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摘要gydF4y2Ba
目的:gydF4y2Ba目前的人类Barrett食管克隆扩展模型是基于多节段水平的异质、流动纯化活检分析。从这些活检样本中检测到相同的突变指纹，从而提出一个具有选择性优势的突变克隆可以无性扩展，以牺牲竞争克隆为代价填充整个巴雷特片段(选择性扫描到固定模型)。我们的目标是通过显微解剖和基因分析个体隐窝，以更高的分辨率评估克隆性。巴雷特化生和新鳞状岛的组织发生从未被证实。我们研究了食管腺鳞状管作为两种上皮亚型的来源。gydF4y2Ba
方法:gydF4y2Ba解剖Barrett活检和食管切除块上的个别隐窝。肿瘤抑制基因杂合子缺失模式的测定gydF4y2Bap16gydF4y2Ba而且gydF4y2Bap53gydF4y2Ba点突变是在一个一个隐窝的基础上进行的。发现连续的新鳞状岛屿和柱状化生伴食管鳞状管。通过激光捕获显微解剖分离组织并进行基因分析。gydF4y2Ba
结果:gydF4y2Ba个体隐窝解剖显示的突变模式在整个活检分析中被掩盖。食管切除标本的解剖显示出明显的克隆异质性，存在多个独立克隆。我们发现了一个gydF4y2Bap16gydF4y2Ba点突变发生在食管腺管的鳞状上皮中，它也出现在相邻的化生隐窝中，而鳞状管产生的新鳞状岛相对于周围的巴雷特发育不良是野生型的。gydF4y2Ba
结论:gydF4y2Ba通过研究隐窝水平的克隆性，我们证明巴雷特的异质性来自多个独立的克隆，与之前描述的克隆扩展的选择性扫描到固定模型相反。我们认为位于整个食道的鳞状腺管是祖细胞的来源，可能易受基因突变的影响，导致转化为巴雷特化生上皮。此外，这些数据表明野生型导管可能是新鳞状岛屿的来源。gydF4y2Ba
来自Altmetric.com的统计gydF4y2Ba
巴雷特食管是由十二指肠胃食管反流引起的炎症和溃疡，用化生腺上皮取代正常的食管分层鳞状上皮。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba食管腺癌可通过化生-发育不良-癌序列(MCS)发生，Barrett食管的存在使食管腺癌的风险增加30- 40倍。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba
对巴雷特食管患者队列的一系列活组织检查和分子分析使研究人员能够研究随着MCS进展的常见肿瘤抑制基因突变模式的进化。这些纵向克隆排序研究表明，遗传和表观遗传失活gydF4y2Ba细胞周期蛋白依赖性激酶N2gydF4y2Ba（gydF4y2Bap16gydF4y2Ba)和基因失活gydF4y2BaTP53gydF4y2Ba（gydF4y2Bap53gydF4y2Ba)肿瘤抑制基因出现在MCS早期gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba88%的发育不良前巴雷特食管组织有可检测到的gydF4y2Bap16gydF4y2Ba病变。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba克隆的论证gydF4y2Bap16gydF4y2Ba而且gydF4y2Bap53gydF4y2Ba巴雷特食管的长段病变gydF4y2Ba4gydF4y2Ba5gydF4y2Ba提示一种经历克隆扩展的常见前体病变，并提出MCS的进展是连续的肿瘤抑制基因失活导致选择性生长优势的结果。生长优势导致突变克隆的优先扩展，当突变在整个领域扩展，消灭所有竞争克隆时，就被称为“固定”。“选择性扫描”是一个自然选择的过程，驱动突变到固定。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba7gydF4y2Ba有人认为，两者的损失各有不同gydF4y2Bap16gydF4y2Ba等位基因倾向于选择性扫描，而那gydF4y2Bap16gydF4y2Ba突变固定发生在Barrett食管进展的早期。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba相似的论证gydF4y2Bap16gydF4y2Ba从不同水平的长Barrett食管段的活检材料中，杂合性(LOH)的丢失、甲基化和点突变模式支持广泛的克隆扩展和固定突变。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba然而，表型和基因型异质性也被描述在一些巴雷特片段gydF4y2Ba4gydF4y2Ba5gydF4y2Ba巴雷特片段的克隆多样性最近被证明与腺癌的进展有关。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba
尽管经过多年的积极研究，巴雷特食管的组织发生从未被证实。提出了不同的理论:贲门近端迁移;食管腺管鳞状上皮的再分化和细胞定植。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba10gydF4y2Ba类似的问题仍然存在，关于新鳞状岛的起源，可以在巴雷特氏组织场在酸抑制或内镜消融治疗后产生。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba12gydF4y2Ba保尔森gydF4y2Ba等gydF4y2Ba13gydF4y2Ba证明了这些鳞状岛屿在基因上通常是野生型的，尽管周围是突变的巴雷特氏组织。他们排除了相邻正常鳞状上皮的侵蚀，只包括出现孤立鳞状上皮岛的患者，但无法确定基因正常组织的来源，而这些组织可能在巴雷特食管治疗后的上皮再形成中具有重要的临床作用。gydF4y2Ba
到目前为止，大多数克隆性研究都是在异质流纯化的全活检样本上进行的。在这项工作中，我们的目标是(1)在一个隐窝一个隐窝的水平上研究克隆性，避免与污染正常基质有关的问题;(2)食管腺鳞状管是Barrett柱状上皮和新鳞状岛的潜在来源。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
组织和幻灯片gydF4y2Ba
石蜡包埋活检(来自5名患者的6个活检)和食管切除术块(来自患者1的4个街区，来自患者2的4个街区，来自患者3的2个街区)从莱斯特总医院的病理档案中获得。根据英国胃肠病学会2005年指南(gydF4y2Bawww.bsg.org.ukgydF4y2Ba)，由至少两名病理学家。连续切割5 μm切片。切片1-3和5-7安装在P.A.L.M.膜载玻片上(P.A.L.M. Microlaser Technologies, Benried, Germany)，用亚甲基绿染色。第4切片用苏木精和伊红(H&E)染色。gydF4y2Ba
激光捕获显微解剖(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba）gydF4y2Ba
使用H&E载玻片确定合适的隐窝进行剥离。在亚甲基绿染色的载玻片上发现了相同的隐窝。从六个连续载玻片上切割出单独的隐窝部分，并使用P.A.L.M.激光显微解剖系统将其弹射到eppendorfs的胶粘剂盖上。微卫星分析需要组织DNA，对固有层的一系列区域进行微解剖。盖上弹射的切片浸于12 μl蛋白酶K溶液(Arcturus Bioscience, Mt View, California, USA)中。分离个别隐窝后，将残余上皮组织弹射到单个管中，浸于30 μl蛋白酶K中gydF4y2Bap53gydF4y2Ba基因筛查。阴性对照管含12 μl蛋白酶K溶液，无激光捕获材料。然后将试管在4.5℃下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba孵育1分钟，65°C过夜。在95°C孵育10分钟使蛋白酶K变性，然后在−20°C保存裂解物。gydF4y2Ba
免疫细胞化学gydF4y2Ba
细胞角蛋白7和细胞角蛋白13染色分别显示腺上皮和鳞状上皮的分化。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba15gydF4y2Ba食管切除术块在4 μm处连续切片，安装在玻片上。切片用标准方法脱蜡和复水。用3% H阻断内源性过氧化物酶gydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba2gydF4y2Ba在pH值为6的柠檬酸钠缓冲液中微波10分钟，即可获得抗原。玻片在3%牛血清白蛋白和磷酸盐缓冲盐水(PBS)中孵育15分钟。玻片与抗细胞角蛋白7的小鼠单克隆抗体进行一抗孵育(克隆OV-TL的1:100稀释;Abcam, Cambridge, UK)或细胞角蛋白13(克隆AE8 1:200稀释;Abcam)。随后是生物素化的兔抗小鼠二抗，然后应用1:50 00稀释的第三层过氧化物酶结合链霉亲和素(链球菌- hrp;Dako斯特鲁普、丹麦)。每层涂45分钟，层与层之间进行3次5分钟PBS清洗。然后用3,3-二氨基联苯四盐酸盐溶液(DAB;Sigma, Poole, UK)浸泡2分钟，然后在自来水中冲洗，轻苏木精反染色。阳性对照组织为十二指肠(ck7)和扁桃体(ck13)。 Negative controls underwent all steps but were incubated with PBS instead of the primary antibody solution.
嵌套聚合酶链式反应和测序gydF4y2Ba
第一轮和第二轮引物被设计用来扩增5-9的外显子gydF4y2Bap53gydF4y2Ba外显子2gydF4y2Bap16gydF4y2Ba(麻省理工学院，剑桥，马萨诸塞州，美国)。第一轮寡核苷酸引物对被专门设计用于扩增包含第二轮聚合酶链反应(PCR)引物覆盖的扩增子的区域。引物优化确定了每对引物的最佳试剂浓度和退火温度。引物序列列于补充资料(补充表1A-C)。PCR的两个步骤都在Omni PCR UV罩中进行，以尽量减少污染(Bioquell, Andover, Berkshire, UK)。只有未受污染的阴性对照管的产品才能进行测序。PCR产物使用ABI 3100 DNA测序仪(Applied Biosystems, Foster City, California, USA)上的BigDye终止循环测序器进行测序。将获得的序列直接与修订后的剑桥参考序列进行比较，并将任何确定的突变与癌症体细胞突变目录(COSMIC)数据库(gydF4y2Bawww.sanger.ac.ukgydF4y2Ba)(英国剑桥)。从食管腺鳞状管工作的解剖裂解液重复测序两次。gydF4y2Ba
微卫星分析gydF4y2Ba
三个微卫星标记;D5S346 (gydF4y2BaAPCgydF4y2Ba基因),D9S932 (gydF4y2Bap16gydF4y2Ba基因)和D17S786 (gydF4y2Bap53gydF4y2Ba基因)，用于LOH分析。本构纯合标记被评为无信息性标记。正向寡核苷酸引物在5 '端用羧基荧光素(FAM)荧光标记物(Sigma)标记。使用LA TAKARA试剂盒(TAKARA Bio, Shiga, Japan)进行PCR扩增。PCR产物用ABI 3100测序仪(Applied Biosystems)和基因型2.5软件(perkins - elmer, Boston, Massachusetts, USA)进行分析。在每个标记处，如果受影响隐窝中一个等位基因峰下的面积小于其他等位基因的0.5倍或大于2倍，在使用结构DNA(固有层组织的微解剖区域)校正相关区域后，杂合性丢失被认为存在。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
在Prism 4.0软件(Graphpad software, San Diego, California, USA)上使用双尾Fisher精确测试运行分析个体隐窝点突变和肿瘤抑制基因等位基因丢失之间的关联。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
活组织检查gydF4y2Ba
从5名患者的6份活组织切片中分离出37个个体隐窝和7个鳞状岛。从活组织检查样本中分析个体隐窝，可以检测出LOH模式gydF4y2Bap16gydF4y2Ba，gydF4y2Bap53gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba腺瘤息肉病杆菌gydF4y2Ba（gydF4y2BaAPCgydF4y2Ba)肿瘤抑制基因，当整个活检切片消化和分析时，这是无法证明的。这可能是整个活检样本中正常间质稀释的结果(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba和补充gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba）gydF4y2Ba
Oesophagectomy块gydF4y2Ba
从3名患者的10个食道切除块中解剖出127个Barrett隐窝和14个鳞状岛。鳞状岛屿被定义为被化生组织完全包围和吞噬的鳞状黏膜区域。细胞角蛋白13抗体的基底上鳞状岛免疫染色显示鳞状细胞分化。在所有的食管切除术块中发现了LOH模式的克隆异质性和已识别的点突变。识别明显的点突变是证明克隆性的有力工具，一个病人有两个不同的gydF4y2Bap16gydF4y2Ba来自不同块的隐窝的点突变，表明存在至少两个独立的克隆(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)．在整个区块的每一个被解剖的隐窝中都没有发现单一的固定突变，尽管有一些gydF4y2Bap53gydF4y2Ba点突变出现在同一患者的多个块中(补充gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)．对每个点突变和等位基因丢失的个体Fisher精确测试进行计算。计算出的p值被制成表格，显示出两者之间的显著关联gydF4y2Bap53gydF4y2Ba点突变和三个等位基因中的任何一个缺失。没有发现两者之间的联系gydF4y2Bap16gydF4y2Ba点突变和肿瘤抑制基因LOH。gydF4y2Ba
食管腺鳞状管gydF4y2Ba
除了一个被解剖的鳞状岛屿外，所有的岛屿都是野生型的，尽管经常被变异的巴雷特穴所包围。野生型鳞状岛状上皮增生变异的深部Barrett食管隐窝，形成薄的表层，这与之前的结果一致，特别是在Barrett的消融治疗尝试后。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba此外，通常发现鳞状岛位于食管深层腺体上。在一个病例中，发现一个鳞状岛状食管腺管侵入Barrett食管(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)．对周围巴雷特上皮的显微解剖显示gydF4y2Bap53gydF4y2Ba想法点突变看起来相当不可理喻;而食管下的鳞状岛和相邻的食管腺鳞状管则是gydF4y2Bap53gydF4y2Ba野生型，表明存在与周围巴雷特发育不良不同的克隆体。在三个组织块中，也可以发现食管鳞状管上皮与化生巴雷特隐窝的连续性，与Coad的发现相似gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba16gydF4y2Ba在一个病例中，仔细的化生上皮显微解剖发现在2号外显子有沉默的点突变gydF4y2Bap16gydF4y2Ba，亦可见于分开解剖的鳞状管(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)．该突变是非编码的，因此不太可能是导致化生转变的起始突变，但确实可以作为一种有用的克隆标记，显示两种上皮类型的克隆起源，并提示化生上皮起源于鳞状管起源。在食道腺腺泡中也检测到相同的突变，表明突变细胞子代的双向流动类似于在布伦纳腺中看到的。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
本研究改进了以往的Barrett食管克隆研究，研究了个体隐窝的克隆起源，而不是纯化的整个活检标本。我们在这里已经表明，单个活组织检查可以是表型和基因异质性的，对整个活组织检查样本的分析掩盖了个体隐窝分析中发现的一些突变。因此，对整个活检样本的遗传分析，即使是那些靶向性很强的样本，也可能无法检测到所有的突变或克隆，这使得它们作为巴雷特食管监测生物标志物的用途受到质疑，因为样本中的少数克隆可能无法检测到。gydF4y2Ba
在所有病例中，大的食管切除块的解剖也显示出相当大的表型和基因型异质性。gydF4y2Bap16gydF4y2Ba点突变仅限于单个块，与任何等位基因的丢失没有显著关联;然而，两者之间存在显著的关联(Fisher确切检验p<0.004)gydF4y2Bap53gydF4y2Ba所有三个肿瘤抑制基因的点突变和等位基因缺失。这与TP53蛋白细胞周期检查点活性的功能丧失是一致的，从而允许广泛的、大规模的基因改变。此外,gydF4y2Bap53gydF4y2Ba点突变，虽然没有出现在每个隐窝，但经常出现在来自单一食管切除术标本的多个块，表明广泛和深远的克隆扩展是强大的选择优势的结果gydF4y2Bap53gydF4y2Ba损失将提供(补充)gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)．这与Prevo的研究结果相似gydF4y2Ba等gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba但是我们的个体隐窝分析技术也可以检测到竞争的p53野生型克隆，这些克隆可能在整个活检样本中被掩盖了。gydF4y2Ba
巴雷特氏组织的表型和基因型异质性已经得到了很好的描述，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba5gydF4y2Ba8gydF4y2Ba包括患有多种不同的gydF4y2Bap53gydF4y2Ba点突变。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba这种异质性以前已经用原始单一种群的克隆分岔和遗传分化来解释;然而，这种分岔重要的假设是存在一个最初的奠基人，固定的突变应该仍然能够识别所有的隐窝，尽管后续的遗传分歧。使用我们的逐个加密的分析，我们没能在整个区块的每个加密中显示出一个单一的创始人突变，包括gydF4y2Bap16gydF4y2Ba失活。Bi-allelic损失gydF4y2Bap16gydF4y2Ba在一些隐窝中意味着表观遗传甲基化不太可能是一个未被检测到的奠基人突变。gydF4y2Bap16gydF4y2Ba等位基因丢失、点突变或甲基化失活是巴雷特MCS通路中被认为最早的病变之一，据说易于选择性扫描。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba我们找不到完全固定突变的证据:另一方面，区域LOH和点突变模式可以被识别。这表明克隆扩增可能是在多个独立克隆之间进行的，而不是一个单一的创始人突变横扫整个巴雷特片段到固定。gydF4y2Ba
有人提出，但从未证实，食管粘膜下腺管可能是巴雷特食管化生组织的起源。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba16gydF4y2Ba19gydF4y2Ba这些结果证明了这一假设gydF4y2Bap16gydF4y2Ba起源于微解剖鳞状管组织的点突变也在邻近的化生隐窝中发现。在两种不同的上皮类型中存在相同的突变是强有力的证据，表明人类巴雷特食管化生组织的起源是位于食管腺鳞状管的一个祖细胞。此外，可以看到野生型鳞状腺管中出现野生型鳞状腺管，并且完全被鳞状腺管包围gydF4y2Bap53gydF4y2Ba突变场，强烈表明一个新的克隆的发展。这支持了新的鳞状岛屿可以在巴雷特消融治疗后从腺组织中重新产生的假设，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba并扩展了保尔森的发现gydF4y2Ba等gydF4y2Ba13gydF4y2Ba通过展示这些野生型岛屿来自于非突变的鳞状导管组织。gydF4y2Ba
多个相互竞争的独立克隆的证明，以及从食管腺鳞状管中识别出Barrett食管的起源，该结构存在于食管的整个长度，使得Barrett食管克隆进化的新模式得以发展。我们认为十二指肠胃食管反流引起的溃疡和炎症可诱导位于食管腺鳞状管的某些干细胞群的肿瘤抑制基因突变。这就产生了多个不同的化生组织克隆，然后它们竞争在食道上定植，在整个部分形成了克隆的马赛克图案。具有较大选择优势的种群的克隆扩展导致优势和广泛的克隆;然而，没有一个单一的突变是固定的，因为竞争的野生型克隆也可以识别。非突变的鳞状腺管可能是野生型鳞状岛的来源(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)．这些数据不能排除突变组织从食管-胃交界处的延伸;然而，我们建议食道腺管应该被认为是我们在这里展示的多个独立克隆的替代或额外来源。gydF4y2Ba
尽管食道上皮细胞的死亡率很高，而且癌症的发病率也在不断增加，但它的细胞生物学研究还不够充分。乳头间基底层被认为是一个可能的干细胞区gydF4y2Ba21gydF4y2Ba但巴雷特化生起源于食管鳞状上皮，这与另一层鳞状上皮皮肤形成了有趣的类比。在表皮中，干细胞不仅存在于滤泡间上皮中，也存在于相关的深层结构中;具体来说，就是毛囊的凸起区域。gydF4y2Ba21gydF4y2Ba一个可能的食管腺管干细胞龛的临床意义，既是巴雷特化生和野生型鳞状岛的来源，意味着这些结构值得进一步详细分析。gydF4y2Ba
总之，我们已经证明了Barrett食管的两个重要特征。首先，克隆异质性来自多个独立克隆，之前无法通过整个活检分析检测到;第二，Barrett 's化生和新鳞状岛可产生于食管腺鳞状管。gydF4y2Ba
参考文献gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
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Web仅附录57/8/1041gydF4y2Ba
本数据补编中的文件:gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
资助:gydF4y2BaSJL由医学研究理事会资助;SLP、SACM和NAW由英国癌症研究中心资助;SACM和JAJ也得到了牛津大学的资助。gydF4y2Ba
利益冲突:gydF4y2Ba一个也没有。gydF4y2Ba
伦理批准:gydF4y2Ba该研究获得了牛津郡研究和伦理委员会(MREC 07/Q1604/17)的多中心伦理批准。gydF4y2Ba
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