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肝脏病学
原始研究
MicroRNA-206促进CD8的招募+通过驱动M1极化的Kupffer细胞
  1. 政法刘，
  2. 小梅王，
  3. Clifford约翰牛，
  4. Guisheng歌
  1. 医学系的，明尼苏达大学双城分校，明尼阿波里斯市，明尼苏达州美国
  1. 对应到美国明尼苏达州明尼阿波利斯市特拉华街南516号明尼苏达大学双城分校医学系宋桂生博士;gsong在}{umn.edu

摘要

客观的库普弗细胞(KCs)通过与其他免疫细胞交流来预防肝细胞癌(HCC)。然而，这一过程的潜在机制还不完全清楚。

设计FVB/NJ小鼠水动力注射AKT/Ras和睡美人转座子诱导肝癌。Mini-circle和睡美人用于小鼠KCs中过表达microRNA-206。流式细胞术和免疫染色检测免疫系统变化。

结果水动力注入AKT/Ras小鼠可促进KCs的M2极化和细胞毒性T细胞(ctl)的耗竭，并促进HCC的发展。KCs的M1-to-M2转变会损害microRNA-206的生物生成。通过瞄准Klf4(克鲁帕尔样因子4)，从而增强了包括C-C基序趋化因子配体2 (CCL2)在内的M1标记的产生，microRNA-206促进了巨噬细胞的M1极化。事实上，microrna -206介导的CCL2的增加促进了通过CCR2的ctl在肝脏的招募。破坏KLF4/CCL2/CCR2轴的每个组成部分削弱了microRNA-206驱动巨噬细胞M1极化和招募ctl的能力。在AKT/Ras小鼠中，kc特异性表达的microRNA-206驱动了KCs的M1极化和ctl的肝招募，并完全预防了HCC，而对照组小鼠100%死于HCC。扰乱了microRNA-206和Klf4和CD8的消耗+T细胞破坏了miR-206预防HCC的能力。

结论KCs的M2极化是AKT/Ras小鼠肝癌的主要诱因。MicroRNA-206通过驱动KCs的M1极化，促进CD8的招募+T细胞和预防HCC，提示其可能作为一种免疫治疗方法。

  • 肝细胞癌
  • 枯氏细胞
  • 免疫疗法

数据可用性声明

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2021-324170

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    本研究的意义

    关于这个问题，我们已经知道了什么?

    • MiR-206在人肝细胞癌(HCC)中降低。

    • KLF4是NF-κB信号传导的抑制因子。

    新的发现是什么?

    • AKT/Ras信号的激活将KCs的M1极化转变为M2极化，从而损害细胞毒性T细胞(ctl)在肝脏的富集。

    • AKT/Ras信号抑制了KCs中miR-206的生物生成，这是HCC中miR-206降低的主要原因。

    • 在AKT/Ras小鼠中，kc特异性表达的miR-206完全预防肝癌，并导致晚期肝癌肿瘤的显著消退。

    • miR-206的kc特异性表达通过驱动KCs的M1极化重新建立M1/M2 KCs的比例，从而触发ctl的肝脏富集。

    • MiR-206通过调控KCs中KLF4-NFκB信号通路促进CCL2的产生和释放。

    • 通过激活CCL2/CCR2轴，miR-206增强了巨噬细胞与CD8的交流+T细胞和CD8的迁移+T细胞。

    • 破坏miR-206和Klf4CD8的消耗+T细胞损害miR-206预防HCC的能力。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 我们的数据表明miR-206是一种潜在的肝癌免疫治疗方法。

    简介

    肝细胞癌(HCC)是世界范围内最常见和最致命的癌症之一。1尽管有效的抗病毒治疗已经发展，肝癌的发生率仍在持续增加，部分原因是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的流行。2肝癌强烈的免疫介导的发病机制使这种恶性肿瘤特别吸引免疫治疗。具体地说，宿主对HCC免疫的各种因素都强烈地倾向于通过免疫编辑伴随肝纤维化形成的未解决的促炎刺激进行免疫抑制。3 4然而，HCC肿瘤微环境(TME)的复杂性突出了癌症免疫抑制的多种非冗余机制的存在，这些机制协同确定了对免疫治疗的重要耐药性障碍。因此，了解HCC中免疫抑制的潜在机制对于开发新的治疗药物而不产生不必要的免疫反应是至关重要的。

    Kupffer细胞(KCs)约占肝细胞总数的15%。5个6KCs长期以来一直被认为主要是作为清除细胞的功能，负责从门静脉循环中清除颗粒物质。5然而，一些研究报道了KCs在缺血-再灌注损伤后和NAFLD背景下的病毒感染中的作用。5KCs表达组织相容性复合体(MHC) I类和II类，以及共刺激分子，并能够启动抗原特异性免疫反应。7此外，KCs具有吞噬和产生细胞因子的能力，这与其他浸润性巨噬细胞不同。8尽管KCs在HCC中的作用仍有争议，但有令人信服的证据表明KCs是对抗HCC的重要防线。9

    巨噬细胞可诱导成两种不同的极化表型:经典激活的M1和交替激活的M2。10在健康肝脏中，M1和M2 kc之间存在平衡，但它们的功能相反。在HCC中，KCs经历M1到M2的表型转移，通过抑制适应性免疫系统促进癌症生长。11M1 KCs作为适应性免疫的士兵，通过消除癌细胞来抑制早期HCC的肿瘤发生。10现在已经确定CD8与KCs的极化有关+T细胞的募集和无法到达肿瘤细胞是免疫治疗耐药的一个重要机制。

    从机制上讲，M2的激活需要AKT的激活。12AKT/mTOR和RAS/MAPK级联的协同激活也与HCC的生物侵袭性和不良预后有关。13这种表现型是可以概括的在活的有机体内通过水动力转染活化形式的AKT (mir -AKT)和NRas (NRas- v12)致癌基因(AKT/Ras)到小鼠肝脏。13日14我们的初步数据显示，除了肝细胞外，水动力给药也激活了KCs中的AKT信号，这导致了microRNA (miRNAs)的失调。mirna是一类小的非编码rna，可以同时微调许多通路。15日16miRNAs的这一特性使我们可以推测它们可以精确地调节免疫反应，避免免疫反应过度或不充分。在本研究中，我们使用AKT/Ras小鼠研究了KCs对免疫稳态和HCC的贡献，并确定了miRNA如何调节免疫通路和HCC的发展。

    材料和方法

    miR-206 kc特异性表达载体的构建

    从小鼠基因组DNA扩增的包含miR-206前体的400 bp片段被插入pT3-EF1α载体中。CD68使用启动子确保miR-206 (pT3-CD68p-miR-206)的kc特异性表达。为了排除质粒的非特异性影响，我们生成了miR-206错配表达载体，称为pt3 - cd68p scramble。构建pT3-EF1α-myr-AKT, nRasV12/pT2-CAGGS和pCMV/SB的细节在我们之前的出版物中有描述。17miR-206前体或scramble被插入到一个迷你圆(MC)载体(System Biosciences, California, USA)中，称为MC- cd68p -miR-206或MC- cd68p -scramble。所有的MCs都是根据制造商的说明制备的。

    AKT/Ras小鼠的建立

    8周龄FVB/NJ小鼠来自Jackson实验室(Farmington, Connecticut, USA)。如前所述，进行了流体动力注入(HDI)。17为了评估miR-206对AKT/ ras诱导的HCC的作用，我们将5µg pT3-EF1α-myr-AKT、5µg NRasV12/pT2-CAGGS、10µg pT3-CD68p-miR-206和0.8µg pCMV/SB水动力注入小鼠(n=6)。对照组小鼠(n=6)接受5µg pT3-EF1α-myr-AKT、5µg NRasV12/pT2-CAGGS、10µg pt3 - cd68p scramble和0.8µg pCMV/SB。质粒混合物用2 mL生理盐水(0.9% NaCl)稀释，经0.22µm滤镜过滤，5 ~ 7 s后注入小鼠侧尾静脉。根据明尼苏达大学(University of Minnesota)动物研究委员会批准的协议，对小鼠进行饲养、喂养和监测。

    AKT/Ras治疗性小鼠模型

    为了评估miR-206的治疗潜力，8周龄FVB/NJ小鼠被注射如上所述的AKT/Ras。17AKT/Ras注射3周后，小鼠分别以每周1.5 mg/kg(静脉注射)的剂量使用MC-CD68p-miR-206或mc - cd68p scramble治疗4周。

    CD8枯竭+小鼠T细胞

    CD8+通过腹腔注射100µg的CD8单克隆抗体(mAb) (Bio X细胞，BE00223)来清除T细胞。6只小鼠水动力注射4µg pT3-EF1α-myr-AKT、4µg NRasV12/pT2-CAGGS、10µg pt3 - cd68p scramble和0.72µg pCMV/SB, 12只小鼠注射4µg pT3-EF1α-myr-AKT、4µg NRasV12/pT2-CAGGS、10µg pT3-CD68p-miR-206和0.72µg pCMV/SB。注射后1天，12只小鼠随机分为两组，分别用IgG1同型单抗(Bio X cell, BE0088)和CD8单抗(n=6)治疗。小鼠每2天注射单抗，持续7周。注射7周后，处死小鼠。

    统计分析

    使用GraphPad Prism软件进行统计分析。来自细胞系实验的数据以均数±SEM表示，并采用双尾Student 's t检验进行评估。采用双向方差分析比较多组间的统计学差异。采用Mann-Whitney检验评价小鼠实验的统计学显著性。P<0.05为差异有统计学意义。

    其他材料和方法见在线补充材料．

    结果

    激活AKT/Ras信号促进了KCs的M2极化

    AKT/Ras的HDI触发致死性肝癌(图1一个，在线补充图1A,B)．肝细胞中AKT信号活化被认为是AKT/Ras小鼠肝癌发生的主要原因。然而，除了肝细胞外，AKT/Ras的HDI驱动了AKT1在;在线补充图1C)．不幸的是，KCs中AKT/Ras信号在HCC中的作用尚不清楚。AKT/Ras小鼠肝癌肿瘤中KCs和浸润性巨噬细胞增加(在线补充图1D-G)．考虑到M2巨噬细胞在原体表型中的作用，18我们分析了AKT/Ras对KCs M2极化的影响。在小鼠中，AKT/Ras的HDI显著增加了KCs中典型M2标记物的表达(图1 b)．相反，编码M1标记基因的表达，包括诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、CCL2、白细胞介素6 (IL-6)和肿瘤坏死因子α (TNFα)在AKT/Ras小鼠的KCs中显著降低(图1 c)．为了证实这一观察结果，我们在AKT/Ras小鼠肝脏中检测了CD206(甘露糖受体C型1,M2标记)、iNOS (M1标记)和CLEC4F (C型凝集素结构域家族4成员F, KC标记)。M2 KCs的数量(CD206+CLEC4F+)更为突出(图1 d, E，在线补充图1H)， M1 KCs (iNOS+CLEC4F+)在AKT/Ras小鼠中显著降低(图1 f, G，在线补充图1H)．流式细胞术分析证实，AKT/Ras注射5周后，AKT/Ras小鼠中KCs的m1 -向m2转变增强(在线补充图2A-D)．注射AKT/Ras一周后，AKT/Ras小鼠中KCs的M2极化增强(在线补充图2E)．在体外从野生型小鼠分离的KCs中，AKT/Ras的过表达也触发了它们的M2极化(在线补充图2F)．此外，KCs中AKT信号的激活是HCC患者的一个标志(图1 h)．

    AKT/Ras activation promoted M2 polarisation of KCs. (A) Representative photos of livers of FVB/NJ mice injected with pT3-EF1α (control, n=6, 5 w.p.i.) and AKT/Ras (n=6, 5 w.p.i.). (B) mRNA levels of M2 marker genes encoding MGL2, IL-10, MGL1 and ARG1 in KCs of two groups of mice. (C) mRNA levels of M1 marker genes in KCs of two groups of mice. (D–E) Immunostaining of CD206 (M2 marker) and CLEC4F (KC marker) and the ratios of M2 KCs (CD206+CLEC4F+) in livers of two groups of mice. Scale bar: 20 μm. (F–G) Immunostaining of iNOS (M1 marker) and CLEC4F and the ratios of M1 KCs (iNOS+CLEC4F+) in livers of two groups of mice. Scale bar: 10 μm. (H) Immunostaining of CLEC4F and phosphorylated-AKT (AKT-S473) in livers of human patients. Scale bar: 50 μm. (I) Immunostaining of CD8 and CLEC4F, and the numbers of CD8+ T cells per 1000 liver cells in two groups of mice. Scale bar: 100 μm. Data represent mean±SEM. **P<0.01 and ***p<0.001 (figure 1A–G and I: Mann-Whitney U test). ARG1, arginase 1; KCs, Kupffer cells; LW, liver weight; MGL2, macrophage galactose N-acetyl-galactosamine specific lectin 2; w.p.i., weeks postinjection of AKT/Ras.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    AKT/Ras激活促进了KCs的M2极化。(A)注射pT3-EF1α(对照，n= 6,5 w.p.i)和AKT/Ras (n= 6,5 w.p.i)的FVB/NJ小鼠肝脏的代表性照片。(B)两组小鼠KCs中编码MGL2、IL-10、MGL1、ARG1的M2标记基因mRNA水平。(C)两组小鼠KCs中M1标记基因的mRNA水平。(D-E) CD206 (M2标记)和CLEC4F (KC标记)的免疫染色及M2 KCs (CD206+CLEC4F+)在两组小鼠的肝脏中。比例尺:20 μm。(F-G) iNOS (M1标记物)和CLEC4F免疫染色及M1 KCs (iNOS)比值+CLEC4F+)在两组小鼠的肝脏中。比例尺:10 μm。(H)人类患者肝脏中CLEC4F和磷酸化akt (AKT-S473)的免疫染色。比例尺:50 μm。(I) CD8、CLEC4F免疫染色及CD8数目+两组小鼠每1000个肝细胞中含有T细胞。比例尺:100 μm。数据表示的意思是±SEM。**P<0.01， *** P< 0.001(图1A-G和I: Mann-Whitney U检验)。__arg1、精氨酸酶1;枯氏细胞;;LW,肝脏重量;MGL2，巨噬细胞半乳糖n -乙酰半乳糖特异性凝集素2;注射AKT/Ras数周后。

    M1 KCs是CD8趋化分子的重要来源+T细胞。M1型KCs减少，均为CD8+T细胞和ctl (CD8+伽马线暴+)在AKT/Ras小鼠的肝癌肿瘤中减少(图1我,在线补充图2G-H)．综上所述，AKT/Ras信号的激活触发了KCs的M2转变，减少了肝脏ctl。

    在AKT/Ras小鼠中，kc特异性表达miR-206可预防肝癌

    mirna精细调节基因表达的能力使它们成为精确调节不平衡免疫系统的理想人选。19MiRNA图谱显示，miR-206 (miR-206)是AKT/Ras小鼠肝癌肿瘤中减少最多的MiRNA之一(在线补充图3A而且表1)．miR-206在不同病因的HCC患者中也被观察到降低(在线补充表2)．低水平的miR-206预示着HCC患者的低生存率(在线补充图3B)．进一步分析表明，KCs中的miR-206水平比从健康小鼠肝脏中分离的肝细胞高5倍(图2一个)．HCC的发展导致KCs中miR-206的5倍降低，而在AKT/Ras HCC小鼠肿瘤分离出的肝细胞中，miR-206仅观察到2倍的降低(图2 b)，表明KCs中miR-206的生物生成受损主要是AKT/Ras小鼠肝脏中miR-206的降低。从健康小鼠肝脏中分离出来的M2 KCs中MiR-206比M1 KCs低得多(图2 c)．

    KC-specific expression of miR-206 prevented HCC in AKT/Ras mice. (A) miR-206 levels in KCs and hepatocytes (HCs) isolated from wild-type FVB/NJ mice. (B) Levels of miR-206 in KCs and HCs from FVB/NJ mice injected with pT3-EF1α (control, n=6, 5 w.p.i.) and AKT/Ras (n=6, 5 w.p.i.). (C) miR-206 levels in M1 and M2 KCs isolated from wild-type FVB/NJ mice. (D) Kaplan-Meier survival curves of AKT/Ras mice injected with pT3-CD68p-scramble (AKT/Ras, n=6) or pT3-CD68p-miR-206 (AKT/Ras/miR-206, n=6). (E) Macroscopic and microscopic (H&E) appearance of livers from AKT/Ras/scramble (n=6, 5 w.p.i.) and AKT/Ras/miR-206 mice (n=6, 5 w.p.i.). (F) Study design to evaluate the therapeutic effect of miR-206 on HCC. (G) Kaplan-Meier survival curves of AKT/Ras mice injected with MC-CD68p-scramble (AKT/Ras, n=6) or MC-CD68p-miR-206 (AKT/Ras/miR-206, n=6). (H) Macroscopic and microscopic (H&E) appearance of livers from AKT/Ras (n=6, 3 w.p.i.), AKT/Ras/MC-CD68p-scramble (n=6, 7 w.p.i.) and AKT/Ras/MC-CD68p-miR-206 mice (n=6, 7 w.p.i.). Data represent mean±SEM. **P<0.01 (figure 2A–C and E: Mann-Whitney U test; figure 2D and G: log-rank test; figure 2H: two-way analysis of variance test). KCs, Kupffer cells; w.p.i., weeks postinjection of AKT/Ras.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    在AKT/Ras小鼠中，kc特异性表达miR-206可预防肝癌。(A)从野生型FVB/NJ小鼠分离的KCs和肝细胞(hc)中的miR-206水平。(B)注射pT3-EF1α(对照，n= 6,5 w.p.i)和AKT/Ras (n= 6,5 w.p.i)的FVB/NJ小鼠的KCs和hc中miR-206的水平。(C)从野生型FVB/NJ小鼠中分离出的M1和M2 KCs中的miR-206水平。(D) AKT/Ras小鼠注射pt3 - cd68p scramble (AKT/Ras, n=6)或pT3-CD68p-miR-206 (AKT/Ras/miR-206, n=6)的Kaplan-Meier生存曲线。(E) AKT/Ras/scramble小鼠(n= 6,5 w.p.i.)和AKT/Ras/miR-206小鼠(n= 6,5 w.p.i.)肝脏的宏观和微观(H&E)外观。(F)评估miR-206对HCC治疗作用的研究设计。(G)注入MC-CD68p-scramble (AKT/Ras, n=6)或MC-CD68p-miR-206 (AKT/Ras/miR-206, n=6)的AKT/Ras小鼠Kaplan-Meier生存曲线。(H) AKT/Ras (n= 6,3 w.p.i.)、AKT/Ras/MC-CD68p-scramble (n= 6,7 w.p.i.)和AKT/Ras/MC-CD68p-miR-206 (n= 6,7 w.p.i.)小鼠肝脏的宏观和微观(H&E)外观。数据表示的意思是±SEM。 **P<0.01 (figure 2A–C and E: Mann-Whitney U test; figure 2D and G: log-rank test; figure 2H: two-way analysis of variance test). KCs, Kupffer cells; w.p.i., weeks postinjection of AKT/Ras.

    我们研究了调控miR-206对AKT/Ras小鼠KCs的影响。pT3-CD68p-miR-206的HDI导致AKT/Ras小鼠KCs中miR-206升高，而AKT/Ras小鼠肝细胞中miR-206未见明显变化(在线补充图3C-E)．表型上，所有的AKT/Ras/scramble小鼠在注射后6-8周死于HCC，而所有mir -206处理的AKT/Ras小鼠在此阶段均健康(图2 d)．经解剖，AKT/Ras/miR-206小鼠未见肿瘤结节(图2 e)．接下来我们让AKT/Ras小鼠发生肝癌，然后用MC-CD68p-miR-206 (图2 f，在线补充图3F)．在注射AKT/Ras后的5-9周内，所有扰扰处理的小鼠都死于HCC，而AKT/Ras/miR-206小鼠表现健康(图2 g)．在解剖过程中，4周的miR-206治疗导致AKT/Ras诱导的晚期肝癌显著消退(图2 h)．

    MiR-206可减弱AKT/Ras小鼠中KCs的M2极化

    HDI主要驱动miR-206在KCs中的表达，而不是浸润的巨噬细胞(在线补充图3G)．M2 KCs抑制CD8+T细胞招募到TME。20.我们接下来研究了kc特异性表达miR-206对kc M2极化和CD8肝招募的影响+AKT/Ras小鼠的T细胞。AKT/Ras/miR-206小鼠肝脏中总KCs和浸润巨噬细胞均减少(在线补充图4A、B)．免疫染色和流式细胞术显示，AKT/Ras/miR-206小鼠肝脏中M1 KCs显著升高，M2 KCs显著降低(图3 a, B，在线补充图4C-G)．然而，在AKT/Ras/miR-206小鼠中未发现HCC (图2 e)．因此，我们不能排除这样一种可能性，即AKT/Ras/miR-206小鼠中KCs的M2-to-M1开关是由于缺乏HCC而不是miR-206介导的KCs M1极化激活。为了排除这种可能性，我们分析了miR-206注射前后荷瘤的AKT/Ras小鼠的M1/M2 KCs(治疗模型)。再次，kc特异性表达的miR-206驱动AKT/Ras小鼠肝脏中kc的M2-to-M1转换(图3 c, D，在线补充图5)．M1/M2 KCs的整体变化促使我们探索TME炎症的一般变化。AKT/Ras小鼠肿瘤中抗炎标记基因表达增加，促炎基因水平降低(在线补充图6A,B)．相反，miR-206逆转了AKT/Ras的作用(在线补充图6A,B)．这些结果与之前的报道一致，AKT信号通路抑制促炎，促进抗炎反应。21kc特异性表达的miR-206也能正常化AKT/Ras小鼠中升高的细胞内氧化应激(在线补充图6C)．

    miR-206 attenuated M2 polarisation of KCs in AKT/Ras mice. (A and B) Immunostaining of iNOS, CD206 and CLEC4F (KC-specific marker) and the ratios of M1 or M2 KCs in livers of AKT/Ras mice injected with pT3-CD68p-scramble (n=6, 5 w.p.i.) or pT3-CD68p-miR-206 mice (n=6, 5 w.p.i.). (C and D) Immunostaining of iNOS, CD206 and CLEC4F and the ratios of M1 or M2 KCs in livers of AKT/Ras (n=6, 3 w.p.i.), AKT/Ras/MC-CD68p-scramble (n=6, 7 w.p.i.) and AKT/Ras/MC-CD68p-miR-206 (n=6, 7 w.p.i.) mice. Data represent mean±SEM. **P< 0.01 and NS (figure 3A–B: Mann-Whitney U test; figure 3C–D: two-way analysis of variance test). Scale bar: figure 3A and C: 10 μm; figure 3B and D: 20 μm. KCs, Kupffer cells; NS, no significance; w.p.i., weeks postinjection of AKT/Ras.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    miR-206可减弱AKT/Ras小鼠中KCs的M2极化。(A和B)注入pT3-CD68p-scramble (n= 6,5 w.p.i.)或pT3-CD68p-miR-206小鼠(n= 6,5 w.p.i.)的AKT/Ras小鼠肝脏中iNOS、CD206和CLEC4F (kc特异性标记物)的免疫染色和M1或M2 KCs的比值。(C和D) AKT/Ras (n= 6,3 w.p.i.)、AKT/Ras/MC-CD68p-scramble (n= 6,7 w.p.i.)和AKT/Ras/MC-CD68p-miR-206 (n= 6,7 w.p.i.)小鼠肝脏中iNOS、CD206和CLEC4F的免疫染色和M1或M2 KCs的比值。数据表示的意思是±SEM。**P< 0.01, NS(图3A-B: Mann-Whitney U检验;图3C-D:方差检验双向分析)。比例尺:图3A和C: 10 μm;图3B和D: 20 μm。枯氏细胞;;NS,没有意义; w.p.i., weeks postinjection of AKT/Ras.

    机制上，kc特异性表达的miR-206显著诱导编码M1标记基因的表达，包括CCL2、iNOS、环氧合酶2 (COX-2)、TNFα和IL-6在kc而不是肝细胞中的表达(图4一，在线补充图7A)．在AKT/Ras/miR-206小鼠中，这些细胞因子的血清水平也显著升高(图4 b)．相反，在AKT/Ras/miR-206小鼠中，M2标记基因的mRNA水平及其血清水平显著降低(在线补充图7B,C)．CCL2的表达在暴露于包括IL-6和TNFα在内的炎症刺激时被触发。22同时上调CCL2、TNFα和IL-6证实了miR-206在诱导KCs M1极化中的作用。CCL2以其驱动CD8趋化的能力而闻名+T细胞和调节性T细胞(treg)通过CCR2 (C-C基序趋化因子受体2)。23也有报道称CCL2在HCC中吸引treg。24出乎意料的是，我们的数据库挖掘发现，与邻近正常组织相比，CCL2在HCC、结肠癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌和直肠腺癌中的表达明显降低(图4 c)．此外，低水平的CCL2而且CCR2预测TCGA数据库中HCC患者生存率较低(在线补充图8A-C)．在HCC患者中观察到miR-206与CCL2、TNFα以及CTL标记物呈正相关(在线补充图8D,E)．这些发现使我们推测CCL2-CCR2轴可能吸引CD8+T细胞。的确，miR-206增加了肝脏CD8+T细胞和ctl (图4 d, E，在线补充图9A-D)和促进CD8聚合+AKT/Ras/miR-206小鼠中接近KCs的T细胞(预防和治疗模型)(图4 d, E，在线补充图9E,F)．总之，miR-206促进了KCs的M1极化和CD8的肝招募+T细胞。

    miR-206 promoted hepatic recruitment of CD8+ T cells by driving CCL2 production. (A) mRNA levels of M1 marker genes in KCs of AKT/Ras/scramble (n=6, 5 w.p.i.) and AKT/Ras/miR-206 (n=6, 5 w.p.i.) mouse cohorts. (B) Serum levels of TNFα, IL-6 and CCL2 in two groups of mice. (C) mRNA levels of CCL2 in HCC, colon cancer (COAT), breast cancer (BRCA), lung adenocarcinoma (LUAD), lung squamous cell carcinoma (LUSC) and rectum adenocarcinoma (READ) in the TCGA database (T: tumour; N: normal livers). Expression levels were shown as Log2 (TPM+1). (D) Immunostaining of CD8, CLEC4F and the numbers of CD8+ cells per 1000 liver cells in two group of mice. (E) Immunostaining of CD8 and CLEC4F and the numbers of CD8+ cells per 1000 liver cells in AKT/Ras (n=6, 3 w.p.i.), AKT/Ras/MC-CD68p-scramble (n=6, 7 w.p.i.) and AKT/Ras/ MC-CD68p-miR-206 (n=6, 7 w.p.i.). Data represent mean±SEM. *P<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 (figure 4A, B D: Mann-Whitney U test; figure 4C: two-tailed Student’s t-test; figure 4E: two-way analysis of variance test). Scale bar: 100 μm. HCC, hepatocellular carcinoma; KCs, Kupffer cells; TPM, transcripts per million; w.p.i., weeks postinjection of AKT/Ras.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    miR-206促进CD8的肝招募+通过驱动CCL2的产生。(A) AKT/Ras/scramble (n= 6,5 w.p.i.)和AKT/Ras/miR-206 (n= 6,5 w.p.i.)小鼠组KCs中M1标记基因的mRNA水平。(B)两组小鼠血清TNFα、IL-6和CCL2水平。(C) mRNA水平CCL2TCGA数据库中肝癌、结肠癌(COAT)、乳腺癌(BRCA)、肺腺癌(LUAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC)和直肠腺癌(READ)的相关研究(T:肿瘤;护士:正常肝脏)。表达水平为Log2 (TPM+1)。(D) CD8、CLEC4F及CD8数目的免疫染色+在两组小鼠中每1000个肝细胞中有1个细胞。(E) CD8和CLEC4F免疫染色及CD8数目+AKT/Ras (n= 6,3 w.p.i.)， AKT/Ras/MC-CD68p-scramble (n= 6,7 w.p.i.)和AKT/Ras/ MC-CD68p-miR-206 (n= 6,7 w.p.i.)中的每1000个肝细胞。数据表示的意思是±SEM。*P<0.05， ** P< 0.01， *** P< 0.001(图4A, B D: Mann-Whitney U检验;图4C:双尾学生t检验;图4E:双向方差分析检验)。比例尺:100 μm。肝癌,肝细胞癌;枯氏细胞;;TPM，每百万人抄本数;注射AKT/Ras数周后。

    MiR-206驱动人类和小鼠巨噬细胞M1极化

    我们接下来对miR-206进行功能增益，以促进小鼠RAW264.7和人类THP-1巨噬细胞的M1极化。在RAW264.7和THP-1细胞中过表达miR-206可增强M1标记物的诱导，其诱导水平可提高2.0倍至21倍(图5 a, C)，但显著降低了M2标记的mRNA水平(在线补充图10)．流式细胞术证实miR-206导致iNOS阳性RAW264.7和THP-1细胞增加5倍(图5 b, D)．miR-206共同促进了人和小鼠巨噬细胞的M1极化。

    miR-206 triggered M1 polarisation of both human and mouse macrophages. (A and C) mRNA levels of M1 marker genes in RAW264.7 and THP-1 cells transfected with pT3-CD68p-miR-206 (miR-206) or pT3-CD68p-scramble (control). (B and D) Flow cytometry analysis of iNOS+ cells in RAW264.7 and THP-1 cells transfected with pT3-CD68p-miR-206 or pT3-CD68p-scramble. Data represent mean±SEM. **P<0.01 (figure 5: two-tailed Student’s t-test).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    miR-206触发了人和小鼠巨噬细胞的M1极化。(A和C)转染pT3-CD68p-miR-206 (miR-206)或pT3-CD68p-scramble(对照)的RAW264.7和THP-1细胞中M1标记基因的mRNA水平。(B、D) iNOS的流式细胞术分析+转染pT3-CD68p-miR-206或pt3 - cd68p scramble的RAW264.7细胞和THP-1细胞。数据表示的意思是±SEM。**P<0.01(图5:双尾Student 's t检验)。

    KLF4介导miR-206促进巨噬细胞M1极化的作用

    mirna抑制其靶标的表达。然而,mir - 206调节Ccl2;。因此，我们推测miR-206促进了Ccl2通过双重抑制机制，miR-206促进转录Ccl2通过靶向转录阻遏子Ccl2．我们首先尝试识别在巨噬细胞中特异性表达的miR-206靶点。结合数据库挖掘肝细胞和巨噬细胞单细胞测序和生物信息学预测(在线补充表3)，我们确定了在巨噬细胞中特异性表达的miR-206的七个潜在靶点(在线补充表4)．在miR-206的潜在靶点中，KLF4是唯一编码转录抑制因子的基因，可以通过破坏NF-κB的能力来调节巨噬细胞极化。25多个M1标记基因的启动子含有NF-κB结合位点。26因此，我们推测miR-206通过直接靶向KLF4-NF-κB轴促进了CCL2的产生，从而触发了KCs的M1极化。miR-206结合位点在Klf4被保存在人和老鼠之间(图6)．这两个Klf4而且Ccl2与肝细胞相比，主要表达于KCs (图6 b)．RAW264.7细胞中miR-206的过表达显著下降Klf4但增加Ccl2（图6 c)．荧光素酶检测证实miR-206直接结合于细胞的3 ' utrKlf4在小鼠和人类巨噬细胞中(图6 d，在线补充图11A,B)．KLF4影响NF-κB位点共激活因子的招募。25因此，我们推断KLF4削弱了增强NF-κB (p65)转录活性的辅因子的招募。事实上，p65的过表达驱动了RAW264.7细胞中M1标记的表达，而额外的处理Klf4抵消p65的促进作用(图6 e)．

    KLF4 mediated the role of miR-206 in promoting M1 polarisation of macrophages. (A) Graphic representation of the conserved miR-206 binding motif within the 3’UTR of Klf4. Complementary sequence to the seed region of miR-206 within the 3’UTR of Klf4 is conserved between human and mouse (highlighted in green). (B) mRNA levels of Klf4 and Ccl2 in hepatocytes and KCs isolated from wild-type FVB/NJ mice. (C) mRNA levels of Klf4 and Ccl2 in RAW264.7 cells transfected with pT3-CD68p-miR-206 or pT3-CD68p-scramble (control). (D) Luciferase activities of the reporter constructs containing either wild-type or mutated 3’UTR of mouse Klf4 after transfection of pT3-CD68p-scramble (control) or pT3-CD68p-miR-206. (E) mRNA levels of M1 maker genes in RAW264.7 Cells transfected with pT3-EF1α (control), pT3-p65 (p65) or a combination of pT3-Klf4 and pT3-p65 (p65+KLF4). (F) Protein levels of KLF4 and CCL2 in three groups of RAW264.7 cells transfected with pT3-CD68p-scramble, pT3-CD68p-miR-206 or a combination of pT3-CD68p-miR-206 and a sgRNA designed to ablate the binding site within the 3’UTR of Klf4. (G) mRNA levels of M1 marker genes in three groups of RAW264.7 cells. (H) Levels of iNOS, COX-2, TNFα and CCL2 in cell lysates of three groups of RAW264.7 cells. (I–J) Immunostaining of iNOS and the ratios of iNOS+ cells in three groups of RAW264.7 cells. Data represent mean±SEM. *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 and NS (figure 6B–D: two-tailed Student’s t-test; figure 6E–J: two-way analysis of variance test). COX-2, cyclooxygenase 2; KCs, Kupffer cells; NS, no significance.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    KLF4介导了miR-206促进巨噬细胞M1极化的作用。(A) 3'UTR内保守的miR-206结合基序的图形表示Klf4．与miR-206的种子区在3'UTR内的互补序列Klf4保存在人和鼠标之间(用绿色突出显示)。(B) mRNA水平Klf4而且Ccl2从野生型FVB/NJ小鼠分离出的肝细胞和KCs。(C) mRNA水平Klf4而且Ccl2在转染pT3-CD68p-miR-206或pt3 - cd68p scramble的RAW264.7细胞中(对照)。(D)含有野生型或突变3'UTR小鼠的报告结构的荧光素酶活性Klf4转染pt3 - cd68p scramble(对照)或pT3-CD68p-miR-206后。(E)转染pT3-EF1α(对照)、pT3-p65 (p65)或pT3-Klf4和pT3-p65 (p65+KLF4)组合的RAW264.7细胞中M1制造者基因的mRNA水平。(F)转染pT3-CD68p-scramble、pT3-CD68p-miR-206或pT3-CD68p-miR-206和sgRNA的3'UTR内消融结合位点的三组RAW264.7细胞中KLF4和CCL2蛋白水平Klf4．(G)三组RAW264.7细胞M1标记基因mRNA水平。(H)三组RAW264.7细胞裂解液中iNOS、COX-2、TNFα和CCL2的水平。(I-J) iNOS的免疫染色及iNOS的比值+在三组RAW264.7细胞中，数据表示的意思是±SEM。*P<0.05， ** P< 0.01， *** P< 0.001, NS(图6B-D:双尾Student 's t检验;图6E-J:方差检验双向分析)。cox - 2环氧酶2;枯氏细胞;;NS,没有意义。

    为了确定KLF4是否对miR-206诱导M1极化至关重要，我们采用基因组编辑的方法来消融miR-206在的3'UTR内的结合位点Klf4．这样的设计削弱了miR-206抑制表达的能力Klf4RAW264.7细胞中(图6 f)．MiR-206驱动RAW264.7细胞的M1极化，而消融MiR-206结合位点则取消了MiR-206的作用(图6 g-j，在线补充图11C)．破坏miR-206和KLF4也削弱了miR-206诱导THP-1细胞M1极化的能力(在线补充图11D,E)．此外，KLF4-NFκB轴在AKT/Ras小鼠的KCs中被抑制，而该信号在AKT/Ras/miR-206小鼠的KCs中被恢复(在线补充图12)．总之，miR-206通过调节KLF4-NF-κB轴，触发巨噬细胞M1极化。

    MiR-206增强CD8的扩张和迁移+T细胞通过CCL2/CCR2轴

    高水平的CCL2或CCR2与改善HCC的生存期密切相关(在线补充图8B,C)．CCL2与CD8的吸收有关+T细胞。27 28因此，我们假设miR-206通过促进CCL2/CCR2轴，招募CD8+T细胞。接下来我们共培养CD8+T细胞与mir -206教育的RAW264.7细胞。MiR-206驱动CCL2的分泌和CD8的扩增+T细胞(图7 a, B)．CD69是CD8的早期激活标志+T细胞。CD154允许CD8+促进T细胞自身膨胀。29事实上,CD8+T细胞显示高表达Cd69而且Cd154的（图7 c)．MiR-206通过促进巨噬细胞中CCL2的产生，增强CD8的迁移+T细胞(图7 d)．

    miR-206 enhanced chemotaxis of CD8+ T cells by activating the CCL2/CCR2 axis. (A) Levels of CCL2 in the medium of RAW264.7 cells that were transfected with pT3-CD68p-scramble (control), pT3-CD68p-miR-206 (miR-206) or a combination of pT3-CD68p-miR-206 and the sgRNA to ablate the binding site of miR-206 within the 3’UTR of Klf4 (miR-206+sgRNA). (B) Proliferation of CD8+ T cells cocultured with three groups of RAW264.7 cells. (C) mRNA levels of genes encoding CD69 and CD154 in CD8+ T cells that were cocultured with the three groups of RAW264.7 cells. (D) The migration ratios of CD8+ T cells cocultured with three groups of RAW264.7 cells. (E) The migration ratios of CD8+ T cells cocultured with three groups of RAW264.7 cells treated with pT3-CD68p-scramble (control), pT3-CD68p-miR-206 or a combination of pT3-CD68p-miR-206 and CCL2 mAb. CCL2 mAb was used to neutralise CCL2 in the culture medium. (F) The migration ratios of CD8+ T cells cocultured with three groups of RAW264.7 cells treated with pT3-CD68p-scramble (control), pT3-CD68p-miR-206 or a combination of pT3-CD68p-miR-206 and CAS, a CCR2 antagonist. (G) The migration ratios of CD8+ T cells cocultured with KCs isolated from livers of FVB/NJ mice injected with pT3-EF1α (control, n=3, 5 w.p.i.), AKT/Ras/scramble (n=3, 5 w.p.i.) or AKT/Ras/miR-206 (n=3, 5 w.p.i.). (H) The migration ratios of CD8+ T cells cocultured with KCs isolated from livers of AKT/Ras/MC-CD68p-scramble (n=3, 7 w.p.i.) and AKT/Ras/MC-CD68p-miR-206 (n=3, 7 w.p.i.). (I–J) Immunostaining of CD8 and CCL2 in livers of the AKT/Ras models of prevention and treatment. Scale bar: 100 µm. Data represent mean±SEM. *P<0.05; **p<0.01 and NS (figure 7A–G: two-way analysis of variance test. figure 7H: two-tailed Student’s t-test). NS, no significance; KCs, Kupffer cells; w.p.i., weeks postinjection of AKT/Ras.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    miR-206增强CD8的趋化性+T细胞通过激活CCL2/CCR2轴。(A)转染pT3-CD68p-scramble(对照)、pT3-CD68p-miR-206 (miR-206)或pT3-CD68p-miR-206和sgRNA的组合的RAW264.7细胞的培养基中CCL2水平，以消融miR-206在3'UTR内的结合位点Klf4(mir - 206 + sgRNA)。(B) CD8的增殖+T细胞与三组RAW264.7细胞共培养。(C) CD8中编码CD69和CD154基因的mRNA水平+T细胞与三组RAW264.7细胞共培养。(D) CD8的迁移率+T细胞与三组RAW264.7细胞共培养。(E) CD8的迁移率+T细胞与三组经pT3-CD68p-scramble(对照)、pT3-CD68p-miR-206或pT3-CD68p-miR-206和CCL2 mAb组合处理的RAW264.7细胞共培养。用CCL2单抗中和培养基中的CCL2。(F) CD8的迁移率+T细胞与三组经pT3-CD68p-scramble(对照)、pT3-CD68p-miR-206或pT3-CD68p-miR-206和CAS (CCR2拮抗剂)处理的RAW264.7细胞共培养。(G) CD8的迁移率+T细胞与从注射pT3-EF1α(对照，n= 3,5 w.p.i)、AKT/Ras/scramble (n= 3,5 w.p.i)或AKT/Ras/miR-206 (n= 3,5 w.p.i)的FVB/NJ小鼠肝脏分离的KCs共培养。(H) CD8的迁移率+T细胞与分离自AKT/Ras/MC-CD68p-scramble (n= 3,7 w.p.i)和AKT/Ras/MC-CD68p-miR-206肝脏的KCs共培养(n= 3, 7 w.p.i)。(I-J)防治AKT/Ras模型肝脏中CD8和CCL2的免疫染色。比例尺:100µm。数据表示的意思是±SEM。* P < 0.05;**p<0.01, NS(图7A-G:方差检验双向分析。图7H:双尾学生t检验)。NS,没有意义;枯氏细胞;;注射AKT/Ras数周后。

    接下来，我们确定了miR-206激活M1极化以及随后CD8的扩展和迁移是否需要KLF4-CCL2-CCR2轴的每个成分+T细胞。3'UTR内miR-206结合位点的消融Klf4削弱了miR-206在RAW264.7细胞中诱导CCL2分泌的能力(图7)．这种破坏也限制了miR-206促进CD8扩张和迁移的能力+T细胞(图7罪犯)．CCL2中和和CCR2拮抗削弱了miR-206驱动CD8迁移的能力+T细胞(图7 e, F)，表明CCL2和CCR2都是miR-206招募CD8所必需的+T细胞。3'UTR内miR-206结合位点的消融KLF4也会损害miR-206驱动CD8增殖和迁移的能力+T细胞(在线补充图13)．AKT/Ras小鼠的KCs驱动CD8迁移的能力下降+在AKT/Ras/miR-206小鼠分离的KCs中，这种损失得到了恢复(图7 g H)．在AKT/Ras/miR-206小鼠中，CCL2的出现与CD8呈正相关+T细胞(包括预防和治疗模型)(图7 i j)．

    破坏miR-206和Klf4部分损害了miR-206预防HCC的能力

    我们着手建立KLF4-CCL2轴是miR-206阻止HCC发展的下游效应子在活的有机体内．为此，我们采用了基于aav8的CRISPR/Cas9技术来消融miR-206在3'UTR内的结合位点Klf4AKT/Ras小鼠中KCs基因组的变化。消融miR-206结合位点削弱了miR-206的抑制能力Klf4，促进CCL2的生产(图8 a, B)．表型上，破坏了miR-206和Klf4与miR-206完全阻止的HCC恢复生长相关(图8 c)．机制上，miR-206的HDI促进了KCs的M2-to-M1切换和CD8的肝招募+同时破坏miR-206和Klf4M1 KCs和CD8的水平+T细胞与杂联处理小鼠的T细胞(图8 d - i)．综上所述，KLF4-CCL2轴至少部分介导了miR-206驱动KCs的M2-to-M1极化和CD8的肝招募的能力+T细胞对AKT/Ras小鼠肝癌的抑制作用。

    Disrupting the interaction between miR-206 and Klf4 offset the role of miR-206 in preventing HCC development. (A and B) mRNA levels of Klf4 in KCs and serum CCL2 in AKT/Ras mice injected with pT3-CD68-scramble (n=6, 8 w.p.i.), pT3-CD68-miR-206 (n=6, 8 w.p.i.) or a combination of pT3-CD68-miR-206 and the sgRNA (n=6, 8 w.p.i.). (C) Macroscopic and microscopic (H&E) appearance of livers of three groups of mice. (D–G) Ratios of M1 or M2 KCs in livers of three groups of mice. (H–I) Ratios of CTLs (CD8+GrB+) to CD8+ T cells in livers of three groups of mice. Data represent mean±SEM. **P<0.01 (figure 8: two-way analysis of variance test). HCC, hepatocellular carcinoma; KCs, Kupffer cells; w.p.i., weeks postinjection of AKT/Ras.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图8
    图8

    破坏miR-206和Klf4抵消了miR-206在阻止HCC发展中的作用。(A和B) mRNA水平Klf4AKT/Ras小鼠注射pT3-CD68-scramble (n= 6,8 w.p.i.)， pT3-CD68-miR-206 (n= 6,8 w.p.i.)或pT3-CD68-miR-206和sgRNA的组合(n= 6,8 w.p.i.)。(C)三组小鼠肝脏的宏观和显微镜(H&E)外观。(D-G)三组小鼠肝脏中M1或M2 KCs比值。ctl (CD8)的(H-I)比值+伽马线暴+) CD8+三组小鼠肝脏中的T细胞。数据表示的意思是±SEM。**P<0.01(图8:双向方差分析检验)。肝癌,肝细胞癌;枯氏细胞;;注射AKT/Ras数周后。

    CD8枯竭+T细胞消除了miR-206阻止HCC发展的能力

    我们假设ctl是miR-206预防HCC的主要下游分子。为了验证这一点，我们耗尽了CD8+AKT/Ras小鼠腹腔注射CD8或IgG1单抗(对照)图9)．MiR-206抑制Klf4，促进CCL2的产生，驱动KCs的M1极化，并完全防止AKT/Ras小鼠的HCC (图9中)．相比之下，虽然miR-206恢复了肝脏M1 KCs (图9 c)， CD8耗竭+T细胞抵消了miR-206抑制HCC发展的能力(图9 e)．总之,CD8+T细胞是miR-206抑制HCC的下游参与者。

    Depletion of CD8+ T cells impaired the ability of miR-206 to prevent HCC. (A) Levels of CD8+ T cells in livers of AKT/Ras treated with scramble (n=6, 7 w.p.i.), miR-206 and IgG1 mAb (n=6, 7 w.p.i.), or a combination of miR-206 and CD8 mAb (n=6, 7 w.p.i.). (B) mRNA levels of Klf4 in KCs and serum CCL2 in three groups of mice. (C and D) Ratios of M1 or M2 KCs in livers of three groups of mice. (E) Macroscopic and microscopic (H&E) appearance of livers in three groups of mice. Data represent mean±SEM. **P<0.01, ***p<0.001 and NS (figure 9: two-way analysis of variance test). HCC, hepatocellular carcinoma; KCs, Kupffer cells; mAb, monoclonal antibody; NS, no significance; w.p.i., weeks postinjection of AKT/Ras.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图9
    图9

    CD8枯竭+T细胞破坏了miR-206预防HCC的能力。(A) CD8水平+AKT/Ras肝脏中的T细胞分别用scramble (n= 6,7 w.p.i.)、miR-206和IgG1单抗(n= 6,7 w.p.i.)或miR-206和CD8单抗的组合(n= 6,7 w.p.i.)处理。(B) mRNA水平Klf4三组小鼠KCs和血清CCL2含量的变化。(C、D)三组小鼠肝脏中M1、M2 KCs比值。(E)三组小鼠肝脏的宏观和显微镜(H&E)外观。数据表示的意思是±SEM。**P<0.01， *** P< 0.001, NS(图9:方差检验双向分析)。肝癌,肝细胞癌;枯氏细胞;;马伯,单克隆抗体;NS,没有意义;注射AKT/Ras数周后。

    讨论

    免疫治疗的效果受限于HCC的一些独特特性，最显著的是在健康和患病状态下肝脏的固有耐受性。11在这项研究中，我们发现了HCC的典型免疫特性，通过KCs的M2极化破坏CD8的肝脏富集+T细胞。相反，miR-206驱动了KCs的M1极化和CD8的肝招募+T细胞，因此显示出对HCC的强大治疗潜力。

    首先，我们观察到AKT信号的激活与AKT/Ras小鼠中KCs的M2极化有关。到目前为止，巨噬细胞极化的控制主要归功于一小组因子的作用，包括NF-κB, AP-1, STATs和PPARs。25自从mirna被发现以来，30.它们与人类癌症有关，特别是miR-206。17 18 31 32关于miR-206，它在抑制多种癌症增殖方面的作用已经得到了很好的研究。17日31日32然而，在HCC中，以hdi为基础的效率在活的有机体内转染miR-206的肝细胞仅占30% (在线补充图3C)．因此，认为AKT/Ras/miR-206对肝癌的完全预防是由恶性肝细胞增殖受损引起的结论是不合理的。肿瘤细胞的免疫逃逸是肝细胞癌的一个典型特征。3.事实上，mir -206介导的KCs M1极化，通过驱动ctl的肝招募，至少在一定程度上促进了AKT/Ras小鼠中肝癌的抑制。然而，不能排除miR-206通过调节TME内的其他信号级联来抑制HCC的可能性。

    第二个关键观察结果是miR-206促进CD8的迁移和扩张+T细胞通过驱动KCs产生CCL2。虽然CCL2杂乱地与CCR1-5结合，但它与CCR2的结合具有特别高的亲和力。33CCL2/CCR2信号在调节巨噬细胞募集和极化方面的作用最为人所知。23除了吸引M2巨噬细胞外，CCL2/CCR2轴也被证明吸引treg。34据报道，CCL2在HCC患者中升高，拮抗CCL2/CCR2轴会损害HCC的生长。35然而，我们的TCGA数据库分析显示，CCL2减少预示着HCC患者生存率较低(在线补充图8A,B)．值得注意的是，TCGA数据库中其他类型的人类癌症中CCL2的水平也有所下降(图4 c)．在肉瘤和肺癌患者中，高表达CCL2与改善预后和更好的总生存率相关。36 37据报道，CCR2/CCL2轴与ctl向癌细胞迁移的增加有关。38基于这些发现，我们推测在HCC的起始和早期阶段，KCs的M1极化激活了CCL2/CCR2信号，从而促进了CD8的迁移+T细胞转化成肝癌。然而，在晚期HCC中，循环treg水平明显升高，treg表面的CCR2迅速消耗CCL2，这降低了CCL2与CD8上的CCR2相互作用的机会+T细胞。因此，miR-206(至少部分)通过CCL2/CCR2轴促进CD8的吸引+T细胞。

    免疫抑制是HCC的典型特征。尽管miR-206对ctl的肝招募有很强的驱动作用，但不能基于miR-206对HCC的强抑制作用，排除其对免疫抑制的抑制作用。此外，CCR2也在treg中表达，这促使我们评估miR-206对肝脏treg的影响。没想到的是，肝脏CD4降低了+在AKT/Ras小鼠中观察到T细胞和升高的treg，而miR-206的kc特异性表达使其在AKT/Ras小鼠中的水平正常化(包括预防和治疗模型)(在线补充图14A-F)．FOXP3本身不足以使treg发挥抑制功能。39IL-10的增加是Treg功能和分化所必需的。40我们推测miR-206通过抑制IL-10的产生，为Treg分化创造了不利的环境。IL-10主要在KCs和肝细胞中表达(在线补充图15A)．miR-206的kc特异性表达降低了il - 10AKT/Ras小鼠中KCs和血清IL-10水平升高(在线补充图15B,C)．这一观察结果表明，miR-206除了促进CTL的招募外，还抑制了肝脏免疫抑制，这可能在一定程度上有助于AKT/Ras小鼠肝癌的完全预防。

    Cenicriviroc (CVC)是一种CCR2/5拮抗剂，对NASH/纤维化显示出有希望的结果。41接下来我们在AKT/Ras小鼠中测定了CVC对肝癌的影响。出乎意料的是，CVC治疗略微加速了AKT/Ras小鼠肝癌的生长(在线补充图16)．我们还需要进一步研究优化AKT/Ras和CVC的剂量，使AKT/Ras小鼠能够长期存活，从而研究CVC在AKT/Ras小鼠肝癌发展中的促进作用。促炎KCs可以通过消除癌细胞来抑制早期HCC的肿瘤发生，也可以维持慢性炎症状态。M1 KCs的阈值和及时终止KCs的M1极化对于维持其抑制HCC的能力，同时避免过度炎症是至关重要的。我们推测，miR-206通过微调M1/M2平衡和TME，在没有过度肝脏炎症的情况下完全预防了HCC。

    最后，通过mir -206介导的KCs M1极化完全预防HCC强调了miRNAs在维持免疫稳态中的作用。它们现在已经被确定为自然发生的非编码rna，可以调节代谢和功能通路。42-44miRNAs的这一特性使我们能够推测它们以一种高度精确的方式调节免疫反应，从而避免过度和场外效应。总之，AKT/Ras信号的激活触发了KCs的M2极化，进而削弱了ctl对肿瘤部位的浸润。MiR-206驱动了KCs的M1极化和CCL2的产生。CCL2/CCR2信号的激活促进了CD8的肝招募+T细胞和完全预防肝癌。基于miR-206增强免疫监测的独特特性，它是一种潜在的新型肝癌免疫治疗剂。

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    伦理批准

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    补充材料

    脚注

    • 贡献者NL对数据整理、分析、调查、方法和数据解释做出了贡献，并撰写了原始草案。XW对研究方法和数据收集作出了贡献。CJS为支持方法学以及对初稿的审查和编辑作出了贡献。GS发起并协调研究，获得资金，编辑稿件并提交稿件。

    • 资金这项工作部分得到了美国癌症协会和GS的研究学者Grant (ISG-16-210-01-RMC)的支持。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 来源和同行评审不是委托;外部同行评议。

    • 补充材料本内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅仅是那些作者(s)和不被BMJ认可。BMJ放弃从放在内容上的任何依赖产生的所有责任和责任。如果内容包含任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且不对翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏负责。