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  • FSTL1促进肝纤维化改变通过调节巨噬细胞功能的细胞内PKM2的函数

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菜单条
肝脏病学
原始研究
FSTL1促进肝纤维化改变通过调节巨噬细胞功能的细胞内PKM2的函数
  1. Jianhua饶1,2,3,
  2. 郝王1,2,
  3. 明倪1,2,
  4. 王曾1,2,
  5. 章子怡王1,2,
  6. 歌魏1,2,
  7. μ刘1,2,
  8. 彭王1,2,
  9. Jiannan邱1,2,
  10. Lei张1,2,
  11. 陈吴1,2,
  12. Hongbing沈2,4,
  13. Xuehao王1,2,
  14. 冯程1,2,3,
  15. 凌陆1,2,3,4
  1. 1肝胆管的中心的第一附属医院、南京医科大学;肝移植和移植免疫学研究中心,中国医学科学院,南京,江苏,中国
  2. 2江苏癌症生物标记物的关键实验室,预防和治疗,个性化的癌症医学协同创新中心,南京医科大学,南京,江苏,中国
  3. 3江苏生物医学功能材料协同创新中心,南京师范大学化学与材料科学学院,南京,江苏,中国
  4. 4生殖医学国家重点实验室,南京医科大学,南京,江苏,中国
  1. 对应到凌博士,第一附属医院肝胆管的中心,南京医科大学、南京,中国;级在}{njmu.edu.cn;冯博士,第一附属医院肝胆管的中心,南京医科大学、南京,中国;docchengfeng在}{njmu.edu.cn;建华饶博士第一附属医院肝胆管的中心,南京医科大学、南京,中国;raojh在}{njmu.edu.cn

文摘

客观的Follistatin-like蛋白1 (FSTL1)被广泛认为是分泌的糖蛋白,但其作用调制macrophage-related炎症没有记录在肝纤维化。在此,我们旨在描述角色的巨噬细胞FSTL1在肝纤维化的发展。

设计表达进行了分析与人类肝脏样本来自33个肝纤维化患者和18个人不纤维化作为控制。Myeloid-specific FSTL1-knockout (FSTL1M-KO构造)老鼠来探讨巨噬细胞的功能和机制FSTL1 3四氯化碳引起的小鼠肝纤维化模型注入,胆管结扎或methionine-deficient choline-deficient饮食。

结果FSTL1表达显著升高的巨噬细胞纤维化的肝脏的人类和老鼠。Myeloid-specific FSTL1缺乏有效的减毒肝纤维化的进展。在FSTL1M-KO老鼠,开发微环境在肝纤维化显示相对较少的炎症,证明了减毒浸润的单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞减少促炎因子的表达。FSTL1M-KO巨噬细胞表现出抑制促炎M1两极分化和核因子k B途径激活体内和体外。此外,这项研究表明,通过其颗域,FSTL1直接绑定到丙酮酸激酶M2 (PKM2)。FSTL1提升PKM2磷酸化和核易位,有趣的是,减少PKM2泛素化增强PKM2-dependent糖酵解和增加M1两极分化。药理激活PKM2 (DASA-58)部分反击FSTL1-mediated糖酵解和炎症。

结论巨噬细胞FSTL1促进肝纤维化的进展诱导M1两极分化和炎症巨噬细胞的胞内PKM2重组功能。

  • 炎症
  • 肝纤维化
  • 巨噬细胞
  • 信号

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl - 2021 - 325150

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    本研究的意义

    已知在这个问题上是什么?

    • 巨噬细胞已被确认为肝脏炎症的主要监管机构,这是肝纤维化的进展或解决的关键。

    • Follistatin-like蛋白1 (FSTL1)被广泛认为是分泌的糖蛋白,在许多疾病的监管职能。

    • 分泌/循环FSTL1提出了促进炎症的蛋白质或fibrosis-related疾病secretion-dependent的方式。

    有什么新发现吗?

    • FSTL1在巨噬细胞表达增加,与组织学呈正相关的人类和小鼠的肝纤维化阶段。

    • 骨髓FSTL1缺乏抑制M1两极分化,减少促炎介质表达和巨噬细胞/中性粒细胞招聘和减轻肝纤维化。

    • FSTL1直接绑定到丙酮酸激酶M2 (PKM2),抑制ubiquitin-mediated退化,提高胞质PKM2的稳定和促进PKM2在巨噬细胞磷酸化和核易位。

    • PKM2 FSTL1-mediated M1两极分化是至关重要的,在巨噬细胞炎症和糖酵解。

    它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?

    • 我们的研究结果提供了一个新颖的治疗策略的理由改善macrophage-mediated肝脏炎症和纤维化。

    介绍

    肝纤维化是最常见的慢性肝脏疾病的结果,它导致>全球每年100万人死亡。1先进的肝纤维化,特别是其晚期的形式,肝硬化,通常被认为是不治之症,肝移植是唯一的和明确的治疗选择。2各种目的,如病毒性肝炎、酒精滥用,胆汁淤积,最近发现,非酒精性脂肪肝(NASH),会引起慢性肝损伤和肝纤维化。3然而,这种机制的精确调节是有问题的和无法控制的,特别是当肝损伤仍然存在。目前,肝纤维化被广泛认为是一个动态级联的推动下持续和过度激活肝脏炎症的发展以应对反复性或慢性肝细胞损伤不论病因学。4个5不受控制的慢性炎症是一个可观的驱动力将自限性的组织修复过程转换为一个恶性循环,促进肝纤维化的进展。6

    免疫细胞,尤其是liver-residing枯氏细胞和招募巨噬细胞,已经被确认为肝脏炎症的主要监管机构是肝纤维化的进展或解决的关键。7受损肝细胞释放危险分子模式(抑制)激活枯氏细胞和巨噬细胞渗透。激活巨噬细胞释放多种细胞因子,直接损害肝实质细胞,增强炎性细胞浸润和激活肝星状细胞(hsc)。8 9据报道肝巨噬细胞促进肝纤维化增加激活肝星状细胞的生存在一个核因子k B (NF-κB)端依赖的方式。10此外,macrophage-derived转化生长因子(TGF) -β已经被认定为一个关键分子发起HSC激活。11此外,一些研究已经表明,toll样受体(TLR) 4和TLR-9信号通路调节炎症和纤维化的因素之间的串扰。12日13因此,更深入地理解底层机制参与macrophage-orchestrated慢性肝脏炎症可以提供有价值的信息,有助于阻止和有效逆转肝纤维化。

    Follistatin-like蛋白1 (FSTL1)被广泛称为分泌糖蛋白与监管职能在许多疾病和在胚胎发生是必不可少的。14FSTL1-deficient老鼠患产后由于呼吸衰竭死亡,而hypomorphic老鼠发展自发的肺气肿。15日16除了监管职能在胚胎发育,FSTL1在炎症的作用已被广泛研究在过去的十年。17 18然而,是否FSTL1起促炎作用仍然有争议。17-21FSTL1被广泛认为是内外fibrosis-promoting蛋白质的肝脏,但以往的研究主要集中在FSTL1 profibrotic功能的间充质细胞如成纤维细胞、巨噬细胞等炎性细胞。22 - 24丙酮酸激酶M2 (PKM2)是直接参与代谢重编程(有氧糖酵解)与癌症和炎症反应有关。25日26日重要的是,PKM2可以控制炎症巨噬细胞代谢重塑。PKM2与低氧诱导因子1α(HIF-1α)和激活HIF-1α-dependent转录所需的酶在巨噬细胞有氧糖酵解。26

    在此,我们旨在描述角色和巨噬细胞在肝纤维化FSTL1机制。首先,巨噬细胞FSTL1表达评估与肝纤维化或肝硬化病人和老鼠。第二,我们创建了一个myeloid-specific FSTL1-knockout (FSTL1M-KO)老鼠研究巨噬细胞的功能FSTL1在不同的肝纤维化小鼠模型。第三,FSTL1的功能效果和潜在机制对macrophage-related炎症彻底分析体内和体外。

    材料和方法

    人类的肝脏样本

    肝脏样本来自病人肝切除术或经皮肝脏活检。肝脏样本收集来自18个良性肝脏疾病患者术后病理诊断显示血管瘤没有肝纤维化或明显的脂肪变性;18 nitrogen-frozen样品和液体石蜡包埋标本6日)和33名患者病理诊断肝纤维化(33液体nitrogen-frozen样品和16石蜡包埋的幻灯片)。控制个人,包括没有糖尿病史、酗酒或病毒性肝炎。控制样本取自正常肝组织切除血管瘤的边缘。肝纤维化的病理诊断是由资深病理学家基于他走时,马森的染色。肝纤维化患者样本根据纤维化分级评分系统由两个资深病理学家(在线补充表1 - 4)。

    动物实验

    所有老鼠都安置在一个SPF级动物设施和控制温度和湿度12-12小时光暗周期随意提供食物和水。四氯化碳(CCl4)injection-induced肝纤维化,雄性小鼠年龄在6 - 8周被随机分配接受CCl橄榄油或腹腔注射4(10% v / v溶解在橄榄油、2毫升/公斤)8周的每周两次。全身的胆管结扎(BDL)肝纤维化,雄性小鼠年龄在6 - 8周受到手术干预。简单地说,老鼠被吸入异氟烷,曝露。皮肤消毒后,中线腹部切口。共同和结扎胆管暴露在使用5 non-absorbable缝合线。样本收集手术后4周。诱导肝纤维化methionine-deficient和choline-deficient (MCD)饮食,雄性小鼠年龄在8 - 10周喂养正常食物(NC)或饮食(A02082002BR,研究饮食)表示8周时间。

    统计分析

    未配对的学生的学习任务或Mann-Whitney U测试通过使用GraphPad棱镜组进行比较(V.8.0 GraphPad软件)。P值< 0.05被认为是具有统计学意义。

    详细的方法和材料,请参考在线补充材料。

    结果

    FSTL1表达增加巨噬细胞的纤维化肝组织

    首先,我们旨在描述FSTL1表达式中纤维化肝脏样本。我们收集51人类肝脏样本包括正常和纤维化肝组织(在线补充表1 - 4)。所表示的)染色,马森的染色和信使核糖核酸(mRNA)表达的金属蛋白酶组织抑制剂1 (TIMP-1)和胶原蛋白1 a1 (COL1A1),我们的肝脏样本显示不同的组织学纤维化阶段公平群体间的可比性(在线补充图1 a, B)。有趣的是,FSTL1的mRNA和蛋白表达明显升高纤维化肝脏(与正常控制图1 a, B)。接下来,我们决定是否FSTL1表达主要是提高肝巨噬细胞。双重免疫荧光染色法显示FSTL1主要表达在人类巨噬细胞纤维化的肝脏(图1 c和在线补充图1 c)。然后,我们使用公开可用的组学数据患者样本来验证这些结果。Virus-mediated和NASH-induced肝纤维化是常见的在肝纤维化的病理过程。通过重新分析数据集出版,我们发现FSTL1表达明显升高HCV-induced或NASH-induced肝纤维化(图1 d)。27 28

    Follistatin-like protein 1 (FSTL1) expression is increased in macrophage of liver fibrosis tissues. Human dada (A–D) and mice data (E–H): (A) FSTL1 messenger RNA (mRNA) expression and (B) protein expression in human liver samples; (C) dual-immunofluorescence staining of FSTL1 and CD68 in liver samples; (D) liver FSTL1 expression among patients with HCV or non-alcoholic steatohepatitis (NASH)-induced liver fibrosis as determined by microarray data; (E) FSTL1 mRNA expression and (F) protein expression in murine livers; (G) FSTL1 mRNA expression in isolated mice liver macrophages; (H) dual-immunofluorescence staining of FSTL1 and CD68 in murine livers. Human samples: control (n=18), mild fibrosis (n=20), advanced fibrosis (n=13); mice samples (n=6–8 per group). Data were presented as mean±SEM; scale bars, 50 µm; **p<0.01, ***p<0.001. BDL, bile duct ligation; CCl4, carbon tetrachloride; MCD, methionine-deficient and choline-deficient diet.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    Follistatin-like蛋白1 (FSTL1)在肝纤维化组织的巨噬细胞表达增加。人类达达(模拟)和小鼠数据(情况):(A) FSTL1信使核糖核酸(mRNA)表达和(B)蛋白表达在人类肝脏样本;(C) dual-immunofluorescence FSTL1染色和CD68在肝脏样本;(D)肝脏FSTL1表达式中丙肝病毒或全身的非酒精性脂肪肝(NASH)患者肝纤维化是由微阵列数据;(E) FSTL1 mRNA表达和(F)在小鼠肝脏蛋白表达;(G) FSTL1 mRNA表达分离小鼠肝巨噬细胞;(H) dual-immunofluorescence染色FSTL1和CD68在小鼠肝脏。人类样本:控制(n = 18),轻度纤维化(n = 20),先进的纤维化(n = 13);老鼠样品每组(n = 6 - 8)。数据提出了均值±扫描电镜; scale bars, 50 µm; **p<0.01, ***p<0.001. BDL, bile duct ligation; CCl4四氯化碳;背景下,methionine-deficient choline-deficient饮食。

    来证实这些发现,我们探索FSTL1表达三个被公认的肝纤维化动物模型,即创新领导力4injection-induced, BDL-induced MCD食源性纤维化。FSTL1表达显著增加肝组织中获得所有模型(图1 e, F)。这些结果被验证使用三个公开可用的组学数据集(在线补充图1 d)。29-31然后,我们孤立肝纤维化肝巨噬细胞的老鼠。一致,FSTL1 mRNA表达水平明显增加巨噬细胞纤维化肝脏孤立(图1 g)。Dual-immunofluorescence染色此外显示FSTL1+CD68+巨噬细胞在比控制肝脏纤维化的肝脏(更图1 h)。此外,我们发现FSTL1巨噬细胞上高表达,降低肝星状细胞和non-expression表达肝细胞在肝纤维化组织(在线补充图2 a, B)。总的来说,这些发现表明,FSTL1肝组织中的表达显著增加,尤其是在巨噬细胞的纤维化的肝脏。

    骨髓FSTL1缺乏减轻肝纤维化

    测试FSTL1的功能+巨噬细胞在肝纤维化中,我们使用了Cre-LoxP系统创建myeloid-specific FSTL1-deficient (FSTL1M-KO老鼠)。然后,肝纤维化是FSTL1诱导FL / FL和FSTL1M-KOCCl老鼠4注入,BDL或MCD饮食。图2一个显示,肝纤维化是FSTL1明显降低M-KO老鼠比FSTL1FL / FL揭示了马森的老鼠,小天狼星红alfa-smooth肌肉肌动蛋白(α-SMA)染色。此外,降低血清丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平postchallenge FSTL1检测M-KO老鼠(图2 b)。此外,表达TGF-βTIMP-1和胶原蛋白我从FSTL明显降低肝组织中M-KO老鼠比他们同窝出生仔畜控件(图2 c)。免疫印迹(WB)分析进一步显示FSTL1缺乏减少胶原蛋白的表达我,α-SMA和TIMP-1纤维化肝组织相比,在控制组织(图2 d)。我们的研究结果表明,骨髓FSTL1不足减弱小鼠肝纤维化。

    Myeloid follistatin-like protein 1 (FSTL1) deficiency alleviates mice liver fibrosis. (A) The degree of fibrosis was evaluated by H&E, Masson’s, Sirius Red and alfa-smooth muscle actin (α-SMA) immunobiological staining; (B) serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) was measured. (C) Messenger RNA (mRNA) expression of transforming growth factor (TGF)-β, tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP-1) and collagen I was quantified by quantitative reverse transcription-PCR and (D) protein expression of collagen I, α-SMA and TIMP-1 was analysed by western blot (WB) analysis in liver samples. Data were presented as mean±SEM; n=6–8 per group; scale bars, 50 µm; **p<0.01. BDL, bile duct ligation; CCl4, carbon tetrachloride; MCD, methionine-deficient and choline-deficient diet.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    骨髓follistatin-like蛋白1 (FSTL1)缺乏减轻小鼠肝纤维化。(一)评估肝纤维化的程度),马森,天狼星红alfa-smooth肌肉肌动蛋白(α-SMA)免疫生物染色;(B)血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)测量。(C)的信使核糖核酸(mRNA)表达转化生长因子(TGF) -β的金属蛋白酶组织抑制剂1 (TIMP-1)和胶原蛋白我被定量一和量化(D)蛋白表达的胶原蛋白,α-SMA和TIMP-1被免疫印迹分析(WB)分析肝脏样本。数据提出了均值±扫描电镜;每组n = 6 - 8;酒吧、规模50µm;* * p < 0.01。BDL胆管结扎;创新领导力4四氯化碳;背景下,methionine-deficient choline-deficient饮食。

    骨髓FSTL1缺乏变弱纤维化肝脏炎症和巨噬细胞和中性粒细胞招募

    接下来,我们检查FSTL1的影响+巨噬细胞在纤维化肝组织炎症。图3一显示低表达的肿瘤坏死因子(TNF) -α和白介素(IL) 1β,和更高的表达IL - 10在纤维化肝脏从FSTL1获得M-KO老鼠比控制。一致,血清TNF-α和IL-1β水平较低,而il - 10在FSTL1更高M-KO老鼠比他们的同胞(图3 b)。此外,我们评估肝脏炎症细胞的积累F4/80和CD11b(巨噬细胞标记)和Ly6G(中性粒细胞标记)染色肝组织纤维化。与FSTL1相比FL / FL鼠标,myeloid-specific FSTL1缺乏明显减少巨噬细胞和中性粒细胞浸润在纤维化肝组织(图3汉英)。

    Myeloid follistatin-like protein 1 (FSTL1) deficiency attenuates inflammation in mice fibrotic livers. (A) Messenger RNA (mRNA) expression of tumour necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-1β and IL-10 was quantified in liver tissues; (B) serum TNF-α, IL-1β and IL-10 were measured by ELISA. (C) F4/80, (D) CD11b and (E) Ly6G were detected by immunofluorescence, and quantified as numbers of positive cells per high power field (HPF). Data were presented as mean±SEM; n=6–8 per group; scale bars, 50 µm; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. BDL, bile duct ligation; CCl4, carbon tetrachloride; MCD, methionine-deficient and choline-deficient diet.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    骨髓follistatin-like蛋白1 (FSTL1)缺乏变弱在小鼠肝纤维化的炎症。(一)信使核糖核酸(mRNA)表达的肿瘤坏死因子(TNF) -α白介素(IL) 1β和IL - 10在肝脏组织量化;(B)血清TNF-αIL-1β和用ELISA检测il - 10。(C) F4/80, (D) CD11b和(E) Ly6G被免疫荧光检测和量化的阳性细胞数量每大功率领域(高通滤波器)。数据提出了均值±扫描电镜;每组n = 6 - 8;酒吧、规模50µm;* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001。BDL胆管结扎;创新领导力4四氯化碳;背景下,methionine-deficient choline-deficient饮食。

    骨髓FSTL1缺乏抑制M1两极分化和NF-κB通路激活在纤维化的肝脏

    如上所述,myeloid-specific FSTL1缺乏减轻肝脏炎症,这表明FSTL1可能促进M1两极分化。首先,我们分析了M1的量化巨噬细胞在肝脏切片,和结果表明,更少的进气阀打开+CD68+巨噬细胞在FSTL1观察M-KO老鼠比FSTL1FL / FL老鼠(图4一)。此外,在FSTL1M-KO老鼠的mRNA表达诱导一氧化氮合酶(间接宾语)纤维化肝脏中表达下调,但__arg1调节(图4 b)。世行分析表明,骨髓FSTL1-deficient老鼠表现出减少的表达伊诺和p-STAT1 p-STAT6表达的增加肝脏纤维化的肝脏与控制(图4 c)。地/ NF-κB途径是特征明显的监管途径深入参与macrophage-orchestrated急性/慢性肝脏炎症。10,疣状纤维化肝脏和世行分析也表明FSTL1M-KO老鼠表现出沮丧地/ NF-κB途径激活(图4 d, E)。

    Myeloid follistatin-like protein 1 (FSTL1) deficiency suppresses M1 polarisation and nuclear factor kappa B (NF-κB) pathway activation in mice fibrotic livers. (A) Dual-immunofluorescence staining of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and CD68 in liver tissues; (B) messenger RNA (mRNA) expression of iNOS and Arg1 was quantified in liver tissues; (C) protein expression of iNOS, p-STAT1, p-STAT6 and GAPDH were analysed in liver samples; (D) immunofluorescence staining of p65 and diamidino-2-phenylindole (DAPI) in liver tissues; (E) protein expression of toll-like receptor (TLR)-4, phospho-IkappaB kinases (p-Ikk), p-NF-κBp65 and GAPDH were analysed in liver samples. Data were presented as mean±SEM; n=6–8 per group; scale bars, 50 µm; **p<0.01. BDL, bile duct ligation; CCl4, carbon tetrachloride; MCD, methionine-deficient and choline-deficient diet.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    骨髓follistatin-like蛋白1 (FSTL1)缺乏抑制M1两极分化和核转录因子k B (NF-κB)途径激活小鼠肝纤维化。(一)Dual-immunofluorescence染色诱导一氧化氮合酶(间接宾语)和CD68在肝组织中;(B)的信使核糖核酸(mRNA)表达伊诺__arg1量化肝脏组织中;(C)蛋白表达的进气阀打开,p-STAT1 p-STAT6和GAPDH肝脏样本进行分析;(D)免疫荧光染色p65和diamidino-2-phenylindole (DAPI)在肝组织中;(E)蛋白表达的toll样受体(TLR) 4, phospho-IkappaB激酶(p-Ikk) p-NF-κBp65 GAPDH和分析肝脏样本。数据提出了均值±扫描电镜;每组n = 6 - 8;酒吧、规模50µm;* * p < 0.01。 BDL, bile duct ligation; CCl4四氯化碳;背景下,methionine-deficient choline-deficient饮食。

    FSTL1直接结合PKM2并提高PKM2在巨噬细胞的稳定性

    进一步调查机制的监管作用巨噬细胞FSTL1在肝纤维化过程中,免疫沉淀反应(IP)化验和质/ MS筛选进行探索FSTL1绑定到潜在的巨噬细胞中蛋白质。我们特别感兴趣的决定直接与FSTL1 PKM2在巨噬细胞(图5 a, B)。因此,细胞溶解产物免疫沉淀反应使用anti-FSTL1或anti-PKM2抗体,然后Co-IP复杂是免疫印迹。结果表明,FSTL1绑定到PKM2在巨噬细胞(图5 c)。此外,共聚焦免疫荧光分析显示,FSTL1 colocalised PKM2在细胞质和细胞核(图5 d)。接下来,我们分析了域FSTL1-PKM2互动的关键。根据之前报道的结构特点FSTL1 PKM2,质粒编码四截短片段的FSTL1 ahemagglutinin (HA)标记和三截短片段PKM2每个国旗标签是构造和转染293 T细胞(图5 e)。32 33细胞溶解产物受到IP anti-HA抗体和免疫印迹anti-FLAG抗体。我们的数据表明,该颗FSTL1是至关重要的领域与PKM2的n端或糖基(图5 f)。这些结果表明,FSTL1直接与PKM2通过FSTL1颗域和n端或PKM2的糖。Upregulation PKM2的蛋白质在组织曾通过促进转录,抑制蛋白酶体降解或增强mRNA翻译。34然而,在这项研究中,没有明显差异FSTL1-knockout PKM2 mRNA水平或FSTL1-overexpressing细胞(在线补充图3)。因此,我们推测FSTL1可能调节蛋白质PKM2的稳定。环己酰亚胺追逐化验的结果表明PKM2在FSTL1-downregulated细胞有一个短的半衰期,PKM2的半衰期更长时FSTL1-overexpressing细胞比控制细胞(图5克)。这些结果表明,FSTL1可能调节PKM2稳定通过抑制蛋白酶体降解。值得注意的是,我们观察到蛋白质水平的降低是差别PKM2伴随着FSTL1对这些回收的FSTL1 mg - 132M-KO和FSTL1o / e骨骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)文化(图5 h)。然后,使用体外泛素化试验,我们测试了FSTL1是否参与ubiquitin-mediated PKM2退化。Downregulation FSTL1增加FSTL1 PKM2蛋白的泛素化水平M-KOBMDMs。PKM2的ubiquitin-mediated降解效果显著废除在FSTL1-overexpressing BMDMs (图5我)。PKM2泛素化是一个关键的步骤,PKM2磷酸化和核易位。

    Follistatin-like protein 1 (FSTL1) directly binds with pyruvate kinase M2 (PKM2) and enhances the stability of PKM2 in macrophages. (A) The Co-immunoprecipitation (Co-IP) complex was subjected to silver-staining (line 4 represented the eluted protein); (B) the peptide sequences of the PKM2 protein as detected in the Co-IP complex by mass spectrometry; (C) western blot (WB) analysis of Co-IP complex confirmed that FSTL1 interacted with PKM2 in bone marrow-derived macrophages (BMDMs); (D) the immunofluorescence showed that FSTL1 colocalised with PKM2 and were expressed in both the cytoplasm and nucleus of BMDMs; (E) the structural compositions of FSTL1 and PKM2; (F) WB analysis of relationship between truncated FSTL1 and full-length PKM2 or truncated PKM2 and full-length FSTL1; (G) BMDMs extracted from FSTL1FL/FL and FSTL1M-KO mice and BMDMs extracted from FSTL1FL/FL transfected with LV-FSTL1 or lentivirus-negative control (LV-NC) were treated with cycloheximide (100 ng/mL) for the indicated periods of time; (H) BMDMs extracted from FSTL1FL/FL and FSTL1M-KO mice and BMDMs extracted from FSTL1FL/FL transfected with LV-FSTL1 or LV-NC were treated with or without MG132 (50 µM) for 6 hours. (I) In vitro ubiquitination assay of FSTL1FL/FL, FSTL1M-KO and FSTL1o/e BMDMs. All cells were co-transfected with FLAG-PKM2 and HA-UB plasmid. Cell lysates were immunoprecipitated with anti-FLAG antibody followed by immunoblotting analysis with anti-HA or anti-FLAG antibody. Scale bars, 50 µm.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    Follistatin-like蛋白1 (FSTL1)直接与丙酮酸激酶结合M2 (PKM2)和增强PKM2在巨噬细胞的稳定性。(一)Co-immunoprecipitation (Co-IP)复杂受到silver-staining(4号线代表筛选了蛋白);(B) PKM2的肽序列中发现Co-IP复杂的蛋白质质谱分析;(C) Co-IP复杂的免疫印迹(WB)分析证实,FSTL1与PKM2在骨骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs);(D)免疫荧光显示FSTL1 colocalised和PKM2在细胞质和细胞核表达BMDMs;(E)的结构成分FSTL1 PKM2;(F)截断FSTL1世行分析关系和长篇PKM2或截断PKM2长篇FSTL1;(G)从FSTL1 BMDMs提取FL / FL和FSTL1M-KO老鼠和BMDMs从FSTL1中提取FL / FL转染LV-FSTL1或lentivirus-negative控制(LV-NC)治疗与环己酰亚胺(100 ng / mL)表示时间;(H)从FSTL1 BMDMs提取FL / FL和FSTL1M-KO老鼠和BMDMs从FSTL1中提取FL / FL转染LV-FSTL1或LV-NC治疗有或没有MG132(50µM) 6小时。(我)体外FSTL1泛素化试验FL / FL,FSTL1M-KO和FSTL1o / eBMDMs。所有的细胞都co-transfected FLAG-PKM2和HA-UB质粒。细胞溶解产物与anti-FLAG抗体免疫沉淀反应后通过免疫印迹分析anti-HA或anti-FLAG抗体。酒吧、规模50µm。

    Follistatin-like protein 1 (FSTL1) promotes pyruvate kinase M2 (PKM2) phosphorylation and nuclear translocation in macrophage of fibrotic liver tissues. Human data (A–B) and mice data (C–D): (A) immunofluorescence staining of FSTL1 (upper panels) or PKM2 (lower panels), CD68 and DAPI in human liver tissues; (B) expressions of PKM2 and FSTL1 were analysed by western blot (WB) analysis in cytoplasm and nucleus of human livers; (C) immunofluorescence staining of PKM2, CD68 and DAPI in mice fibrotic livers; (D) expression of PKM2 and p-PKM2 were determined by WB analysis in cytoplasm and nucleus of fibrotic livers. Scale bars, 20 μm. BDL, bile duct ligation; CCl4, carbon tetrachloride; MCD, methionine-deficient and choline-deficient diet.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    Follistatin-like蛋白1 (FSTL1)促进丙酮酸激酶M2 (PKM2)磷酸化和纤维化肝组织的巨噬细胞的核易位。人类小鼠(A - b)和数据(c - d): (A)免疫荧光染色的FSTL1(上层板)或PKM2(低板)、CD68及DAPI人类肝脏组织;(B)表达式PKM2和FSTL1被免疫印迹分析(WB)分析在人类肝脏细胞质和细胞核;(C)免疫荧光染色PKM2、CD68及DAPI小鼠肝纤维化;(D) PKM2的表达和p-PKM2由世行分析在细胞质和细胞核的纤维化肝脏。酒吧、规模20μm。BDL胆管结扎;创新领导力4四氯化碳;背景下,methionine-deficient choline-deficient饮食。

    FSTL1促进PKM2磷酸化和核易位纤维化肝组织的巨噬细胞

    探索PKM2在FSTL1-mediated巨噬细胞炎性表型转换、我们首先检查PKM2表达式是否改变巨噬细胞的纤维化的肝脏。免疫荧光染色显示肝纤维化有更多FSTL1+巨噬细胞(图6,上面板)和PKM2+巨噬细胞(图6比控制肝脏,面板)。然后,我们分析了PKM2的蛋白表达和FSTL1细胞质和细胞核的人类肝脏样本,显示PKM2的表达和FSTL1显著增加细胞质和细胞核的纤维化肝组织(图6 b和在线补充图4)。免疫荧光染色显示核易位PKM2和FSTL1显著增加巨噬细胞从病人肝脏(与控制图6紫色区域)。人类纤维化肝脏的结果类似于鼠标纤维化的肝脏。相比之下,破坏骨髓FSTL1 PKM2明显减少+巨噬细胞和阻碍了核进口PKM2在肝巨噬细胞与FSTL1相比FL / FL老鼠(图6 c)。PKM2磷酸化以前是单体或二聚体配置的一个指标,可易位到细胞核。33 35因此,我们分析了总PKM2的蛋白表达和p-PKM2细胞质和总PKM2在孤立肝巨噬细胞的细胞核。图6 d显示,相比之下,FSTL1FL / FL缺乏控制,FSTL1总PKM2的表达减少,细胞质中的p-PKM2然后减少总PKM2在细胞核中。总的来说,这些结果表明,巨噬细胞FSTL1促进PKM2的核易位。

    FSTL1缺乏炎症反应变弱,M1两极分化,在巨噬细胞糖酵解

    进一步分析如何FSTL1调节巨噬细胞功能体外,BMDMs是从FSTL1分化的FL / FL或FSTL1M-KO老鼠细胞并受脂多糖(LPS)刺激。FSTL1M-KO巨噬细胞显示减少的表达TNF-αIL-1β和il - 10的表达增加(图7 a, B)。与体内实验一致,FSTL1删除减毒M1两极分化和减少地/ NF-κB途径激活后的BMDMs有限合伙人治疗(图7 c g)。接下来,我们探讨是否缺FSTL1减少PKM2表达式和核易位体外。PKM2表达式及其核易位FSTL1减毒M-KOBMDMs (图7 c, D)。PKM2 Warburg效应是至关重要的。36探索是否FSTL1也调节糖酵解,我们检测了细胞外释放乳酸酸化率(ECAR)和相对水平在这些巨噬细胞。我们发现ECAR和乳酸FSTL1 LPS刺激后明显下降M-KOBMDMs FSTL1相比FL / FLBMDMs (图7 h,我)。我们使用了糖酵解抑制剂2-deoxy-D-glucose (2 dg)阻止葡萄糖供应,发现减少的表达IL-1βFSTL1伊诺M-KOBMDMs抑制(图7 j)。此外,我们cocultured肝星状细胞和BMDMs LPS-induced炎性环境(在线补充图5)。FSTL1-deficient BMDMs明显减少α-SMA表达和减毒肝星状细胞的激活(在线补充图5 b, C)。

    Follistatin-like protein 1 (FSTL1) deficiency attenuates inflammation and glycolysis in macrophages. Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) treated with 100 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) for 24 hours (A–G): (A–B) messenger RNA (mRNA) and protein expressions of tumour necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-1β and IL-10 were determined ; (C) immunofluorescence staining of pyruvate kinase M2 (PKM2) and inducible nitric oxide synthase (iNOS); (D) protein expression of PKM2, p-PKM2, iNOS, p-STAT1 and p-STAT6; (E) mRNA expression of iNOS and Arg1 was measured; (F) immunofluorescence staining of p65 and DAPI; (G) protein expression of toll-like receptor (TLR)-4, p-nuclear factor kappa B (NF-κB) and p-Ikk; (H) lactate acid production was measured from BMDMs in response to LPS (100 ng/mL, 6 hours). (I) Glycolytic rate and compacities of BMDMs were measured by real-time recording of extracellular acidification rates (ECAR) after successively injection of glucose (Glc), oligomycin (O) and 2-DG. (J) FSTL1FL/FL and FSTL1M-KO BMDMs treated with LPS (100 ng/mL, 4 hours). These cells were washed twice and pretreated with 10 mM 2-DG for 1 hour, followed by treatment with or without LPS (100 ng/mL) for another 4 hours. mRNA expression of IL-1β and iNOS were determined. Data were presented as mean±SEM of at least three independent experiments; scale bars, 50 µm; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    缺Follistatin-like蛋白1 (FSTL1)变弱在巨噬细胞炎症和糖酵解。骨骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)处理100 ng / mL脂多糖(LPS) (g): 24小时(a - b)信使核糖核酸(mRNA)和蛋白质表达的肿瘤坏死因子(TNF) -α,白介素(IL) 1β和IL - 10测定;(C)免疫荧光染色的丙酮酸激酶M2 (PKM2)和诱导一氧化氮合酶(间接宾语);(D)蛋白的表达PKM2 p-PKM2,进气阀打开,p-STAT1 p-STAT6;(E)的mRNA表达伊诺和__arg1测量;(F)免疫荧光染色p65和DAPI;(G)蛋白表达的toll样受体(TLR) 4、κB (NF-κB)和p-Ikk p-nuclear因素;(H)乳酸酸生产测量从BMDMs应对有限合伙人(100 ng / mL, 6小时)。(I)糖酵解速率和compacities BMDMs被实时记录测量细胞外酸化率(ECAR)先后注射后的葡萄糖(相关),寡霉素(O)和2 dg。(J) FSTL1FL / FL和FSTL1M-KOBMDMs处理有限合伙人(100 ng / mL, 4小时)。这些细胞被洗两次,使用10毫米2 dg 1小时,其次是治疗有或没有有限合伙人(100 ng / mL)为另一个4小时。信使rna的表达IL-1β和伊诺被确定。数据提出了均值±SEM至少有三个独立的实验;酒吧、规模50µm;* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001。

    PKM2激活抑制FSTL1-mediated M1两极分化,在巨噬细胞糖酵解

    进一步确定PKM2在FSTL1-induced巨噬细胞分化的作用和糖酵解,FSTL1-overexpressing (FSTL1o / e)与小分子PKM2活化剂DASA-58 BMDMs的待遇。37 38DASA-58缓解FSTL1o / e全身TNF-α和IL-1β同时增加il - 10水平(图8 a, B)。PKM2的免疫荧光染色,进气阀打开,p65抑制PKM2核易位逆转FSTL1-induced巨噬细胞M1两极分化和NF-κB激活(图8 c, D)。这些结果证实了世行PKM2的分析,p-PKM2,进气阀打开,p-STAT1, p-STAT6,地,p-Ikk BMDMs和p-p65表达(图8 eg)。进一步验证PKM2在FSTL1-mediated糖酵解的角色,我们检查了ECAR释放乳酸和相对水平。ECAR FSTL1和乳酸显著提高o / eBMDMs FSTL1n / eFSTL1 BMDMs, DASA-58有效地逆转o / e全身糖酵解增加(图8 h,我)。此外,FSTL1o / e相关的促炎介质(IL-1β和伊诺)被2 dg中和(图8 j)。这些结果验证PKM2的核和细胞质功能至关重要FSTL1-induced M1两极分化,糖酵解和炎症。

    Pyruvate kinase M2 (PKM2) activator inhibits follistatin-like protein 1 (FSTL1)-mediated inflammation and glycolysis in macrophages. Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) with FSTL1 overexpression (FSTL1o/e) or normal expression (FSTL1n/e) and FSTL1o/e BMDMs treated with DASA-58 (50 μM, 1 hour) were treated by lipopolysaccharide (LPS) stimulation. BMDMs treated with 100 ng/mL LPS for 24 hours (A–G): (A–B) messenger RNA (mRNA) expression and protein expressions of tumour necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-1β and IL-10 was determined; (C) dual-immunofluorescence staining of PKM2 and inducible nitric oxide synthase (iNOS); (D) protein expression of PKM2, p-PKM2, iNOS, p-STAT1 and p-STAT6; (E) mRNA expression of iNOS and Arg1 was measured; (F) immunofluorescence staining of p65 and DAPI; (G) protein expression of toll-like receptor (TLR)-4, p-nuclear factor kappa B (NF-κB) and p-Ikk. (H) Lactate acid production was measured from BMDMs in response to LPS (100 ng/mL, 6 hours). (I) Glycolytic rate and compacities of BMDMs were measured by real-time recording of extracellular acidification rates (ECAR) after successively injection of glucose (Glc), oligomycin (O) and 2-DG. (J) FSTL1FL/FL and FSTL1M-KO BMDMs treated with LPS (100 ng/mL) for 4 hours. These cells were washed twice and pretreated with 10 mM 2-DG for 1 hour, followed by treatment with or without LPS (100 ng/mL) for another 4 hours. mRNA levels or IL-1β and iNOS were determined. (K) Schematic illustration how FSTL1 complexed with PKM2 to promote phosphorylation and nuclear import of PKM2 and enhance cytoplasmic PKM2 stability in reprograming macrophage function during liver fibrosis. Data were presented as mean±SEM of at least three independent experiments; scale bars, 50 µm; *p<0.05, **p<0.01.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图8
    图8

    丙酮酸激酶M2 (PKM2)激活抑制follistatin-like蛋白1 (FSTL1)介导的炎症和巨噬细胞的糖酵解。骨骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs) FSTL1过度(FSTL1o / e)或(FSTL1正常表达n / e)和FSTL1o / eBMDMs对待DASA-58(50μM, 1小时)治疗脂多糖(LPS)刺激。BMDMs 100 ng / mL LPS处理24小时(g): (a - b)信使核糖核酸(mRNA)表达和蛋白质表达的肿瘤坏死因子(TNF) -α,白介素(IL) 1β和IL - 10测定;(C) dual-immunofluorescence PKM2的染色和诱导一氧化氮合酶(间接宾语);(D)蛋白的表达PKM2 p-PKM2,进气阀打开,p-STAT1 p-STAT6;(E)的mRNA表达伊诺和__arg1测量;(F)免疫荧光染色p65和DAPI;(G)蛋白表达的toll样受体(TLR) 4、κB (NF-κB)和p-Ikk p-nuclear因素。(H)乳酸酸生产测量从BMDMs应对有限合伙人(100 ng / mL, 6小时)。(I)糖酵解速率和compacities BMDMs被实时记录测量细胞外酸化率(ECAR)先后注射后的葡萄糖(相关),寡霉素(O)和2 dg。(J) FSTL1FL / FL和FSTL1M-KOBMDMs处理有限合伙人(100 ng / mL) 4小时。这些细胞被洗两次,使用10毫米2 dg 1小时,其次是治疗有或没有有限合伙人(100 ng / mL)为另一个4小时。信使rna水平或IL-1β和伊诺被确定。(K)示意图说明如何FSTL1包裹着PKM2促进磷酸化和核进口PKM2在重组巨噬细胞功能,提高胞质PKM2稳定肝纤维化。数据提出了均值±SEM至少有三个独立的实验;酒吧、规模50µm;* * * p < 0.05, p < 0.01。

    讨论

    我们所知,本研究是第一个文档FSTL1-mediated PKM2在肝纤维化是调节巨噬细胞功能的关键。主要研究结果如下:(i) FSTL1在巨噬细胞表达增加,与组织学的肝纤维化阶段呈正相关;(2)骨髓FSTL1缺乏抑制M1两极分化,减少促炎介质表达和巨噬细胞/中性粒细胞招募和减轻肝纤维化;(3)FSTL1 PKM2直接结合,抑制ubiquitin-mediated退化,提高PKM2的稳定和促进PKM2磷酸化和核易位在巨噬细胞和(iv) PKM2 FSTL1-mediated M1两极分化是至关重要的,在巨噬细胞炎症和糖酵解。我们的研究结果强调的重要性FSTL1 PKM2的关键调节器功能和炎症巨噬细胞在肝纤维化(图8 k)。

    据报道,控制炎症是一个主要的驱动力,将自限性的组织修复过程转换成一个恶性循环,促进肝纤维化的进展。6肝脏炎症巨噬细胞被确定为关键的监管机构主导肝纤维化的进展或决议。激活巨噬细胞通常分为两类,即狭义货币供应量M1及广义货币供应量M2。39M1-polarised巨噬细胞破坏当地的体内平衡和促进纤维化肝细胞相互作用和其他fibrosis-related non-parenchymal细胞,如肝星状细胞。8 39 40FSTL1被广泛认为是一种促炎基因可能参与了巨噬细胞分化。月19 - 21日据报道,FSTL1表达式是增强晚期患者肝组织和血清肝纤维化、脂肪变性。41 42我们的数据表明,FSTL1表达显著增加在人类或鼠标肝脏纤维组织的巨噬细胞。另外,我们观察到骨髓FSTL1缺乏抑制巨噬细胞地/ NF-κB激活和M1两极分化和有限的肝脏炎症和纤维化。

    FSTL1, glycoproprotein分泌,分泌FSTL1广为人知的功能之一是其在炎症调节作用,而角色的FSTL1细胞质和细胞核的不清楚。循环FSTL1水平显著升高患者的各种自身免疫性疾病。43分泌FSTL1已被证明在代谢和糖酵解中发挥调节作用。FSTL+ /−老鼠受损的能量消耗和发达的葡萄糖耐受不良褐色脂肪组织的适应性生热作用下降。44此外,两个急性和慢性注入FSTL1影响心肌细胞耗氧量和能量底物代谢通过AMPK途径激活。45这些发现强调了调节作用的FSTL1巨噬细胞的炎症反应和细胞代谢secretion-dependent的方式。然而,细胞内是否FSTL1炎症和细胞代谢的功能作为管理者仍然未知。

    一个惊人的发现是,通过其颗领域,细胞内FSTL1直接结合PKM2的n端或糖基,这是一个主免疫调节剂和建立代谢酶。PKM2作为惰性酶主要存在形式的单体或二聚体,与磷酸化状态的关键指标。33单体的/二聚的PKM2可以把成核和稳定HIF-1α促进肿瘤glycolysis-related基因的表达。35此外,PKM2直接促进巨噬细胞的促炎的重组;它由LPS刺激和调节促进IL-1β生产通过绑定到其启动子,这主要发生在M1巨噬细胞糖酵解。38,我们发现FSTL1互动以及稳定PKM2蛋白通过抑制PKM2 ubiquitin-mediated退化。我们的数据进一步表明,FSTL1增加磷酸化/核PKM2增强PKM2-mediated M1 LPS-stimulated巨噬细胞分化,促进糖酵解。据报道,PKM2可以直接绑定到和磷酸化细胞外调节激酶和PIN1-dependent的方式转移到细胞核。46然而,FSTL1如何促进PKM2的磷酸化和核易位仍然是未知的。

    IL-1β表达式与华宝在LPS-activated巨噬细胞代谢密切相关。38 47此外,巨噬细胞激活需要一个代谢从规范氧化磷酸化对糖酵解或Warburg效应。48PKM2丙酮酸激酶,被广泛认为是一种病原反应酶在糖酵解,催化作用的转移从磷酸烯醇丙酮酸磷酸基ADP和产生丙酮酸在细胞质中。有趣的是,我们发现FSTL1 PKM2的表达和稳定增加巨噬细胞的细胞质有限合伙人的待遇。从逻辑上讲,我们的数据表明,FSTL1缺乏降低LPS刺激后糖酵解。DASA-58,高度特定的小分子PKM2活化剂,导致降低糖酵解、磷酸戊糖途径中间体通过激活酶。36此外,DASA-58显著恢复这糖酵解在巨噬细胞表型。38我们发现DASA-58 FSTL1有效恢复o / e调节糖酵解,M1两极分化和地/在LPS-stimulated NF-κB通路激活巨噬细胞。因此,PKM2-mediated糖酵解也是FSTL1-related M1两极分化和炎症的关键。更重要的是,目前的研究显示精心划定FSTL1调节糖酵解和glycolysis-dependent巨噬细胞免疫反应,提供重要的见解Warburg-like巨噬细胞代谢变化。

    总之,我们揭示了巨噬细胞的功能角色FSTL1肝纤维化。FSTL1促进M1两极分化,糖酵解和绑定PKM2的炎症反应,促进PKM2磷酸化,抑制PKM2在巨噬细胞泛素化。通过识别的分子途径FSTL1介导的肝脏炎症,我们的研究结果提供了一个新颖的治疗方法改善的理由macrophage-mediated肝脏炎症和纤维化。

    数据可用性声明

    数据在公共、开放访问存储库。一个通用的实验室的电子邮件地址或个人ORCID标识符。

    伦理语句

    病人同意出版

    伦理批准

    研究设计和样本收集协议经伦理委员会批准的南京医科大学第一附属医院(序列号:2018 - srfa - 197)。所有动物研究协议机构批准的动物保健和使用委员会(IACUC)南京医科大学(美联社#:GPTAP002)。所有患者知情同意招聘的时候提供。

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    补充材料

    脚注

    • 贡献者小、HW和MN同样起到了推波助澜的作用。这项研究是由小设计,FC和我。手稿是由小、HW FC和我。实验和数据分析是由小,HW,锰、ZW, ZW(第五作者),西南,ML, PW,金桥,LZ,连续波,HS, XW、FC和LL。小、FC和支持并监督项目。我是担保人。所有作者都参与的重要修订手稿。

    • 资金支持的项目是由中国国家自然科学基金(81871259,81871259,82070675),江苏的基础生物医学功能材料协同创新中心,重点学术项目江苏高等教育机构的发展,江苏省六大人才高峰计划(2017 - 019)西南偏西和凸轮医学科学创新基金(2019 - i2m 5 - 035)。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 出处和同行评议不是委托;外部同行评议。

    • 补充材料此内容已由作者(年代)。尚未审查由BMJ出版集团有限公司(BMJ)和可能没有被同行评议。任何意见或建议讨论仅代表作者(年代)和不了BMJ的支持。和责任起源于BMJ概不负责任何依赖的内容。内容包括任何翻译材料,BMJ并不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南,术语,药物名称和药物剂量),和不负责任何错误或遗漏引起的翻译和改编或否则。