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摘要gydF4y2Ba
目的:gydF4y2Ba目前在人Barrett食管中克隆扩增的模型是基于多段水平的异质、流动纯化活检分析。从这些活检样本中检测到相同的突变指纹，这导致了一种建议，即具有选择优势的突变克隆可以以竞争克隆为代价，克隆扩展到整个巴雷特段(选择性扫描到固定模型)。我们的目标是通过微观解剖和基因分析个体隐窝，以更高的分辨率评估克隆性。巴雷特化生和新鳞状岛的组织发生从未被证实。我们研究了食管腺鳞状管作为两种上皮亚型的来源。gydF4y2Ba
方法:gydF4y2Ba巴雷特活检和食道切除术块上的个体隐窝被解剖。肿瘤抑制基因杂合性缺失的测定，gydF4y2Bap16gydF4y2Ba而且gydF4y2Bap53gydF4y2Ba点突变是在隐窝的基础上进行的。病例的连续新鳞状岛和柱状化生与食管鳞状管被确定。通过激光捕获显微解剖分离组织并进行基因分析。gydF4y2Ba
结果:gydF4y2Ba个体隐窝解剖揭示了在整个活检分析中被掩盖的突变模式。食管切除术标本的解剖表现出明显的克隆异质性，存在多个独立的克隆。我们确定了gydF4y2Bap16gydF4y2Ba在食管腺管的鳞状上皮中出现点突变，也出现在邻近的化隐窝中，而从鳞状管中产生的新鳞状岛相对于周围的Barrett发育不良是野生型的。gydF4y2Ba
结论:gydF4y2Ba通过研究隐窝水平的克隆性，我们证明巴雷特的异质性来自于多个独立的克隆，与之前描述的克隆扩展的选择性扫描到固定模型相反。我们认为位于整个食管的鳞状腺管是祖细胞的来源，该祖细胞可能易受基因突变的影响，从而转化为巴雷特化生上皮。此外，这些数据表明，野生型导管可能是新鳞状岛屿的来源。gydF4y2Ba
数据来自Altmetric.comgydF4y2Ba
巴雷特食管是在十二指肠胃食管反流引起炎症和溃疡时，由化生腺上皮取代正常食管分层鳞状上皮。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba食道腺癌可由化生-发育不良-癌序列(MCS)的进展引起，Barrett食管的存在使食道腺癌的风险增加30- 40倍。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba
对一组巴雷特食管患者的系列活组织检查和分子分析使研究人员能够研究MCS进展过程中常见肿瘤抑制基因突变模式的演变。这些纵向克隆排序研究表明，基因和表观遗传失活gydF4y2Ba周期蛋白依赖性激酶N2gydF4y2Ba（gydF4y2Bap16gydF4y2Ba)和基因失活gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba（gydF4y2Bap53gydF4y2Ba)肿瘤抑制基因在MCS早期出现gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba88%的发育不良前巴雷特食管组织有可检测到的gydF4y2Bap16gydF4y2Ba病变。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba克隆的演示gydF4y2Bap16gydF4y2Ba而且gydF4y2Bap53gydF4y2Ba巴雷特食管的长段病变gydF4y2Ba4gydF4y2Ba5gydF4y2Ba表明一种常见的前体病变经历了克隆扩增，并导致了MCS进展作为序列肿瘤抑制基因失活导致选择性生长优势的结果的建议。生长优势导致突变无性系的优先扩张，当一个突变在整个领域扩张，消灭所有竞争无性系时，它被称为“固定”。“选择性扫描”是自然选择驱使突变固定的过程。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba7gydF4y2Ba有人认为两者都有损失gydF4y2Bap16gydF4y2Ba等位基因倾向于选择性扫描gydF4y2Bap16gydF4y2Ba突变固定发生在Barrett食管发展的早期。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba相似的论证gydF4y2Bap16gydF4y2Ba不同水平Barrett食管长段活检材料的杂合度(LOH)丢失、甲基化和点突变模式支持广泛的克隆扩增和固定突变。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba然而，表型和基因型异质性也被描述在一些巴雷特的片段gydF4y2Ba4gydF4y2Ba5gydF4y2Ba巴雷特片段的克隆多样性最近已被证明与腺癌的进展有关。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba
尽管多年的积极研究，巴雷特食管的组织发生从未被证实。提出了不同的理论:胃贲门近端移位;食管腺管鳞状上皮的再分化和细胞定植。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba10gydF4y2Ba类似的问题还存在于抑酸或内镜消融治疗后巴雷特组织内可能出现的新鳞状岛的起源。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba12gydF4y2Ba保尔森gydF4y2Ba等gydF4y2Ba13gydF4y2Ba表明这些鳞状岛屿通常是遗传上的野生型，尽管周围是变异的巴雷特组织。他们排除了相邻正常鳞状上皮的侵蚀，只包括那些出现孤立鳞状岛的患者，但无法确定基因正常组织的来源，而基因正常组织可能在巴雷特食管治疗后的再上皮形成中具有重要的临床作用。gydF4y2Ba
迄今为止，大多数克隆性研究都是在异质流纯化的整个活检样本上进行的。在这项工作中，我们的目标是:(1)在一个隐窝一个隐窝的水平上研究克隆性，避免与污染正常基质有关的问题;(2)食管腺鳞状管是否为Barrett柱状上皮和新鳞状岛的潜在来源。gydF4y2Ba
材料与方法gydF4y2Ba
组织和玻片gydF4y2Ba
从莱斯特总医院病理档案中获得石蜡包埋活检(5名患者的6个活检)和食管切除术块(4块来自患者1,4块来自患者2,2块来自患者3)。根据英国胃肠病学会2005年指南(gydF4y2Bawww.bsg.org.ukgydF4y2Ba)，由至少两名病理学家进行。连续切割5 μm截面。切片1-3和5-7安装在P.A.L.M.膜载玻片上(P.A.L.M. Microlaser Technologies, Benried, Germany)，并用亚甲基绿染色。用苏木精伊红(H&E)染色。gydF4y2Ba
激光捕捉显微解剖(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba）gydF4y2Ba
使用H&E载玻片确定适合解剖的隐窝。在亚甲基绿染色的载玻片上也发现了相同的隐窝。从六个连续载玻片中切割出单独的隐窝切片，并使用P.A.L.M.激光显微解剖系统将其弹射到eppendorfs的胶粘剂盖帽中。在需要进行微卫星分析的地方，对固有板的一系列区域进行微解剖。盖上弹射切片浸泡在12 μl蛋白酶K溶液中(Arcturus Bioscience, Mt View, California, USA)。分离隐窝后，将残留的上皮组织弹射入单管，用30 μl蛋白酶K浸泡gydF4y2Bap53gydF4y2Ba基因筛查。阴性对照管含12 μl蛋白酶K溶液，不含激光捕获材料。然后将试管在4.5℃离心gydF4y2BaggydF4y2Ba1分钟，65°C孵育过夜。在95°C孵育10分钟使蛋白酶K变性，然后将裂解液储存在- 20°C。gydF4y2Ba
免疫细胞化学gydF4y2Ba
细胞角蛋白7染色和细胞角蛋白13染色分别显示腺上皮和鳞状上皮分化。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba15gydF4y2Ba食管切除块以4 μm的高度连续切片，置入载玻片上。切片用标准方法脱蜡再水化。3% H阻断内源性过氧化物酶gydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba2gydF4y2Ba在pH为6的柠檬酸钠缓冲液中微波10分钟即可获得抗原。将载玻片在3%牛血清白蛋白和磷酸盐缓冲盐水(PBS)中孵育15分钟。载玻片用抗细胞角蛋白7的小鼠单克隆抗体进行一抗孵育(克隆OV-TL 1:100稀释;Abcam, Cambridge, UK)或细胞角蛋白13(克隆AE8 1:200稀释;Abcam)。接着是生物素化的兔抗小鼠二抗，然后应用1:500稀释的过氧化物酶偶联链霉亲和素第三层(链- hrp;Dako, Glostrup，丹麦)。每层涂敷45分钟，层与层之间进行三次5分钟的PBS清洗。然后用3,3-二氨基联苯四盐酸盐溶液(DAB;Sigma，普尔，英国)浸泡2分钟，然后用自来水冲洗，并进行轻度苏木精复染。阳性对照组织为十二指肠(ck7)和扁桃体(ck13)。 Negative controls underwent all steps but were incubated with PBS instead of the primary antibody solution.
嵌套聚合酶链反应和测序gydF4y2Ba
设计第1轮和第2轮引物扩增5-9的外显子gydF4y2Bap53gydF4y2Ba外显子2gydF4y2Bap16gydF4y2Ba，使用primer 3网站(麻省理工学院，剑桥，马萨诸塞州，美国)。第一轮寡核苷酸引物对被专门设计用于扩增一个区域，该区域包括在第二轮聚合酶链反应(PCR)中使用的引物所覆盖的扩增子。引物优化确定了每个引物对的最佳试剂浓度和退火温度。引物序列列于补充信息(补充表1A-C)。两个PCR步骤都在Omni PCR UV罩中进行，以尽量减少污染(Bioquell, Andover, Berkshire, UK)。只有阴性对照管未受污染的产品才能进行测序。PCR产物在ABI 3100 DNA测序仪(Applied Biosystems, Foster City, California, USA)上使用BigDye终止器循环测序进行测序。所获得的序列直接与修订后的剑桥参考序列进行比较，并将任何已识别的突变与癌症体细胞突变目录(COSMIC)数据库(gydF4y2Bawww.sanger.ac.ukgydF4y2Ba)(英国剑桥)。从食管腺鳞状管工作的解剖裂解液中重复测序两次。gydF4y2Ba
微卫星分析gydF4y2Ba
3个微卫星标记;D5S346 (gydF4y2BaAPCgydF4y2Ba基因)，D9S932 (gydF4y2Bap16gydF4y2Ba基因)和D17S786 (gydF4y2Bap53gydF4y2Ba基因)，用于LOH分析。构成纯合子标记被评分为无信息。正向寡核苷酸引物在5 '端用羧基荧光素(FAM)荧光标记(Sigma)标记。PCR扩增使用LA TAKARA试剂盒(TAKARA Bio，志贺，日本)。PCR产物在ABI 3100测序仪(Applied Biosystems)和基因型2.5软件(perkins - elmer, Boston, Massachusetts, USA)上进行分析。在每个标记点上，如果受影响隐窝中一个等位基因峰值下的面积小于另一个等位基因的0.5倍或大于2倍，在使用结构DNA校正相关区域后(固有层组织的微解剖区域)，则认为存在杂合度损失。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
使用双尾Fisher在Prism 4.0软件(Graphpad software, San Diego, California, USA)上的精确测试，分析了个体隐窝点突变和肿瘤抑制基因等位基因丢失之间的关联。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
活组织检查gydF4y2Ba
从5名患者的6个活检中解剖了37个单独的隐窝和7个鳞状岛。从活检样本中分析个体隐窝可检测LOH模式gydF4y2Bap16gydF4y2Ba,gydF4y2Bap53gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba腺瘤性大肠息肉病gydF4y2Ba（gydF4y2BaAPCgydF4y2Ba)肿瘤抑制基因，当整个活检切片被消化和分析时，这是无法证明的。这可能是整个活检样本中正常间质稀释作用的结果(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba和补充gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba）gydF4y2Ba
Oesophagectomy块gydF4y2Ba
从3名患者的10个食道切除术块中分离出127个Barrett隐窝和14个鳞状岛。鳞状岛被定义为被化生组织完全包围和吞噬的鳞状黏膜区域。细胞角蛋白13抗体上基鳞状岛免疫染色显示鳞状分化。在所有食道切除术组中均发现LOH模式的克隆异质性和已鉴定的点突变。识别不同的点突变是证明克隆性的有力工具，一位患者有两个不同的点突变gydF4y2Bap16gydF4y2Ba来自不同块的隐窝的点突变表明至少存在两个独立的克隆(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。在整个街区的每一个解剖地穴中都没有发现单一的固定突变，尽管有一些gydF4y2Bap53gydF4y2Ba点突变存在于同一患者的多个块中(补充gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。对每个点突变和等位基因丢失计算个体Fisher的精确测试。计算出的p值被制成表格，并显示了之间的显著关联gydF4y2Bap53gydF4y2Ba点突变和三个等位基因中的任何一个的丢失。两者之间没有发现联系gydF4y2Bap16gydF4y2Ba点突变和肿瘤抑制基因LOH。gydF4y2Ba
食管腺鳞状管gydF4y2Ba
除了一个被解剖的鳞状岛屿外，其他岛屿都是野生型的，尽管它们经常被变异的巴雷特隐窝所包围。野生型鳞状岛状细胞过度生长突变的Barrett食管隐窝为薄表面层，这与先前的结果一致，特别是在尝试对Barrett进行消融治疗后。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba此外，通常发现鳞状岛位于食管腺的深层。在一个病例中，发现一个鳞状的岛状物从食管腺管中长出来，侵犯Barrett 's食管的一块区域(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。显微解剖周围的巴雷特上皮发现gydF4y2Bap53gydF4y2Ba无意义点突变;但下位鳞岛及邻近食管腺鳞管均可见gydF4y2Bap53gydF4y2Ba野生型，表明存在与周围巴雷特发育不良不同的克隆。在三个组织块中，也有可能鉴定出与化生巴雷特隐窝连续的食管鳞状管上皮，这与Coad的发现相似gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba16gydF4y2Ba在一个病例中，对化生上皮进行细致的显微解剖，发现在细胞外显子2中有沉默点突变gydF4y2Bap16gydF4y2Ba，也可见于分开解剖的鳞状导管(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。该突变是非编码的，因此不太可能是导致化生转变的始祖突变，但确实可以作为一种有用的克隆标记，显示两种上皮类型的克隆起源，并表明化生上皮起源于鳞状导管起源。在食道腺泡中也检测到同样的突变，提示突变的细胞子代的双向流动与在布伦纳腺中看到的相似。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
本研究通过研究个体隐窝的克隆来源，而不是纯化的整个活检标本，改进了先前在Barrett食管的克隆研究。我们在这里已经证明，单个活组织检查可以是表型和基因异质性的，对整个活组织检查样本的分析掩盖了在个体隐窝分析中发现的一些突变。因此，对整个活检样本的遗传分析，即使是那些靶向性很好的样本，也可能无法检测到所有的突变或克隆，这让人怀疑它们作为巴雷特食管监测生物标志物的用途，因为样本中的少数克隆可能无法检测到。gydF4y2Ba
在所有病例中，大型食管切除术块的解剖也显示出相当大的表型和基因型异质性。gydF4y2Bap16gydF4y2Ba点突变仅限于单个基因块，与任何等位基因的丢失无显著相关性;然而，两者之间存在显著相关性(Fisher精确检验p<0.004)gydF4y2Bap53gydF4y2Ba三种肿瘤抑制基因的点突变和等位基因缺失。这与TP53蛋白的细胞周期检查点活性的功能丧失是一致的，然后允许广泛的，大规模的遗传变化。此外,gydF4y2Bap53gydF4y2Ba点突变，虽然不是在每个隐窝中都能看到，但经常出现在单个食管切除术标本的多个块中，这表明广泛而深远的克隆扩增是强烈选择优势的结果gydF4y2Bap53gydF4y2Ba损失将提供(补充)gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。这与Prevo的研究结果相似gydF4y2Ba等gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba但是我们的个体隐窝分析技术也允许检测竞争的p53野生型克隆，这可能在整个活检样本中被掩盖了。gydF4y2Ba
巴雷特组织的表型和基因型异质性已经得到了很好的描述，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba5gydF4y2Ba8gydF4y2Ba包括多重明显的患者gydF4y2Bap53gydF4y2Ba点突变。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba这种异质性以前已被解释为克隆分叉与遗传分歧的原始单一群体;然而，这种分岔重要的假设存在一个原始创始人，固定的突变仍然能够识别所有隐窝，尽管随后的遗传分歧。使用我们逐个地窖的分析我们未能在整个街区的每个地窖中发现一个创始人突变，包括gydF4y2Bap16gydF4y2Ba失活。双等位基因缺失gydF4y2Bap16gydF4y2Ba在一些隐窝中意味着表观遗传甲基化不太可能是一个未被发现的创始人突变。gydF4y2Bap16gydF4y2Ba等位基因丢失、点突变或甲基化导致的失活是巴雷特MCS通路中最早的病变之一，据说易于发生选择性扫描。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba我们没有发现完全固定突变的证据:另一方面，区域LOH和点突变模式可以被识别。这表明克隆扩增的横扫可能局限于多个独立的克隆，而不是单个创始人突变横扫整个巴雷特片段到固定。gydF4y2Ba
有人提出，但从未证实，食管粘膜下腺管可能是Barrett食管化生组织的起源。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba16gydF4y2Ba19gydF4y2Ba这些结果证明了这一假设gydF4y2Bap16gydF4y2Ba起源于微解剖的鳞状导管组织的点突变，也在毗邻的化生隐窝中发现。在两种不同的上皮类型中存在相同的突变是强有力的证据，表明人类巴雷特食管化生组织的起源是位于食管腺鳞状管的祖细胞。此外，一个野生型鳞状岛的出现，可以从一个野生型鳞状管中看到，完全被一个鳞状管包围gydF4y2Bap53gydF4y2Ba突变场，强烈表明一个新的克隆发展。这支持了一种假设，即在巴雷特消融治疗后，新的鳞状岛可以从腺组织中重新产生，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba并扩展了保尔森的发现gydF4y2Ba等gydF4y2Ba13gydF4y2Ba通过显示这些野生型岛屿来自非突变的鳞状导管组织。gydF4y2Ba
多个相互竞争的独立克隆的展示和Barrett食管起源于食管腺鳞状管的鉴定，结构存在于整个食管的长度，允许Barrett食管克隆进化的新模型的发展。我们认为十二指肠-胃-食管反流诱导的溃疡和炎症可诱导位于食管腺鳞状管的一些干细胞群中的肿瘤抑制基因突变。这就产生了多个不同的化生组织克隆，然后竞争在食道上定植，在食道段上形成了克隆的马赛克图案。具有更大选择优势的群体的克隆扩张导致优势和广泛的克隆;然而，没有单一的突变是固定的，因为竞争的野生型克隆也可识别。非突变的鳞状管可能是野生型鳞状岛的来源(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。这些数据不能排除突变组织从食管-胃交界处延伸;然而，我们建议食管腺管应该被认为是我们在这里证明的多个独立克隆的替代或额外来源。gydF4y2Ba
尽管食道上皮细胞的高死亡率和不断增加的癌症发病率，但该部位的细胞生物学研究尚不充分。乳头间基底层被认为是可能的干细胞区gydF4y2Ba21gydF4y2Ba但是Barrett化生起源于食管鳞状上皮，这与皮肤(另一种分层鳞状上皮)有有趣的相似之处。在表皮中，干细胞不仅存在于滤泡间上皮，而且存在于相关的深层结构中;具体来说，就是毛囊的隆起部分。gydF4y2Ba21gydF4y2Ba可能的食管腺管干细胞生态位的临床意义，既是巴雷特化生的来源，也是野生型鳞状岛，意味着这些结构值得进一步详细分析。gydF4y2Ba
总之，我们已经证明了Barrett食管的两个重要特征。首先，克隆异质性来自于多个独立的克隆，以前无法通过整个活检分析检测到;食管腺鳞状管可产生Barrett化生和新鳞状岛。gydF4y2Ba
参考文献gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
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Web仅附录57/8/1041gydF4y2Ba
本数据补充文件:gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
资助:gydF4y2BaSJL由医学研究理事会资助;SLP、SACM和NAW由英国癌症研究中心资助;SACM和JAJ也是由牛津大学资助的。gydF4y2Ba
利益冲突:gydF4y2Ba一个也没有。gydF4y2Ba
伦理批准:gydF4y2Ba该研究获得了牛津郡研究和伦理委员会的多中心伦理批准(MREC 07/Q1604/17)。gydF4y2Ba
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