS，
      3. BecqJ，
      4. 沃伦一个，等
      ．全基因组测序为Barrett食管和食管腺癌的克隆结构提供了新的见解．Nat麝猫2015；47：1038- - - - - -46．doi: 10.1038 / ng.3357
      OpenUrl CrossRef PubMed
    13. ↵
      2. Secrier米，
      3. 李X，
      4. 德席尔瓦N，等
      ．食道腺癌的突变特征定义了病因学上不同的亚组，并与治疗相关．Nat麝猫2016；48：1131- - - - - -41．doi: 10.1038 / ng.3659
      OpenUrl
    14. ↵
      2. 格雷迪WM，
      3. CarethersJM
      ．结直肠癌发病机制中的基因组和表观遗传不稳定性．胃肠病学2008；135：1079- - - - - -99．doi: 10.1053 / j.gastro.2008.07.076
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    15. ↵
      2. 琼森G，
      3. StaafJ，
      4. Vallon-ChristerssonJ，等
      ．通过阵列比较基因组杂交鉴定的乳腺癌基因组亚型显示出独特的分子和临床特征．乳腺癌Res2010；12：R42．doi: 10.1186 / bcr2596
      OpenUrl CrossRef PubMed
    16. ↵
      2. NoushmehrH，
      3. WeisenbergerDJ，
      4. 进行K，等
      ．确定了一个CpG岛甲基化表型，定义了一个不同的胶质瘤亚组．癌症细胞2010；17：510- - - - - -22．doi: 10.1016 / j.ccr.2010.03.017
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    17. ↵
      2. 琼斯巴勒斯坦权力机构，
      3. Baylin某人
      ．癌症的表观基因组学．细胞2007；128：683- - - - - -92．doi: 10.1016 / j.cell.2007.01.029
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    18. ↵
      2. 欧洲航空防务与航天公司CA，
      3. 主房车，
      4. WickramasingheK，等
      ．食道腺癌进展的表观遗传模式．癌症Res2001；61：3410- - - - - -8．
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    19. ↵
      2. Kaz我，
      3. 罗Y，
      4. Dzieciatkowski年代，等
      ．Barrett食管向食管腺癌发展过程中PKP1异常甲基化．癌症基因的染色体2012；51：384- - - - - -93．doi: 10.1002 / gcc.21923
      OpenUrl PubMed
    20. ↵
      2. 徐E，
      3. 顾J，
      4. 鹰等，等
      ．全基因组甲基化分析显示Barrett食管和食管腺癌有类似的模式．致癌作用2013；34：2750- - - - - -6．doi: 10.1093 / carcin / bgt286
      OpenUrl CrossRef PubMed
    21. ↵
      2. 舒尔曼K，
      3. Sterian一个，
      4. Berki一个，等
      ．p16、RUNX3和HPP1的失活发生在巴雷特相关肿瘤进展的早期，并预测进展风险．致癌基因2005；24：4138- - - - - -48．doi: 10.1038 / sj.onc.1208598
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    22. ↵
      2. 克莱门特G，
      3. 布伦瑞克R，
      4. PasquierN，等
      ．Barrett食管肿瘤发展过程中Wnt信号通路的改变．致癌基因2006；25：3084- - - - - -92．doi: 10.1038 / sj.onc.1209338
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    23. ↵
      2. 克劳斯l，
      3. 第五次祈祷K，
      4. Loffler卡，等
      ．食管腺癌中cimp样亚型的鉴定及染色体分离和纺锤体组装通路成员的异常甲基化．致癌作用2016；37：356- - - - - -65．doi: 10.1093 / carcin / bgw018
      OpenUrl CrossRef PubMed
    24. ↵
      2. Kaz我，
      3. 黄CJ，
      4. 罗Y，等
      ．巴雷特食管和食管腺癌的DNA甲基化谱揭示了独特的甲基化特征和分子亚类．表观遗传学2011；6：1403- - - - - -12．doi: 10.4161 / epi.6.12.18199
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    25. ↵
      项目组:美国国立卫生研究院．食管癌的综合基因组特征．自然2017；541：169- - - - - -75．doi: 10.1038 / nature20805
      OpenUrl CrossRef PubMed
    26. ↵
      2. 阿尔瓦雷斯H，
      3. Koorstra简森-巴顿，
      4. 在香港SM，等
      ．Barrett食管相关腺癌细胞系的建立与鉴定．癌症杂志其他2008；7：1753- - - - - -5．
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    27. ↵
      2. 罗Y，
      3. 黄CJ，
      4. Kaz我，等
      ．DNA甲基化特征的差异揭示了从腺瘤到结直肠癌的多种进展途径．胃肠病学2014；147：418- - - - - -29．doi: 10.1053 / j.gastro.2014.04.039
      OpenUrl CrossRef PubMed
    28. ↵
      2. 实习医生EA，
      3. 克里斯坦森公元前，
      4. 叶射频，等
      ．基于模型的DNA甲基化阵列数据聚类:一种针对混合beta分布的高维数据的递归划分算法．BMC生物信息学2008；9：365．doi: 10.1186 / 1471-2105-9-365
      OpenUrl CrossRef PubMed
    29. ↵
      2. 麦肯纳一个，
      3. 汉娜米，
      4. 银行E，等
      ．基因组分析工具包:用于分析下一代DNA测序数据的MapReduce框架．基因组Res2010；20.：1297- - - - - -303．doi: 10.1101 / gr.107524.110
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    30. ↵
      2. DePristo妈，
      3. 银行E，
      4. 府绸R，等
      ．利用下一代DNA测序数据进行变异发现和基因分型的框架．Nat麝猫2011；43：491- - - - - -8．doi: 10.1038 / ng.806
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    31. ↵
      2. CibulskisK，
      3. 劳伦斯女士，
      4. 卡特SL，等
      ．不纯和异质性癌症样本中体细胞点突变的敏感检测．生物科技Nat》2013；31：213- - - - - -9．doi: 10.1038 / nbt.2514
      OpenUrl CrossRef PubMed
    32. ↵
      2. 拉莫斯啊，
      3. 利希滕斯坦l，
      4. 古普塔米，等
      ．Oncotator:癌症变体注释工具．哼Mutat2015；36：E2423- - - - - -9．doi: 10.1002 / humu.22771
      OpenUrl CrossRef PubMed
    33. ↵
      2. LlwbmabolN
      ．CLIA全外显子组测序的体细胞拷贝数改变的验证——第107届美国癌症研究协会年会论文集．2016；76：3641．
    34. ↵
      2. 劳伦斯女士，
      3. StojanovP，
      4. 波兰语的P，等
      ．癌症的突变异质性和寻找新的癌症相关基因．自然2013；499：214- - - - - -8．doi: 10.1038 / nature12213
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    35. ↵
      2. MermelCH，
      3. 舒马赫SE，
      4. 山B，等
      ．GISTIC2.0促进了人类癌症病灶体细胞拷贝数改变靶点的敏感和自信的定位．基因组医学杂志2011；12：R41．doi: 10.1186 / gb - 2011 - 12 - 4 - r41
      OpenUrl CrossRef PubMed
    36. ↵
      2. 心肌梗死H，
      3. 黄X，
      4. Muruganujan一个，等
      ．PANTHER版本11:扩展了来自基因本体和Reactome路径的注释数据，并增强了数据分析工具．核酸Res2017；45：D183- - - - - -9．doi: 10.1093 / nar / gkw1138
      OpenUrl CrossRef PubMed
    37. ↵
      2. 黄穴鸟，
      3. 谢尔曼英国电信，
      4. Lempicki类风湿性关节炎
      ．利用DAVID生物信息学资源对大型基因表进行系统综合分析．Nat Protoc2009；4：44- - - - - -57．doi: 10.1038 / nprot.2008.211
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    38. ↵
      2. 罗Y，
      3. Kaz我，
      4. Kanngurn年代，等
      ．NTRK3是一种潜在的肿瘤抑制基因，通常在结直肠癌中被表观遗传机制灭活．公共科学图书馆麝猫2013；9：e1003552．doi: 10.1371 / journal.pgen.1003552
      OpenUrl CrossRef PubMed
    39. ↵
      2. 余米，
      3. TrobridgeP，
      4. 王Y，等
      ．体内TGF-β信号失活和PTEN缺失共同诱导结肠癌发生．致癌基因2014；33：1538- - - - - -47．doi: 10.1038 / onc.2013.102
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    40. ↵
      2. 金J，
      3. 狐狸C，
      4. 彭年代，等
      ．先前存在的致癌事件影响erbb2扩增的胃食管腺癌曲妥珠单抗的敏感性．中国投资2014；124：5145- - - - - -58．doi: 10.1172 / JCI75200
      OpenUrl CrossRef PubMed
    41. ↵
      2. HinoueT，
      3. WeisenbergerDJ，
      4. 兰格CP，等
      ．结直肠癌中异常DNA甲基化的基因组尺度分析．基因组Res2012；22：271- - - - - -82．doi: 10.1101 / gr.117523.110
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    42. ↵
      癌症基因组图谱N.人类乳腺肿瘤的全面分子图谱．自然2012；490：61- - - - - -70．
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    43. ↵
      2. 里德基米-雷克南，
      3. Korobko4，
      4. NinkinaN，等
      ．Hunk/ mark -v是肠细胞增殖的负调控因子．BMC癌症2015；15：110．doi: 10.1186 / s12885 - 015 - 1087 - 2
      OpenUrl
    44. ↵
      2. 杨J，
      3. 普拉特LT，
      4. MaityB，等
      ．RGS6是一种重要的肿瘤抑制因子，通过促进p53激活和DNMT1下调来防止膀胱癌的发生．Oncotarget2016；7：69159- - - - - -72．doi: 10.18632 / oncotarget.12473
      OpenUrl
    45. ↵
      2. Dromard米，
      3. BompardG，
      4. Glondu-Lassis米，等
      ．推测肿瘤抑制基因PTPN13/PTPL1通过胰岛素受体底物-1去磷酸化诱导细胞凋亡．癌症Res2007；67：6806- - - - - -13．doi: 10.1158 / 0008 - 5472. -能- 07 - 0513
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    46. ↵
      2. 山Z，
      3. Shakoori一个，
      4. Bodaghi年代，等
      ．TUSC1是一个公认的肿瘤抑制基因，可以抑制肿瘤细胞在体外和体内的生长．《公共科学图书馆•综合》2013；8：e66114．doi: 10.1371 / journal.pone.0066114
    47. ↵
      2. 徐K，
      3. 田X，
      4. 哦SY，等
      ．成纤维细胞tiam1 -骨桥蛋白通路调节乳腺癌侵袭和转移．乳腺癌Res2016；18：14．doi: 10.1186 / s13058 - 016 - 0674 - 8
      OpenUrl PubMed
    48. ↵
      2. Glondu-Lassis米，
      3. Dromard米，
      4. Lacroix-Triki米，等
      ．PTPL1/PTPN13通过直接灭活Src激酶调控乳腺癌细胞的侵袭性．癌症Res2010；70：5116- - - - - -26．doi: 10.1158 / 0008 - 5472. -能- 09 - 4368
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    49. ↵
      2. Scrima米，
      3. 德马科C，
      4. De维塔F，等
      ．非受体型酪氨酸磷酸酶PTPN13是非小细胞肺癌的抑癌基因．是中草药2012；180：1202- - - - - -14．doi: 10.1016 / j.ajpath.2011.11.038
      OpenUrl CrossRef PubMed
    50. ↵
      2. Viaene人工智能，
      3. BaertJH
      ．正常人食管上皮细胞角蛋白mrna的表达．阿娜特列克1995；241：88- - - - - -98．doi: 10.1002 / ar.1092410112
      OpenUrl CrossRef PubMed
    51. ↵
      癌症基因组图谱研究:全面的基因组特征定义了人类胶质母细胞瘤基因和核心途径．自然2008；455：1061- - - - - -8．
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    52. ↵
      2. Pece年代，
      3. TosoniD，
      4. Confalonieri年代，等
      ．乳腺癌的生物学和分子异质性与其肿瘤干细胞含量相关．细胞2010；140：62- - - - - -73．doi: 10.1016 / j.cell.2009.12.007
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    53. ↵
      癌症基因组图谱网络．人类结肠癌和直肠癌的综合分子特征．自然2012；487：330- - - - - -7．doi: 10.1038 / nature11252
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学

    脚注

    • MY、SKM和MS贡献相等。

    • 贡献者研究概念与设计:MY, WMG, AMK, AB, JEW, SDM。数据采集:MY, MS, AMK, JA, YG, KTC, AW, TJH, RMO, RE, JEW。数据分析和解释:MY, SM, MS, WMG。稿件起草:MY, SM, MS, WMG。对重要知识内容:MY, SDM, MS, AB, AC, WMG的手稿进行批判性修改。资助:MY, SDM, WMG。试剂/材料/分析支持:XX, JEW, AC, SDM。研究指导:MY, WMG。

    • 资金这些研究由NIH资助:UO1CA152756, 5P30CA015704, U54CA163060, UO1CA086402和UO1CA182940给WMG;P50CA150964长效磺胺;和T32DK007742到MY。格雷戈里奥家族基金会和普莱斯家族基金会也向WMG提供资金。这份材料是工作的结果，部分由弗吉尼亚州普吉特湾医疗保健系统的资源支持。本文仅代表作者个人观点，并不代表退伍军人事务部的观点。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 病人的同意已取得近亲同意。

    • 伦理批准克利夫兰大学医院医疗中心(克利夫兰，俄亥俄州)审查委员会批准。

    • 来源和同行评审不是委托;外部同行评议。

    • 数据共享声明HM450阵列数据将存放在GEO中，并可在那里访问。如需其他资料，欢迎与通讯作者联系并提出要求。

    • 作者注登录代码:89个样本的HumanMethylation450阵列数据(n=23 EAC;n=59个来自无癌患者;n=7个来自EAC患者的BE)已被保存在基因表达集合中，登录号为GSE81334。