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摘要
客观的溶瘤病毒(OVs)是一种很有前景的促炎性癌症治疗方法。在这里，我们探讨了ov诱导的先天免疫反应是否可以在抑制肝细胞癌(HCC)的同时抑制HCV。此外，我们将这一范例扩展到其他病毒相关癌症模型。
设计与结果临床级溶瘤性正呼肠孤病毒(Reo)在没有细胞毒性和独立于病毒基因组复制的情况下，在原代人肝组织中引起先天免疫激活。除了通过激活先天脱颗粒免疫细胞在HCC临床前模型中实现治疗外，reo诱导的细胞因子反应在体外和体内都有效地抑制了HCV复制。此外，reo诱导的先天应答对hbv相关的HCC模型以及Epstein-Barr病毒相关淋巴瘤的另一种内源性模型也有效。有趣的是，Reo在引起原发性肝组织的先天炎症反应方面似乎优于大多数OVs。
结论我们建议Reo和其他选择性促炎OV可能用于治疗与致癌病毒感染相关的多种癌症，同时减少病毒相关的致癌驱动和肿瘤负担。在HCV相关性HCC (HCV-HCC)的情况下，Reo应被视为补充和支持当前HCV-HCC治疗的替代药物，特别是在那些获得新的HCV抗病毒治疗可能有限的国家。
- 免疫疗法
- 丙型肝炎
- 肝细胞癌
- 抗病毒治疗
- 癌症免疫生物学
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本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
大多数肝细胞癌(hcc)与潜在的致癌病毒感染有关，即HBV(54%)或HCV(31%)，它们通过间接炎症和直接致癌机制驱动肿瘤发生。因此，抑制HBV/HCV感染可能会改善HCC的临床结局，但由于成本、依从性和治疗毒性问题，世界范围内很少有HCC患者的肝炎感染被治愈。
晚期HCC患者的治疗是有限的;索拉非尼仅能提高中位生存期2-3个月，且有明显的副作用，英国国家健康与护理卓越研究所未推荐使用。
溶瘤病毒(OVs)显示出作为癌症治疗的潜力，通过直接和免疫介导的机制杀死恶性细胞。
有什么新发现?
临床级溶瘤性正呼肠孤病毒(Reo)在没有细胞毒性和独立于病毒基因组复制的情况下，在原代人肝组织中诱导干扰素(IFN)分泌和先天免疫激活。
Reo在肝炎病毒阳性/肝炎病毒阴性HCC的细胞系和小鼠模型中实现了治疗，并在体外通过抑制复制的作用有效地抑制了HCV的复制，在体内通过I型ifn的作用有效地抑制了HCV的复制。
Reo的抗病毒作用同样适用于体外内源性HBV-HCC和Epstein-Barr病毒相关淋巴瘤模型。在其他测试的病毒中，只有麻疹病毒Edmonston株重现了Reo的有效抗病毒作用。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
在有潜在致癌病毒感染的癌症患者中，选择ifn聚焦的OVs作为单药或联合治疗，有望抑制致病性感染，改善器官健康并延长癌症特异性生存期。
介绍
肝细胞癌(HCC)是癌症相关死亡率最高的原因之一，治疗选择有限。大多数hcc与潜在的致癌病毒感染有关，即HBV(54%)或HCV(31%)。1与HBV-HCC或其他类型的HCC相比，hcv相关性HCC (HCV-HCC)在手术干预后复发的风险特别高。2，3.肝切除和/或肝移植前成功的抗病毒治疗可显著降低这种风险。4然而，传统的以系统性干扰素(IFN)为基础的HCV治疗的毒性使许多新诊断的HCV- hcc患者无法接受此类治疗。新的直接作用抗病毒药物(DAAs)具有更好的安全性，正在彻底改变丙型肝炎治疗，但依从性问题很常见。5而且daa的高成本严重限制了它们在丙肝- hcc患病率最高的较贫穷国家的使用。
本研究的意义
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
在有潜在致癌病毒感染的癌症患者中，选择ifn聚焦的OVs作为单药或联合治疗，有望抑制致病性感染，改善器官健康并延长癌症特异性生存期。
对于晚期HCC患者，关于抗病毒治疗对现有肿瘤的影响知之甚少。教条认为HCV-HCC的发生和发展是由慢性肝脏炎症驱动的旁观者现象。然而，越来越多的证据表明HCV也直接致癌，进一步支持抗病毒和抗肿瘤联合治疗的必要性。具体来说，抗病毒治疗改善了hcv相关淋巴瘤患者的预后;6与自身免疫性肝炎相比，HCC在hcv阳性肝脏中更为常见;7在临床前模型中，HCV蛋白直接致癌8而HCV- hcc更有可能维持肿瘤抑制因子miRNA122的表达，miRNA122是一种重要的HCV辅助因子，突出了HCV在肿瘤发生中的关键作用。9晚期HCC患者的治疗是有限的;索拉非尼仅能提高中位生存期2-3个月，且有明显的副作用，英国国家健康与护理卓越研究所未推荐使用。10 - 12反式动脉化疗通常用于局部晚期疾病患者/作为移植的桥接治疗，也已被测试作为全身治疗，但经常因潜在的HCV/HBV感染的再激活/加重而复杂化。13，14因此，考虑到大多数HCC患者预后不良，抗病毒和抗肿瘤联合治疗可能会给患者带来显著的益处。
溶瘤病毒(OVs)显示出治疗癌症的潜力;传统上，肿瘤选择性杀伤是由有利于恶性细胞内复制的病毒相关特性加速的直接细胞裂解引起的。然而，OVs也是宿主免疫的有效诱导剂，这越来越被认为是其抗肿瘤功效的主要组成部分。15在后期临床试验中观察到令人鼓舞的反应，没有明显的毒性，第一个OV最近获准用于治疗黑色素瘤16(T-Vec，编码人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的单纯疱疹病毒1型(HSV-1))。肝脏和肝细胞癌一直是几项OV临床研究的主题，17包括JX-594，一种编码GM-CSF的改良痘苗病毒(VV)，18和我们自己的调查使用溶瘤剂Orthoreovirus(Reo)在转移性结直肠癌(CRC)治疗中的应用。19
我们假设OV免疫治疗的促炎性质可能通过刺激先天反应(即ifn)对癌症和潜在的致癌病毒感染产生伴随的益处。因此，reo诱导的原代肝组织内的先天免疫反应在体外和体内同时起到肿瘤杀伤和抑制HCV复制的作用。这些反应不需要有效的Reo复制，适用于其他病毒相关肿瘤模型。我们建议，这种双重作用模式，加上良好的安全记录，可能有利于快速部署OVs，如Reo，用于晚期病毒相关性HCC的弱势患者。
结果
reo诱导的先天免疫反应既发生在正常肝脏中，也发生在癌变肝脏中
我们之前证实Reo在静脉输注后有效靶向CRC肝转移，尽管患者有中和抗体。19细胞介导的病毒携带使肿瘤内的Reo复制和从肿瘤外植体中恢复感染性病毒。然而，在许多患者中，周围正常肝组织也可见染色，但无法分离感染性病毒。这使我们重新检查了正常患者的肝脏组织，证实了10名受试者中有5人的Reo蛋白表达(图1一个)。
Reo通过静脉注射到达正常肝组织，刺激离体肝细胞分泌干扰素(IFN)。(A)静脉注射Reo(左)或未治疗对照(右)的正常肝组织中Reo σ3衣壳蛋白(棕色)的免疫组化(IHC)。载玻片代表临床试验系列或六个未经治疗的对照。(B)用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或10 PFU/cell Reo处理体外富集肝细胞72小时的活力测定，台班蓝染色检测膜完整性。(C) Reo σ3的定量逆转录酶(qRT)-PCR。原代人肝细胞用1 PFU/细胞Reo或紫外-提取RNA前，Reo孵育24或48小时。(D) Reo σ3和β-actin的Western blot。原代人肝细胞用1 PFU/细胞Reo或紫外-然后孵育24或48小时。模拟(M)处理的肝细胞和从溶解素储备(+)纯化的RNA作为阴性和阳性对照。(E)人肝细胞感染Reo，或紫外线用Hoechst核反染法对Reo σ3衣壳蛋白进行免疫荧光分析。(F)体外混合肝细胞、富集肝细胞和肝单核细胞(LMCs)经Reo或PBS刺激后提取的IFN-α、IFN-β、白细胞介素(IL)-28b/IL-29和IFN-γ的ELISA检测。*表示p<0.005。
接下来，我们检测了Reo感染正常离体人肝组织，产生单细胞悬液。混合的肝细胞被分离成富集的肝细胞和肝单核细胞(LMC)亚群补充图S1a)。重要的是，将富集的原代肝细胞群暴露于Reo中不会引起细胞毒性(图1B)，但确实导致病毒RNA的转录有限(图1C)和感染后24小时蛋白表达(图1D, E)在没有重新产生感染性病毒粒子的情况下(见在线)补充图S1b)。有趣的是，RNA和蛋白的表达在24至48小时之间下降，提示细胞抗病毒机制的诱导(图1D, E)。相比之下，Reo在体外广泛的HCC细胞系中有效复制，产生新的感染性病毒粒子(见在线)补充图S1c)和诱导细胞毒性(见网上)补充图S1d)，主要通过细胞凋亡(见网上)补充图S1e)。重要的是，在体外将混合肝细胞、肝细胞富集或LMC部分暴露于Reo()时，观察到强有力的细胞因子反应。图1F)。所有细胞类型均表达IFN-β，而IFN-α和IFN-γ主要在LMC部分分离，IFN-λ(白细胞介素(IL)-28b/IL-29)在肝细胞富集部分更为突出。因此，Reo有潜力在肝脏的很大一部分内刺激先天免疫，而不是局限于肿瘤细胞和/或肿瘤相关的LMC。
reo诱导的先天免疫应答介导抗hcc治疗
为了评估Reo对有/无HCV的HCC模型的疗效，我们使用了免疫功能低下的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠，皮下移植Huh7或Huh7- jfh1细胞，携带亚基因组HCV复制子(基因型2a, JFH-1分离物)。在3-4周的实验中，在可触及的肿瘤中单次注射Reo(植入后第5天)可以延缓肿瘤的生长，产生小的、宏观上较少血管的肿瘤(图2A).肿瘤的组织学检查证实HCV非结构蛋白(NS)5A的表达以及Reo抗原与坏死和裂解型caspase 3 (图2然而，reo治疗的免疫缺陷小鼠出现了相当大的毒性，体重减轻证明了这一点(见网上)补充图S2a)，需要过早的牺牲。
reo诱导的先天免疫反应足以用于抗肝细胞癌(HCC)治疗。(A)单次注射PBS或1×10后切除SCID小鼠皮下侧腹肿瘤6空斑形成单位Reo。(B)单次注射1×10处理的SCID小鼠Huh7和Huh7- jfh1皮下异种移植物中HCV非结构蛋白(NS)5A、Reo σ3衣壳蛋白和cleaved caspase 3的代表性免疫组化染色(棕色)6肿瘤植入后第6天的PFU Reo。(C) Huh7(左)和Huh7- jfh1(右)皮下侧腹异种移植物在每周3次注射PBS或1×10治疗的SCID小鼠中的肿瘤体积6从肿瘤植入后第6天开始，PFU uv-Reo持续4周。(D)体外混合肝细胞经uv-Reo或PBS刺激后的干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ和白细胞介素(IL)-28b/IL-29的ELISA检测。(E)每周3次PBS (1×10)处理BALB/c小鼠1MEA皮下同基因肿瘤的肿瘤生长情况6PFU Reo或1×106PFU uv-Reo注射，肿瘤植入后第6天开始。*表示p<0.005。
为了避免毒性问题和描述免疫驱动疗法，而不是溶解疗法，我们回顾了以前在黑色素瘤模型中的研究紫外线-灭活的Reo (紫外线-Reo)(见网上补充图S2b)引发的抗肿瘤免疫反应与活病毒相当。20.因此,紫外线-Reo对hcv阳性和hcv阴性肿瘤的生长均有显著的阻滞作用(图2C)。紫外线-Reo也引起了原代人混合肝细胞悬液的先天细胞因子反应，尽管这更集中于IFN-β (图2D)。最后，免疫活性肝癌皮下模型(同源Balb/c小鼠的1MEA细胞)显示Reo和紫外线-Reo，支持免疫驱动而非溶瘤作用机制(图2E).综上所述，在临床前模型中，Reo诱导的先天免疫似乎足以产生抗hcc的作用，而不依赖于Reo基因组复制，这表明这种机制在接受临床级活病毒治疗的人类中发挥了重要作用。
reo诱导的抗hcc反应需要ifn介导的自然杀伤淋巴细胞活化
reo处理的1MEA肿瘤的组织学检查显示明显的自然杀伤细胞(NK)浸润，表明这些可能是抗肿瘤反应的一个效应成分(图3A，和其他OVs一样。21，22因此,紫外线-Reo治疗对缺乏功能性免疫细胞脱颗粒的SCID/Beige小鼠体内的Huh7异种移植物无效，这与NK细胞活性的治疗要求一致(图3B).有趣的是，与SCID相比，在SCID/Beige组中没有观察到肿瘤生长增加，这表明在没有外源刺激的情况下，脱颗粒细胞不能有效地控制肿瘤生长。
reo刺激干扰素(IFN)通过自然杀伤(NK)细胞激活驱动抗肝细胞癌(HCC)免疫应答。(A)每周注射3次PBS或1×10治疗的BALB/c小鼠1MEA皮下同基因肿瘤中NK细胞的代表性免疫组化染色(棕色)6空斑形成单位Reo。(B)每周注射3次PBS或1×10治疗的SCID/Beige小鼠Huh7皮下异种移植物的肿瘤生长情况6空斑形成单位uv-Reo。(C)流式细胞术覆盖图(左)和定量(右)中位荧光强度(MFI)在肝单核细胞(LMCs)中NK CD69表达，使用PBS、1个PFU/细胞Reo、1个PFU/细胞Reo和I型IFN阻断抗体或1个PFU/细胞Reo和同型抗体处理。(D)与(C)相似，但lmc分别用PBS、1 PFU/细胞Reo或1 PFU/细胞uv-Reo处理。(E)脱颗粒实验显示cd107阳性的肝脏NK细胞百分比。lmc用PBS或1 PFU/cell Reo预处理24小时，然后与Huh7或Huh7- jfh1靶点共孵育4小时。(F)51用PBS或1 PFU/cell Reo预处理lmc 24小时，然后洗涤，共孵育51cr标记Huh7或Huh7- jfh1靶向4小时。数据是51Cr释放量占潜在最大值的百分比。*——p < 0.005。
与小鼠模型和我们之前的数据一致，Reo通过1型ifn依赖机制有效地刺激了人肝脏来源的NK细胞(图3C)，从而激活了LMC人口中的大部分(见在线)补充图S1a)。同样的,紫外线- LMC的reo刺激也导致NK细胞活化(图3D)， Reo也是如此，也导致hcv阳性和hcv阴性Huh7靶标的杀伤增强(图3E, F)。此外，从外周血单核细胞(PBMC)中消耗NK细胞可以阻止reo刺激的HCC杀伤(见在线)补充图S3a)，进一步支持NK细胞作为ov介导治疗的主要先天效应物。因此，reo诱导的抗hcc免疫依赖于1型IFN，后者反过来激活NK细胞，使其能够识别并杀死肿瘤靶点。
reo诱导免疫在体外具有强大的抗hcv作用
考虑到体外人肝细胞暴露于Reo后炎症细胞因子的有效诱导，我们推断由此产生的条件培养上清液应该具有抗病毒作用。混合肝细胞、分离的肝细胞富集和LMC群体或混合原发性HCC细胞进行对照或Reo(呼肠病毒-CM (RCM))刺激后制备过滤条件培养基(CM)。所有RCM对HCV在Huh7细胞内的复制均有剂量依赖性的抑制作用(图4A).与纯化的、白细胞衍生的IFN-α、IFN-β或IL-29或其组合进行比较，揭示了与IFN-β介导的主要机制一致的模式(见在线)补充图S4a）;与IFN-α或IL-29相比，IFN-β抑制HCV复制的能力更强，细胞因子联合抑制HCV复制的能力并不比IFN-β单独抑制HCV复制的能力强。阻断干扰素显著减弱混合肝细胞RCM对hcv的抑制作用(图4B)，对Huh7-JFH1细胞没有可测量的细胞毒性或生长抑制作用(见在线补充图S4b)。
reo刺激干扰素(IFN)-β在体外有效抑制HCV。(A) Huh7-JFH1细胞用不同稀释度的条件培养基(CM)或呼肠病毒-CM (RCM)处理24小时的荧光素酶测定，条件培养基来源于混合肝细胞、肝单核细胞(LMCs)、富集肝细胞或混合原发性肝癌(HCC)细胞。荧光素酶活性以对照培养基值的百分比计算。(B)使用混合肝细胞RCM(1:16稀释)、混合肝细胞RCM与I型IFN阻断抗体或混合肝细胞RCM与同型抗体处理4小时的Huh7-JFH1细胞进行荧光素酶测定。然后，在分析前，将细胞在未处理的完全生长培养基中孵育20小时。(C) ELISA检测肝癌细胞系在PBS或1 PFU/细胞Reo处理72小时后IFN-β(左)和白细胞介素(IL)-28b/IL-29(右)的分泌。(D)用不同稀释度的JHH1、HLE或JHH2细胞提取的CM或RCM处理24小时的Huh7-JFH1细胞荧光素酶测定。红色虚线表示预测的荧光素酶活性百分比作为RCM IFN-β浓度的函数，正如使用纯化的IFN-β抑制复制子的趋势线方程所预测的那样(见在线)补充图4SA)。(E)来自JHH1、HLE或JHH2细胞的HCV非结构蛋白(NS)5A在用CM或RCM以1:16稀释处理24小时的Huh7-JFH1细胞中具有代表性的免疫荧光。(F)荧光素酶测定使用hcv感染的Huh7细胞，用从JHH1、HLE或JHH2细胞中提取的CM或RCM以1:16稀释处理24小时。*表示p<0.005。
暴露于Reo的多种HCC细胞系导致不同模式的细胞因子诱导，缺乏IFN-α，但有大量的IFN-β和IFN-λ (图4C).我们将刺激的JHH1、HLE和JHH2细胞衍生的RCM分别定义为保持高、中、低IFN-β含量。抗病毒效果与RCM中IFN-β水平直接相关，反映了纯化的白细胞来源的细胞因子的趋势线方程(Spearman's秩相关系数为0.929,p=0.001)4D、在线查看补充图S4a)。同时，免疫荧光(图4E)和western blot(见网上)补充图S4c)，同样没有明显的细胞毒性作用(见网上)补充图S4d)。关键的是，RCM抗病毒活性也适用于全长感染性HCV，再次与IFN-β水平直接相关，通过ns5a -荧光素酶报告活性的降低来测量(图5)4F、网上见补充图S4e)、HCV基因组RNA(见网上)补充图S5a)和ns5a -绿色荧光蛋白(GFP)报告基因荧光(见在线)补充图5b, c)。
reo诱导免疫从细胞培养中根除HCV并在体内发挥抗病毒作用
接下来，我们研究了RCM暴露是否能有效治愈Huh7-JFH-1细胞。在没有选择的情况下，Huh7-JFH-1暴露于RCM或对照培养基中14天。用G418重新挑战导致jh1 RCM或IFN-β处理的细胞缺乏活菌落，在大量群体中无法检测到荧光素酶活性(图5一个)。
reo诱导的炎症反应从细胞培养中根除HCV并在体内发挥抗病毒作用。(A) Huh7-JFH1细胞用呼肠病毒-CM (reovirus-CM, RCM)或从JHH1细胞中提取的条件培养基(CM，稀释比例为1:16)，或对照培养基，或纯化干扰素(IFN)-β (50 pg/mL)处理14天。然后对细胞进行荧光素酶活性定量(右下)或按右上所示的密度播种，在含有G418的培养基中培养4天，然后固定并用亚甲基蓝染色(左)。(B) SCID小鼠皮下Huh7-JFH1异种移植物中HCV复制子荧光素酶活性的代表性体内成像系统(IVIS)图片。小鼠每周两次注射PBS或1×105空斑形成单位紫外线-Reo，在基线评估后立即开始。(C)(左)(B)对IVIS荧光素酶强度的量化。图表显示了与治疗后第0天基线值相关的荧光素酶活性百分比。(右)(B)显示异种移植物的肿瘤体积。
接下来，我们测试是否紫外线- reo刺激免疫在临床前SCID Huh7-JFH-1模型中发挥抗病毒作用。皮下可触及的Huh7-JFH-1异种移植物瘤内用两种低剂量治疗紫外线-Reo或PBS持续9天，使用体内成像系统(IVIS)测量肿瘤生长情况以及肿瘤内HCV表达的荧光素酶。肿瘤归一化，并根据第0天的IVIS读数分为等效的对照/治疗组。而对照组的荧光素酶读数自然下降由于缺乏G418，低剂量治疗紫外线-Reo导致IVIS读数的显著额外降低，与肿瘤生长无关(图5B, C)。此外，单次注射活Reo治疗的Huh7-JFH-1肿瘤的组织学检查显示，在与发生坏死变化或Reo抗原染色的肿瘤不同的肿瘤区域，HCV NS5A蛋白表达显著降低，支持a反式-作用，细胞因子介导的抗病毒作用(见在线补充图S6a)。据此，RCM生成自紫外线-混合小鼠肝细胞暴露在HUH7-JFH1细胞中保留抗hcv活性(见在线)补充图S6b)，尽管与人类RCM相比显著降低。因此，虽然小鼠RCM/IFN部分交叉刺激Huh7 IFN受体，但小鼠异种移植模型可能低估了在人类环境中可能实现的抑制程度。
reo诱导的抗病毒反应在其他病毒相关癌症模型中也可以实现
我们推断，类似的抗病毒效果可能在其他病毒相关癌症模型中实现。我们评估了reo刺激免疫对含有整合HBV的PLC/PRF/5细胞和Daudi细胞的影响，这些细胞来源于EBV阳性的伯基特淋巴瘤，已知对reo诱导的细胞毒性作用具有抗性。23
PLC/PRF/5 HBV表面抗原(HBsAg)的分泌可作为病毒基因表达的标志物。24来自原代LMC和JHH-1细胞的RCM在5天的时间内达到了与纯化的IFN-β相当的HBsAg分泌减少(图6一、上网看补充图S7a)，没有明显的生长抑制作用(见网上)补充图S7b)。接下来，我们测试了Reo对经TPA /丁酸处理的Daudi细胞抑制EBV再激活的能力。直接Reo处理Daudi细胞和暴露于PBMC衍生的RCM均可显著减少EBV早期抗原(EA)阳性细胞(图6B, C)。由于Daudi细胞不是容性宿主，这种效应可能归因于reo诱导的细胞因子。
reo诱导的抗病毒反应在体外抑制HBV和eb病毒(EBV)。(A) ELISA检测从PLC/PRF/5细胞中分泌的HBV表面抗原(HBsAg)，使用一系列稀释的条件培养基(CM)或来自肝单核细胞(LMCs)(上)或jh1(下)细胞的呼肠病毒-CM (RCM)处理5天。(B) EBV早期抗原(EA)的代表性免疫荧光(左)和EA阳性Daudi细胞的定量(右)。细胞用PBS处理48小时，1 PFU/细胞Reo处理48小时，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDI)处理24小时或1 PFU/细胞Reo处理48小时，然后用HDI处理24小时。(C)(左)Reo或PBS刺激后外周血MC (PBMC)中干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ和白细胞介素(IL)-28b/IL-29的ELISA检测。(右)用对照培养基，PBMC CM, PBMC RCM处理24小时的ea阳性Daudi细胞，然后再用PBS或HDI处理24小时。(D) Huh7-JFH1细胞用不同稀释度的CM或混合肝细胞衍生的10个PFU/细胞溶瘤病毒(OV)-CM处理24小时的荧光素酶测定。*表示p<0.005。
最后，我们评估了Reo是否在人原代混合肝细胞中产生有效的抗hcv细胞因子反应的能力方面是独一无二的。在一组常用的OVs中，只有暴露于麻疹病毒Edmonston株(MV-Edm)产生的CM重现了Reo对Huh7-JFH-1细胞的抗hcv功效(图6D).暴露于非常高浓度的HSV-1 CM只产生适度的影响，而VV没有引起明显的抗病毒反应。此外，抗病毒效果与预测归因于IFN-β的诱导之间的相关性(见在线)补充图S7c)显著(p<0.05);在VV CM中存在低水平的细胞因子，其浓度与模拟处理的肝细胞释放的细胞因子相似，但两者都没有对Huh7-JFH-1细胞产生抗病毒作用。因此，对照培养基中存在的其他因素可能会改善低水平IFN的影响，或者这些低水平的IFN可能不符合预测方程(见在线)补充图S7c)。综上所示，Reo似乎能够诱导干扰素β驱动的抗病毒反应，对RNA和DNA肿瘤病毒都有效，但这种能力在OVs中并不普遍。
讨论
在这里，我们提供了第一个证据，证明ov诱导的先天炎症反应同时针对致癌病毒感染以及相关肿瘤，主要使用HCV-HCC为例，但对其他模型进行了额外的原理证明。在我们的模型系统中，I型IFN的诱导是决定抗病毒和抗肿瘤功效的关键、统一机制，并且使用紫外线-Reo反对直接靶向/裂解肿瘤的重要作用。此外，这些品质在OVs中并不普遍，这使得为未来应用选择代理成为一个重要的考虑因素。
reo诱导的IFN在体外对病毒复制有直接的抗病毒作用，在体内通过激活脱颗粒先天免疫细胞(很可能是NK细胞)产生抗肿瘤作用。因此，SCID/beige小鼠无法对紫外-然而，这并没有因为SCID背景下缺乏适应性免疫而受到损害。NK细胞被IFN间接激活，25它们也可能通过杀死受感染的肿瘤细胞/肝细胞来促进体内抗病毒作用。26
IFN-β介导的抗病毒和抗肿瘤作用在临床前模型中不依赖于Reo复制紫外线-Reo在人类肝细胞中引发了类似的反应。这让人想起其他的OV研究，在这些研究中，完成完整感染周期的能力对于启动ifn介导的抗肿瘤免疫是必不可少的。20.，22，27然而，在治疗免疫前人类患者时，具有复制能力的病毒可能提供其他临床优势，例如在肿瘤部位的潜在扩增，19以及细胞介导的运输28减轻现有抗体反应;后一种情况是否发生紫外线-灭活病毒是未知的，由于缺乏临床级试剂，目前不可能在体内进行测试。dsRNA人类Orthoreovirus基因组被模式识别受体识别，包括rig - 1，29尽管这是否对紫外线-Reo不清楚。其他呼肠孤病毒，如鲤鱼呼肠孤病毒，也可以通过toll样受体途径触发反应，30.然而这些被激活的程度紫外-人类肝细胞中的Reo是未知的。我们不能排除适应性免疫对同基因1MEA模型治疗的贡献，但这可能是除了基本的先天抗肿瘤反应之外。
这项研究为ov诱导的先天反应提供了一个新的抗病毒维度，这反过来也介导了它们的抗肿瘤功效。这可能对肝癌等癌症有显著的益处，因为HCC的治疗选择有限，而且大多数是由HBV或HCV感染引起的。用于HCV或HBV感染/复制研究的临床前模型仍然非常有限，而且所有模型都是在改变的遗传或诱导的免疫功能低下背景下设置的。31，32此外，在HCV环境下自发发生HCC的转基因小鼠系统必须在自身启动子下表达病毒蛋白，而不是在复制环境下表达，这使得它们不适合测试ov介导的治疗。本研究中使用的Huh7-JFH1异种移植模型也有局限性，但在HCC背景下提供复制HCV的优势，其中对先天免疫信号的反应保持完整。
针对HCV的新型daa最近被证明在HCV- hcc患者中耐受性良好。33有趣的是，最近的研究显示，慢性HCV患者持续的DAA应答与停止治疗后肝脏I型IFN信号稳态的恢复和一系列IFN刺激基因(ISGs)表达的增加有关。34OV联合DAAs治疗可以明显提高肝内ISG的表达率，有效提高HCC患者的病毒清除率。然而，大多数接受DAAs治疗的患者很可能在HCC发展之前就治愈了HCV感染，而且越来越多的证据表明HCV是直接致癌的，这为晚期HCC患者采用相同的治疗方法提供了强有力的理由。因此，Reo在无法支持广泛使用daa的国家可能具有特别的相关性，因为这些国家的HCV和HCC患病率可能更高。此外，Reo抗hcc的作用可能支持或作为索拉非尼标准治疗的二线治疗或与索拉非尼形成联合治疗反式动脉化疗。鉴于最近有争议的研究支持DAA治疗在预防手术后HCV-HCC复发方面可能不如IFN有效，这可能变得越来越重要，尽管这需要在更大的患者队列中得到证实。35，36
我们之前已经证明reo诱导的免疫适用于许多不同的肿瘤情况，在这里我们表明这种先天免疫激活表现出抗病毒功效。然而，这一特性在所有其他OVs中并不常见，只有MV-Edm具有Reo在人原代肝细胞中强烈诱导I型IFN表达的能力。也许并不令人意外的是，这表明来自不同病毒家族的OVs在发挥抗肿瘤作用的主要机制上可能有所不同。有趣的是，改良的JX-594的平台VV是原发性肝组织内先天反应的不良激活剂;由VV编码的大量先天免疫拮抗剂可能促成了这一结果。37有趣的是，在一项试验亚研究中，JX-594治疗降低了一小群HCC患者的HBV载量，但这并不直接归因于肝脏免疫刺激。38
Reo在HCV-HCC中作为抗病毒和抗肿瘤联合疗法的临床潜力得到了我们的发现的支持，即该病毒在患者静脉注射后可以进入正常肝组织和肿瘤。因此，将离体原代肝细胞暴露于Reo会导致病毒RNA转录和蛋白质表达，尽管这不会导致新生感染性颗粒的分泌。在没有明显毒性的情况下，这与正常人肝细胞内IFN的强诱导有关;因此，我们推断，这种反应限制而不是阻止病毒在正常体内组织中的复制，而这在肿瘤环境中不太可能发生，从而巧妙地修改了OV肿瘤特异性的经典模型。因此，Reo良好的安全性非常适合HCC患者的晚期肝病状态，其中大多数患者有潜在的肝硬化。令人鼓舞的是，临床试验中注射OV的患者的HCC活检显示弥漫性淋巴细胞浸润，18进一步支持OVs作为抗病毒和抗hcc免疫疗法的联合使用。基于其良好的安全记录，我们建议在临床试验中探索在潜在致癌病毒感染的癌症患者中选择OVs的部署。未来的研究应将ifn为重点的OV(如Reo)与其他免疫刺激剂(包括免疫检查点抑制剂(CI))联合使用。有趣的是，CI作为抗病毒药物的反向应用正在探索用于慢性感染，如艾滋病毒，39提示reo样OVs和CI可能形成有效的抗病毒/抗肿瘤联合疗法。
材料与方法
道德标准
在英国利兹的圣詹姆斯大学医院接受常规计划的癌症相关手术的患者体内获得正常和恶性肝组织。根据当地机构伦理审查和批准获得书面知情同意。
免疫组织化学
如所述，采用自动化Bond Max系统(徕卡生物系统)。40呼肠孤病毒σ3和裂解caspase 3抗体稀释至1:1000。检测HCV NS5A包括抗原提取和抗体1:100稀释。CD117是NK细胞特异性标记物。41
荧光显微镜
绵羊抗ns5a多克隆血清(1:2000，来自Mark Harris, Leeds);42采用EVOS FL细胞成像系统或Incuyte Zoom对小鼠抗ebv EA-D克隆(0261)(Santa Cruz, 1:100)、Alexa荧光偶联二抗(Invitrogen, 1:200)或直接GFP荧光进行成像，由Dermody, T.S. (DSHB Hybridoma Product 4F2(呼肠孤病毒))沉积到DSHB上。Huh7-JFH1细胞用1:16稀释的CM或RCM处理24小时。用20 ng/mL TPA和3 mM丁酸钠处理Daudi细胞。
HCV RNA的制备和定量
使用TRIzol试剂(Ambion)按照制造商的方案，从含有HCV的Huh7细胞中提取总RNA。使用SensiFAST cDNA合成试剂盒(Bioline)进行反转录。使用SYBR Green Real-Time PCR Master Mix (Applied Biosystems)在Applied Biosystems 7500快速实时PCR系统上进行HCV转录本的定量，使用标准条件，退火温度为63℃。引物序列对HCV 5′UTR具有特异性;forward, 5 ' -agcgtctagccatggcgt-3 '和Rev, 5 ' - ggtgtactcccggttccg -3 '，得到一个95 bp的扩增子。
生成(病毒-)CM
CM和病毒-CM (RCM)来源于混合肝细胞或富集肝细胞，用溶瘤性呼肠酶病毒、MV-Edm、VV或HSV-1在10 PFU/细胞或PBS下处理72小时。肝癌细胞系、LMCs和PBMCs用1 PFU/细胞的Reo治疗72小时。上清液在400 ×g下澄清5分钟，然后过滤两次(2µm(康宁)，然后用OptiScale 25 Capsule (Millipore)去除残留病毒)，保存在- 80°C。
I型干扰素阻断
Huh7-JFH1细胞用1.25% (v/v)抗人IFN-α/β受体链2或1.25% (v/v) IgG2a同型，R&D体系处理，RCM与0.75% (v/v)抗人IFN-α和0.75% (v/v)抗人IFN-β， R&D体系或1.5% (v/v)热灭活羊血清对照Sigma混合，分别孵育1小时后混合。4小时后，不经处理更换培养基。20小时后进行MTT/荧光素酶检测。lmc在Reo刺激前1小时处理，并在流式细胞术前孵育24小时。
台盼蓝排除
原代富集的肝细胞用PBS或10 PFU/cell Reo处理72小时，用0.4%台番蓝(Sigma) 1:1稀释，对200个计数细胞进行3次重复测定活力。
流式细胞术
流式细胞术采用BD LSRII流式细胞仪，数据分析采用FACSDiva软件(BD Biosciences)。所有抗体均为荧光偶联小鼠单克隆IgG1。
肝NK细胞CD69清洗后的lmc用荧光素异硫氰酸酯(FITC)-CD56, PerCP-CD3和PE-CD69 IgG1抗体(均为BD Biosciences)进行标记。对照组用pe标记的IgG1同型标记。
CD107 a/b脱粒: lmc与1 PFU/cell呼肠孤病毒或PBS孵育24小时，用汉克斯平衡盐溶液(HBSS) (Sigma)洗涤2次，以5:1的比例与靶细胞共孵育4小时。1小时后，细胞用FITC-CD107a、FITC-CD107b抗体(BD Biosciences)、PE-CD56 (AbD sertec)和PerCP-CD3 (BD Biosciences)和Brefeldin A溶液(Biolegend)进行标记。
ELISA
采用匹配的HBsAg抗体对检测IFN-α (Mabtech)、IFN-β (Verikine Human IFN Beta ELISA Kit (PBL))、IFN-γ (BD Biosciences)和IL-28b/IL-29 (R&D Systems)。PLC/PRF/5细胞RCM处理5天，每天更换一次，然后按照制造商的说明使用Monolisa HBsAg ULTRA Kit (Bio-Rad)评估最后3小时的HBsAg处理。
荧光素酶检测
根据制造商的方案，使用MITHRAS光度计(Berthold technology)对Firefly(亚基因组型HCV)或Renilla(感染性HCV)荧光素酶测定系统(Promega)进行评估。
51铬释放试验
51铬释放量按所述测量。43效应细胞(LMCs或PBMCs)与呼肠孤病毒或PBS的1 PFU/细胞预孵育24小时，并按规定的效应靶比分装3份。
体内实验
CB17-PrkdcSCID(SCID)小鼠由圣詹姆斯生物医学服务中心(SBS)提供。BALB/c小鼠和CB17 (PrkdcSCID, Lystbg' SCID/Beige ')购自Charles River Laboratories International。SCID和SCID/Beige小鼠置于隔离笼中，BALB/c小鼠置于单独通风笼中。证实细胞系不含小鼠病原体(Charles River实验室)。研究人员定期检查小鼠的健康状况恶化或体重减轻的迹象。
收集细胞系，PBS洗涤两次，再用100µL PBS重悬皮下注射。所有处理均为50µL载液(PBS为Reo/)紫外线-Reo或索拉非尼口服灌胃;PBS, 25%聚乙二醇400 (Sigma)， 5%吐温-20,5%乙醇)。
用卡尺在两个维度上测量肿瘤的生长，在任何维度上达到15mm时常规处死小鼠。根据修正的椭球公式计算肿瘤体积。44
对于IVIS (Caliper Life Sciences)，用1.5%异氟烷吸入麻醉SCID小鼠，并腹腔注射溶解在PBS中的萤火虫d -萤光素钾盐(150 mg/mL) 80µL。10 min后测定荧光素酶活性。数据分析使用活体图像软件(Perkin Elmer)，通过量化肿瘤注射部位对应的圆形区域内的总发射发光并减去背景发射。
统计数据
p值采用单点或组双侧配对t检验计算，统计学显著性以*p<0.05表示。细胞或上清液在可能的情况下进行三次分析，数据表示重复实验或来自不同供体的样品之间的平均值和扫描电镜。
致谢
我们感谢欧洲研究理事会、利兹实验癌症医学中心和国家卫生研究所(NIHR)利兹临床研究设施的支持。KH感谢癌症研究所(ICR)/RM NIHR生物医学研究机构的支持。我们也感谢格雷厄姆·库克教授(利兹大学)和安德鲁·麦克唐纳博士(利兹大学)进行了有益的讨论。我们还要感谢圣詹姆斯生物医学服务中心的Teklu Egnuni、Martyna Michniewicz、Jan Bilton和Debra Evans对临床前模型的帮助。
参考文献
脚注
AM和SG贡献相同。
贡献者构思和策划实验:SG, AM, FE-M, AS;实验:AS、MJB、KS、GN、AB、EA、RAA、RD、AP-C;提供关键试剂:GT、SN、MC;审稿:RV, KH, PS和FE-M;原稿:SG, AM和AS。
资金AS是英国癌症研究中心利兹中心授予SG/AM的英国癌症研究临床奖学金的获得者。
相互竞争的利益MC是加拿大卡尔加里肿瘤学生物技术公司的员工。SG和AM获得了来自Oncolytics的研究资助。
伦理批准东北利兹伦理委员会，圣詹姆斯大学医院，英国利兹。体内动物模型由利兹大学当地伦理审查委员会批准。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。