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基础科学的最新进展
胃肠疾病中的类器官:从实验模型到临床转化
  1. 克劳迪娅·哈1，2，
  2. Beate赢家2，3.，4，
  3. 马库斯·F·纽莱特1，2，
  4. 塞笛厄斯·S·斯塔彭贝克5
  1. 1医学部(一)，Friedrich-Alexander-University埃，埃朗根、德国
  2. 2德国免疫治疗中心，Friedrich-Alexander-Universitat埃，埃朗根、德国
  3. 3.干细胞生物学系“，，Friedrich-Alexander-University埃，埃朗根、德国
  4. 4埃尔兰根罕见病中心，埃尔兰根大学医院，弗里德里希亚历山大大学Erlangen-Nürnberg (FAU)，埃朗根、德国
  5. 5炎症和免疫科，克利夫兰诊所的勒纳研究所，克利夫兰，俄亥俄州美国
  1. 对应到Claudia博士Günther，德国拜仁埃尔兰根埃尔兰根大学医院;C.Guenther在{}uk-erlangen.de；Thaddeus S Stappenbeck博士;stappet在}{ccf.org

摘要

我们正在进入一个医学时代，在这个时代，我们将从患者身上获得越来越复杂的数据，以确定正确的诊断、预测结果和指导治疗。我们预测最有价值的数据将由在时间和空间上都高度动态的系统产生。三维(3D)类器官有望成为各种胃肠道(GI)疾病的高价值系统。在实验室中，类器官已经成为强大的系统，可以模拟分子和细胞过程，以非常详细的方式协调自然和病理生理的人体组织形成。临床前研究已经令人印象深刻地证明，通过利用患者来源的材料，这些培养皿中的器官可以用来模拟免疫、肿瘤、代谢或感染性GI疾病。现在，技术突破使得研究细胞通信和健康和疾病中器官间交叉信号的分子机制成为可能，包括沿着肠道-大脑轴或肠道-肝脏轴的通信。尽管在从胃肠道的各个部分培养经典的3D类器官方面取得了相当大的成功，但在开发这些系统以最好地帮助患者方面仍然存在一些挑战。芯片上的器官、工程仿生系统(包括工程类器官)、微制造、生物打印和增强的严谨性和可重复性等新平台将为组织工程以及再生和个性化医疗开辟更好的途径。这篇综述将重点介绍一些已经建立的方法，以及一些令人兴奋的关于胃肠病学领域类器官的新观点。目前，这一领域正准备向前发展，并以新型诊断和治疗的形式影响许多目前难以治疗的胃肠道疾病。

  • 干细胞
  • 肠干细胞
  • 胃肠道病理
  • 胃肠生理
http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名非商业(CC BY-NC 4.0)许可证发布，该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此基础上进行构建，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是正确引用原始作品，给予适当的荣誉，任何更改都已注明，并且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2021-326560

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    简介

    器官细胞培养，也称为类器官，是一种强大的实验系统，为基础生物学的许多学科做出了重要贡献，并导致了许多医学应用(图1)。几乎每个器官系统都有大量的例子，包括中枢/肠神经系统，以及呼吸、感觉、内分泌和生殖系统。1 - 6这些领域的研究人员已经定制了实验设置，使用这些类器官来模拟器官生理学的许多方面，包括细胞间的通信，宿主-微生物的相互作用和器官间的相互作用。基于这些基本研究问题，类器官已被用于模拟人体病理，包括炎症、感染、代谢和肿瘤疾病等方面。这些见解为再生和个性化医疗开辟了新的途径。虽然当今类器官技术的主要领域主要是基于2000年初最初的里程碑式出版物，但基于干细胞的器官培养的想法并不新鲜，可以追溯到1970/1980年。箱1)。

    箱1

    干细胞培养和类器官的历史

    临床前模型系统，如永生化细胞系和动物模型，极大地促进了我们对细胞信号通路的理解，并为包括胃肠道炎症、感染和癌症在内的病理疾病确定新的治疗靶点。然而，尽管小鼠模型与人类基因相似，但显示出一些限制，例如它们无法准确模拟人类疾病表型的各个方面。细胞系经常被转化或在基因上永垂不朽。因此，它们不能反映重要的上皮功能，例如极化、屏障形成和细胞分化。然而，除了这些缺点之外，以前关于器官发育和生理学的实验工作为进化出更生理和更可靠的临床前体外系统开辟了新的途径。因此，干细胞生物学的研究已经发现了如何控制干细胞干性的改进方法，包括确定自我更新和沿定义的组织谱系分化的过程。在这项工作的支持下，再生医学领域的科学成就提供了对组织损伤如何由分化为受影响器官内一种或多种所需成熟细胞类型的游离干细胞修复的理解。212

    干细胞研究领域受到了在胚胎发生过程中自然形成器官的原始组织的启发。这些研究为理解器官发生过程中的模式事件和信号传递提供了重要的信息和工具。其他领域的研究人员，如皮肤角质形成细胞，几十年前就已经确定了体外培养所需的因素。213在消化病学领域，这被证明更具挑战性。几十年来，体外培养的关键因素一直难以捉摸。2005年对R-spondin1的作用进行的体内研究表明，这可能是体外实验中缺失的因素。214事实上，这正是佐藤和克利夫斯在2009年建立的缺失因素。215他们证明，小鼠小肠多能器官特异性成体干细胞(ASCs)在细胞外基质中培养时，具有自组织成上皮3D结构的内在能力，这种基质被补充了不同有丝分裂原、形态原和细胞因子组合的培养基所覆盖，这些组合指导体细胞干细胞的自我更新和有组织分化(多能性，可以产生多种细胞类型)。215 216汤姆森及其同事的开创性工作确定了胚胎干细胞(ESCs)的来源。他们从捐赠胚胎的囊胚中分离和培养人类胚胎干细胞(hESC)，这些囊胚最初是为体外受精而产生的。217在这个阶段，细胞不再是全能的(能够产生一个完整的有机体，包括胚胎外组织)，而是多能的(能够产生体内基本上所有的组织)。从这些研究中产生的许多hESC系仍然存在于干细胞群落中(https://grants.nih.gov/stem_cells/registry/current.htm)。第一个被称为诱导多能干细胞(iPSC)的重编程细胞是在诺贝尔奖得主山中伸弥的实验室中通过逆转录病毒表达四种转录因子产生的Oct3/4, Sox2, Klf4而且c-myc(或者Nanog)，启动它们的连续表达。218詹姆斯·威尔斯(James Wells)跟进了佐井正木及其同事在hESC上的工作219结果表明，人诱导多能干细胞可分化为后肠内胚层，并进一步发育为成熟的肠道结构。asc来源和ipsc来源的3D结构在基因和蛋白质表达、代谢功能、微观组织结构以及细胞组成方面都与原生器官相似。我们现在称这些结构为“类器官”，它定义了类似器官或器官组成部分的3D组织或结构。类器官应符合以下标准:培养的细胞应(我)保留被模拟器官的身分，(2)中含有存在于器官本身的祖细胞和末端分化细胞类型，(3)模仿各器官的主要功能及(4)根据与器官本身相同的内在组织原则进行自我组织。有趣的是，ASC/ESC水下2D培养的出现可以追溯到1970/1980年。213 220然而，直到21世纪初，这些干细胞必须在生长失活的喂食细胞上培养。2212009年的突破性工作现在允许长期的，基于干细胞的有机培养，这有可能克服以前的限制，因此代表了传统体外细胞培养系统的重大进步。

    Organoids, assembly of single cells. The term organoid generally applies to three-dimensional cellular cultures derived from stem cells that resemble components of a complex tissue or organ.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    类器官，单细胞的组装。类器官这个术语通常适用于从类似复杂组织或器官组成部分的干细胞中提取的三维细胞培养物。

    在消化病学的几乎所有领域中，类器官技术在过去十年中显示出大幅增长。越来越多的类器官培养方法已经开发出来，包括培养人类和小鼠成体干细胞(ASCs)以及人类多能干细胞(PSC)的协议。这两个系统都能产生类似食道、胃或小肠和大肠的肠道类器官(图2)。对已建立的腔内器官方案的进一步修改使类器官的发展扩展到包括肝-胰脏-胆道系统的组成部分:肝脏(分离为包含肝细胞或胆道上皮细胞的类器官)，7 8胆囊9和胰腺。10 11所有这些组织的一个共同主题是ASCs仅由上皮细胞组成，并代表其分离的组织，而PSCs由上皮细胞和间充质细胞(MSCs)的混合物组成，并通过实验进行发育和分化，以模拟胃肠道的特定区域。

    The GI organoid culture system. GI organoids can be derived from PSCs and ASCs. PSC-derived organoids are established by directed differentiation of either ESCs or iPSCs (generated from fibroblast of skin biopsies) towards the endoderm. ASCs of epithelial origin can be isolated from tissue biopsies or surgical resections. They can be embedded in ECM and grown from either single cells or crypts that give rise to organoids that contain crypt-like structures. Adaption of the culture medium can foster the development of spheroids that are enriched for stem cells.222 Depending on the culture condition both PSCs and ASCs can give rise to three-dimensional organ-like structures of the hepatic-biliary-pancreatic tract and digestive tract containing gastric, small intestinal and colonic organoids. Representative pictures of organoid cultures are derived from the authors (unpublished, scale bars: 50 µm). ASCs, adult stem cells; ESCs, embryonic stem cells; ECM, extracellular matrices; PSCs, pluripotent stem cells.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    胃肠道类器官培养系统。胃肠道类器官可来源于PSCs和ASCs。psc来源的类器官是通过ESCs或iPSCs(来自皮肤活检的成纤维细胞)向内胚层定向分化建立的。上皮来源的ASCs可以从组织活检或手术切除中分离出来。它们可以嵌入ECM，从单细胞或隐窝中生长，产生含有隐窝样结构的类器官。对培养基的适应可以培养出富含干细胞的球形细胞。222根据培养条件的不同，PSCs和ASCs都能形成含胃、小肠和结肠类器官的肝、胆、胰、消化道三维类器官结构。类器官培养的代表性图片来自作者(未发表，比例尺:50µm)。ASCs，成体干细胞;ESCs，胚胎干细胞;ECM，细胞外基质;多能干细胞。

    2017年，类器官被《自然》(Nature)杂志命名为“年度方法”(organoids)。Nat方法2017年)，展示了他们在所有学科领域的巨大潜力。如今，3D器官培养是临床医生和医学科学家在GI研究领域的一种中心实验工具，包括类器官在内的出版物数量不断增加。在这篇综述中，我们讨论了GI类器官从实验模型到临床翻译的潜在应用，包括该领域的最先进技术和当前进展，如新型复杂培养系统，最后评估了当前必须克服的挑战。

    胃肠道类器官:不同粘膜上皮细胞簇的集合

    ASCs是所有原生GI类器官培养的初始来源。这些干细胞是组织常驻，保留其在胃肠道起源部位的特征，以及在宿主驻留期间发生的任何遗传或表观遗传突变。这些干细胞可以从任何年龄的宿主中分离出来，包括胎儿干细胞。12 - 14相反，PSCs要么是胚胎起源(胚胎干细胞(ESC))，要么是重新编程的体细胞诱导PSCs (iPSCs) (图3)。为了从PSCs中产生类器官，必须及时诱导选择的发育程序，使其能够允许分化为组织特异性类器官。ASCs和PSCs，根据科学问题及其临床前/临床应用范围的不同，都有各自的优缺点。毫无疑问，快速的速度和遗传及表观遗传的稳定性反映了ASC的主要优势，它们对遗传操作的易感性，细胞组成和器官的可获得性，没有直接接触ASC清楚地强调了PSC的好处(框2)。主要限制包括缺乏微环境的细胞成分，特别是在asc来源的类器官中，它们的异质性由各种协议驱动，特别是用于PSC的分化。因此，研究人员在开始使用类器官之前应该考虑这一点。

    框2

    GI类器官作为人类生物学和医学的模型系统:

    关键信息和可用技术

    关键因素

    • asc来源的类器官:可从内镜活检、手术切除(胃、223空肠的,198回肠,224结肠,224胆37 186 225和胰186 226瀑样)。

    • ipsc衍生的类器官(可以来自任何体细胞，例如成纤维细胞或血细胞)，包括在伦理同意的情况下患有家族性或复杂遗传疾病的患者。它们可以向肠道分化，39胰腺duct-like,227肝33 228和胃223瀑样)。

    • 如果遵循特定国家的规定(例如，威威尔国际干细胞库)，则可获得esc衍生的类器官。

    • ECM水凝胶:由Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞(各种商品名称)或其他生物/合成基质分泌的基底膜。

    • 培养基:基础培养基+生长因子(重组或细胞系(可用于R-Spondin(家族成员1-3)，Wnt-3a和Noggin)，或可用的现成产品。

    平移的好处

    • 衍生组织的遗传和表观遗传特征在类器官(ASCs)中是稳定的。28-32

    • 易于获取和快速培养(ASC)。

    • 稳健性:一旦建立，扩展和长期培养可以进行大规模的基因组筛选和药物筛选。229 - 232

    • 生物库(PSC/ASC)中有几种已建立的培养物。

    • ASC/PSC可以使用基因组编辑(如CRISPR/Cas9)进行基因修饰。37 186 233-240

    • 精准医疗(ASC, PSC)。

    可用的技术

    • 根尖向外(极性反转，允许进入根尖但不允许进入基部)。114 241

    • 平面培养:单层培养，细胞贴壁于平板(易于操作，可到达根尖但不能到达基底)，241 - 243气液界面(上皮损伤反应，宿主-微生物相互作用，允许同时进入顶端和基底)。121 241 243

    • 显微注射(需要技术设备，宿主-微生物相互作用)。118 120 144

    • 芯片上的肠道(更复杂，包括几种特殊的细胞类型，能够集成机械生理参数和厌氧菌)。134 244 - 247

    • 原位类器官移植。234 248 - 250

    • Microbe-organoid cocultures。97 118 242

    • 有机-免疫细胞共培养。5 48 49 251 252

    • 内向瀑样。63 253

    • Vascularised瀑样。71 74

    • 类器官偏向于特定分化(肠内分泌细胞，254杯状细胞,255伤口相关上皮细胞，256microfold细胞257)。

    Overview of organoid derivation. GI organoids can be either derived from ASCs (left panel) or PSCs (right panel). Left panel: tissue-resident stem cells can be isolated from GI biopsies collected during colonoscopy, gastroscopy or surgery. Following an ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) or enzymatic digestion, either single cells or tissue fragments (crypt structures or ductal fragments) are embedded into an ECM and covered with a defined culture medium supplemented with a combination of different mitogens, morphogens and cytokines that guide the self-renewal and organised differentiation of somatic stem cells. Beside ASCs, organoids can be generated from cancer stem cells (isolated from tumour biopsies) and are referred to as tumouroids. Right panel: GI organoids can be also derived from PSCs (ESCs and iPSCs) in a stepwise differentiation process that recapitulates the signalling programme active during development. In an initial step, PSCs follow a guided differentiation towards an endodermal fate by exposure to Activin A. This is followed by the differentiation towards foregut, midgut/hindgut endoderm depending on the targeted tissue (foregut for gastric, hepatic, biliary or pancreatic organoids; midgut/hindgut for intestinal organoids). These precursor spheroids can be further instructed towards defined tissues and organs depending on different growth factors that allow proper terminal differentiation. ASCs, adult stem cells; CRC, colorectal cancer; ECM, extracellular matrices; ESCs, embryonic stem cells; IBD, inflammatory bowel disease; iPSCs, induced pluripotent stem cells.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    类器官衍生概述。GI类器官可以来源于ASCs(左图)或PSCs(右图)。左图:组织驻留干细胞可以从结肠镜检查、胃镜检查或手术期间收集的GI活检中分离出来。在乙二胺四乙酸(EDTA)或酶消化后，将单细胞或组织片段(隐窝结构或导管片段)嵌入ECM，并覆盖特定的培养基，补充不同的有丝分裂原、形态原和细胞因子的组合，指导体细胞干细胞的自我更新和有组织的分化。除了ASCs，类器官可以从癌症干细胞(从肿瘤活检中分离出来)中产生，被称为类肿瘤细胞。右图:在逐步分化过程中，GI类器官也可以从PSCs (ESCs和iPSCs)衍生，这概括了发育过程中活跃的信号传导程序。在最初的步骤中，PSCs通过暴露于激活素a，遵循引导分化走向内胚层命运。随后，根据目标组织向前肠、中肠/后肠内胚层分化(前肠为胃、肝、胆或胰腺类器官;肠类器官的中肠/后肠)。这些前体球状体可以根据不同的生长因子进一步导向确定的组织和器官，允许适当的末端分化。ASCs，成体干细胞; CRC, colorectal cancer; ECM, extracellular matrices; ESCs, embryonic stem cells; IBD, inflammatory bowel disease; iPSCs, induced pluripotent stem cells.

    在胃肠道中，上皮性ASCs是多能细胞，在发育过程中被修改，以持续和永久地产生肠道特定位置功能所需的分化细胞。干细胞是活跃细胞(即增殖细胞)和不活跃细胞的混合种群，它们相互依赖，可以相互转化。15这些干细胞被安置在特定的位置:例如，在肠隐窝的底部、胃腺的中部和胆道的尚未确定的位置。16 - 19根据组织来源和定义的培养基的修饰，ASCs能够分化为二维(2D)和三维结构，其中包含极化的、特化的上皮细胞类型，与分离组织的对应物高度相似。小鼠肠道类器官的初始高分辨率单细胞转录组学支持这一说法，即类器官反映了体内上皮细胞，包括较少的细胞群，如肠内分泌细胞。20使用患者来源的类器官的早期研究表明，有证据表明其上皮特征在体内保留，并且随着时间的推移，这些特征似乎是稳定的。7 24 25最近的一项研究支持了这一观点，通过比较肝内、胆囊、胆总管和胰管来源，证明了人类胆管上皮的区域差异;这些区域差异在相应的体外来源类器官中维持。26这一特征与沿肠的asc来源的类器官相似。27此外，asc衍生的类器官可以在体外保存与炎症暴露相关的表观遗传修饰。一些研究表明，与从非IBD受试者中分离的类器官相比，从IBD患者炎症粘膜组织中建立的类器官在基因表达和DNA甲基化模式上保留了差异。28 - 30此外，来自胎儿、儿科或成人小肠和大肠的肠上皮类器官的全基因组DNA甲基化谱显示了稳定的肠段特异性谱，与相应的原始肠上皮源的谱非常相似。31以类似的方式，在胃肠化生类器官中观察到启动子超甲基化模式与在体内观察到的相似。32展望未来，这些类器官系统将允许功能测试这种遗传/表观遗传模式及其对生物学的影响。此外，使用患者体内控制类器官将是开发针对各种疾病的个性化药物方法的强大方法。

    多能干细胞包括两种不同类型的ESCs和iPSCs。两者的特点都是可塑性和自我更新的能力。一般来说，psc衍生的类器官模型需要一个复杂、耗时和高度特异性的逐步发育协议，该协议从向内胚层的引导分化开始。接下来是向前肠、中肠或后肠内胚层分化，根据允许生长因子的添加，可进一步指示向特定组织和器官分化。在精确的剂量和时间点添加确定的有丝分裂原、形态原和细胞因子是绝对关键的，不仅可以成功地生成3D结构，而且还可以强烈影响发育中的类器官的组织特异性33-39．人PSCs在模拟涉及肝细胞和间充质干细胞的肝脏疾病方面特别有趣。例如，大内等开发了一种可重复的方法来生成多细胞人肝类器官，包括肝细胞样细胞、库普弗样细胞和星状细胞。40这些类器官能够概括脂肪性肝炎的进展特征，包括脂肪变性、炎症和纤维化。40类似地，在微孔芯片上培养的患者源性诱导多能干细胞成功分化为胰腺导管室，包括几种成熟的导管样细胞群和几种非导管细胞类型。41PSCs向组织内所有世系分化的潜力是该系统的主要优势。然而，psc衍生类器官仍然存在挑战。由于暴露于诱导重编程的因素所引起的基因组不稳定以及相当过早的表型，它们在临床应用方面的应用有限。然而，尽管如此，最近的一项研究发现，ipsc衍生的人类肠道类器官显示出与从人类活检中获得的培养物相似的ASC特性。42另一项研究表明，来自溃疡性结肠炎患者的ipscs衍生肠类器官概括了结肠炎活动的特征。43这是相当令人惊讶的，因为这些用来产生iPSCs的成纤维细胞经历了重编程，这必须影响这些细胞的表观遗传组成。人类iPSC技术与基因编辑的最新发展相结合，使基于iPSC的平台成为精准医疗的强大新工具。44 45

    多细胞类器官:组织微环境建模

    胃肠道粘膜的上皮表面是高度动态的结构，处理来自管腔(包括微生物组和摄入的物质)和下层固有层(包括肠神经、免疫和血管系统)的双向信号。这种双向交流对器官生理有深刻的影响，涉及但不限于肠道和肝脏疾病的病理生理。慢性肠道和肝脏疾病通常是多因素的，除了肠道微生物群之外，还包括不同细胞间的功能障碍或通信失调。5 46因此，GI类器官模型的挑战是以一种能揭示特定疾病的新生物学或新见解的方式结合这些其他因素。对于ASCs，类器官完全缺乏体内微环境，PSCs含有MSCs而不含腔内因子。然而，关键的通信发生在上皮细胞和成纤维细胞(及其相关谱系)、各种先天和适应性免疫细胞以及神经系统、胶质系统和血管/淋巴系统细胞之间。此外，在这些体外类器官中，不存在肠道微生物源性产品和代谢物的暴露。因此，该领域开始初步尝试将这些因子和细胞类型整合到PSC/ asc来源的上皮类器官中，从而增加这些培养的复杂性(图4)。目前，ipsc衍生的类器官允许使用专用的分化协议添加基质细胞类型，因此能够研究更复杂的关系。47我们警告说，这方面的工作仍在进行中。目前，对二元交互进行建模在很多情况下都是有用的。提高单细胞分析技术能力(标记细胞的标记物、蛋白质和转录组的流动分选)将是正确分析的关键。我们希望这些实验系统能够变得更加复杂，从中得到的数据将会带来新的假设，这些假设可以在体内系统中得到进一步的验证。

    Organoid coculture applications to increase the complexity of GI organoids, cellular and microbial components can be integrated into organoid cultures. This can be achieved by several protocols. (A) Reversal of the polarity in combination with removal of the ECM results in organoid cultures in which the apical/luminal surface faces towards the medium (Apical-out). (B) 3D-derived submerged monolayers can be grown as a thin monolayer to study the interaction of epithelial cells with environmental factors. (C) This monolayer technique has been expanded to air–liquid interface cultures in which monolayers are plated on transwells. This allows the investigation of the tissue microenvironment by adding defined cell populations (eg, immune cells, fibroblasts, endothelial cells) to the basal side of the epithelium and environmental factors to the apical surface. (D) Microinjections of luminal factors (eg, bacteria, viruses, dietary factors, metabolites) allow the investigation of the effect of environmental elements on epithelial homeostasis without changing architecture or polarity of organoids. (E) The organoid-on-a-chip concept is a more complex culture method in which self-organisation of stem cells can be extrinsically guided by a 3D microstructured scaffold. The advantage of this method is to integrate several cell types and mechano-physiological parameters. Asterisks indicate crypt region; L: lumen; red arrows indicate luminal side; air–liquid interface (C): pictures are derived from Wang et al., Cell 2019,121 Other representative pictures of organoid cultures are derived from the authors (unpublished, scale bars: 50 µm). 3D, three-dimensional; ECM, extracellular matrices.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    类器官共培养应用可以增加GI类器官的复杂性，细胞和微生物成分可以集成到类器官培养中。这可以通过几个协议来实现。(A)极性反转结合ECM的去除导致类器官培养，其中根尖/管腔表面朝向介质(根尖向外)。(B) 3d衍生的淹没单分子层可以培养成薄的单分子层，以研究上皮细胞与环境因素的相互作用。(C)这种单层技术已经扩展到气液界面培养，单层被镀在transwell上。这使得研究组织微环境成为可能，方法是在上皮基侧添加确定的细胞群(如免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞)，在根尖表面添加环境因子。(D)微注射腔内因子(如细菌、病毒、饮食因子、代谢物)可以在不改变类器官结构或极性的情况下研究环境因素对上皮内稳态的影响。(E)芯片上的类器官概念是一种更复杂的培养方法，其中干细胞的自组织可以在3D微结构支架的外部引导下进行。该方法的优点是整合了多种细胞类型和力学生理参数。星号表示隐窝区域; L: lumen; red arrows indicate luminal side; air–liquid interface (C): pictures are derived fromWang等人，Cell2019年,121其他具有代表性的类器官培养图片来自作者(未发表，比例尺:50µm)。3 d三维;ECM，细胞外基质。

    Immune-epithelial相声是器官功能的关键因素，因为这两种细胞间存在直接和功能的相互作用。这种相互作用对于适应性免疫系统的成熟和免疫细胞的激活非常重要，而来自造血室的信号影响上皮功能和周转，特别是在对损伤和感染的反应期间。为了确定新的治疗靶点，更好地理解针对炎症的现有疗法的功能，我们需要更详细地了解这种相互作用的分子和细胞相互作用，以及当这种通信出错时它们的病理生理后果。已经建立了几种与各种类型的免疫细胞(如T淋巴细胞、先天淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞和上皮内淋巴细胞)共培养类器官的方案。5 13 48-56对于转译方法，研究人员依赖于自体免疫细胞，这在一定程度上限制了这些共培养，因为类器官需要一定的时间，直到培养物建立起来并扩展到实验或临床前验证。低温保存外周血淋巴细胞，进一步分离和扩增确定的细胞系，如T细胞或巨噬细胞，是一种广泛使用的解决方案，以克服这些限制。虽然大多数协议包括3D共培养，但其他改进的培养方法包括类器官衍生的单层培养(利用空气-液体界面)53 57)。这些单层培养物包括通常暴露于免疫细胞室细胞的管腔和基底面。因此，特定的科学问题，如研究宿主对肠道病原体的反应或免疫-上皮通信和上皮通信可以得到解决。57

    重要的是，所有类型的细胞都需要含有特定生长因子的特定培养基，这使得在一个实验隔间中找到允许所有细胞存活和功能的因子组合通常是一个挑战。我们预计这些技术障碍将被克服，并将产生一波新的信息。

    神经支配的类器官(上皮-神经相互作用)

    肠神经系统(ENS)强烈影响粘膜免疫和上皮功能，目前被认为是IBD发展和进展的重要因素。58 59此外，ENS功能的破坏可能对肠道和中枢神经系统(CNS)产生双向影响，因为ENS神经元释放的各种神经递质也可以作用于肠上皮细胞(肠-脑轴)。60虽然肠道炎症导致ENS相关的功能改变(蠕动改变、腹痛、痉挛和腹泻)，但ENS对慢性肠道炎症性疾病的功能意义及其对肠上皮的影响机制仍然知之甚少。上皮-神经通信的新兴领域及其在胃肠道疾病中的意义也促进了共培养模型的发展，包括肠类器官和ENS的细胞。61这使得人们对ENS中感觉神经元对肠色素细胞的支配有了新的认识。62目前的模型还利用了可以分化为肠类器官的PSC系统，以及ENS的细胞，如神经嵴细胞(NCCs)。63 - 65与发育中的肠类器官共培养的ncc迁移到间质，分化为神经元和胶质细胞，并表现出神经元活性。63含ens的肠类器官在体内形成了类似于肌肠和粘膜下神经丛的神经胶质结构。类似地，另一项研究开发了一种类器官组装方法，包括肠神经胶质细胞、间充质细胞和上皮细胞前体，均由诱导多能干细胞分化而来。66这些类器官可发育成新的肠段，显示神经支配。63诱导多能干细胞还被成功用于生成含有分化腺体的胃组织。66这些结构被由功能性肠内神经元组成的平滑肌层所包围。

    血管化的类上皮器官

    血管内皮也是胃肠道系统的重要屏障，其渗透性因器官而异。它组织在由内皮细胞、周细胞和肠胶质细胞组成的血管单位中，调节血液供应、营养转运、组织液稳态和免疫细胞转运。67 - 69先前的研究表明，在IBD的背景下，血管和淋巴系统的病理生理作用。70此外，体外生成的类器官移植是再生医学的一种有前途的方法，但需要类器官内的血液供应，以取代功能和血管化的器官。因此，2013年，Hideki Taniguchi小组研究了这一新兴领域，并证明了从ipsc衍生的器官芽移植中产生了血管化和功能性的人类肝脏。71他们发现，特定的ipsc衍生的肝前体具有肝细胞命运，通过概括内源性血管内皮细胞(人脐静脉内皮细胞;HUVECs)和MSCs。有趣的是，肝类器官内的血管在移植到小鼠体内后恢复了功能。这项概念验证研究表明，器官芽移植为研究再生医学提供了一种有前途的新方法。使用类似的方法，胰腺类器官的血管化不仅促进了培养中的功能化，而且极大地提高了移植后的组织存活率。72在这项研究中，作者将人离体胰岛与HUVECs和MSCs结合。这导致了“自凝结”培养的复杂类器官培养。总之，这些研究在治疗性组织移植的背景下特别重要，因为它们清楚地表明，植入前的血管化提供了一种有前途的提高疗效的策略。从iPSCs中产生血管类器官的机会允许有效地将ipsc衍生的细胞系结合到血管化的类器官，为在自体环境中工作开辟了新的途径。73事实上，已经有几次尝试将ipsc来源的内皮细胞引入GI类器官。65 74 75有趣的是，最近的一项研究发现，早期存在于iPSC向肠类器官分化过程中的内皮细胞群随着培养时间的推移而下降。这项研究进一步开发了一种在肠道类器官内扩大和维持内皮细胞群的方法，作为经典血管化类器官模型的替代方法。76

    类器官和间充质室

    肠干和祖细胞在肠类器官内形成，复制和分化成不同的区室，受Wnt、Bmp和其他线索的影响，主要由固有层中的MSCs提供(典型的Wnt由Paneth细胞产生)。77 78因此，asc来源的小鼠肠道类器官培养基的中心因子包括Wnt-3a和R-Spondin3，它们都是典型Wnt信号传递所必需的，以及Noggin，一种BMP激动剂。79最近，在间质中确定了这些基本信号的一些细胞来源。经典的上皮下肌成纤维细胞(semf)，也被称为telocytes，被发现是Wnt和R-Spondin配体以及弥散性BMP激动剂/拮抗剂的重要来源。80 81因此，asc类器官与semf共培养允许在缺乏通常对确保类器官存活至关重要的生长因子的情况下长期培养类器官。82 - 85通过共培养实验，另一组在表型和功能上检测了结肠中的成纤维细胞群，发现体内靠近干细胞的CD90+成纤维细胞表达了关键的干细胞生长因子，如Grem1, Wnt-2b和R-Spondin3。86最近的一项研究表明，成纤维细胞可以分泌含有Wnt和EGF的细胞外囊泡，从而挽救Wnt缺陷或EGF缺陷的类器官生长。87展望未来，随着成纤维细胞和肌成纤维细胞群体的确定，它们在为肠上皮干细胞提供基本因子方面的作用可以部分通过与ASC类器官共培养来评估。

    癌症相关成纤维细胞(CAFs)主要来源于正常的成纤维细胞，在癌症的进展中起着关键作用。然而，由于缺乏临床前细胞模型，对癌细胞- caf相互作用的机制理解受到限制。最近，一项有趣的研究证明了原发性肝肿瘤源性类器官与CAFs的共培养。88他们通过细胞-细胞接触和局部分泌因子发现了双向信号:CAFs促进肿瘤类器官生长，癌细胞调节CAF生理。他们进一步证明，肿瘤类器官对抗癌药物的反应强烈依赖于CAFs。类似地，Öhlund的一项研究等建立了人胰腺导管腺癌(PDAC)类器官和胰腺星状细胞(PaSCs)的共培养，肌成纤维细胞样细胞位于胰腺外分泌区。作者总结了PDAC与PaSCs从静息状态转变为激活的、产生基质的成纤维细胞的结缔组织形成反应。89他们进一步证明，PaSCs分泌支持人类PDAC类器官生长的因子。89 90Wnt被确定为PaSCs释放的关键元素，对于驱动Wnt-非产生PDAC亚型的类器官生长至关重要。使用相同的方法，另一项研究发现TGFβ和IL-1作为肿瘤分泌配体，促进肌成纤维细胞的异质性。91更进一步蔡康永等通过将人胰腺癌类器官与匹配的基质细胞和免疫细胞共培养，建立肿瘤微环境的多细胞型有机共培养模型。52在这些模型中观察到CAFs的激活和肿瘤依赖的淋巴细胞浸润。这种三维肿瘤微环境模型系统可能对t细胞浸润背景下的检查点抑制剂等免疫疗法的评估有价值。

    微生物-宿主界面

    黏膜微环境的一个非常重要的组成部分是肠道菌群，它可以在肠道中直接与上皮细胞交流(通过直接附着或感染)，也可以通过分泌代谢物以及细菌膜囊泡中含有的蛋白质和核酸间接与肠道和肝脏交流。92 - 96因此，肠道微生物及其衍生因子通过调节先天和适应性免疫、代谢和组织稳态与人类健康和疾病有关。

    有几个肠类器官直接感染的优秀例子，这些例子创建了确定感染机制和开发新疗法的基本模型。这些例子包括以前肠道中不可培养的病毒(如诺如病毒)，但也形成了一个系统来产生寄生虫的整个生命周期，只能在实验中在犊牛体内扩展。97 98asc衍生的和ipsc衍生的类器官都与各种共生细菌和致病菌共同培养，99寄生虫,One hundred.以及SARS-CoV-2等病毒。101 - 103通过将微生物微量注射到类器官腔内，利用单层或倒置的类器官模拟相互作用的生理部位，分析了宿主-微生物的通信。2020年，Hans Clevers演示了如何使用类器官来更好地了解肠道微生物群在结直肠癌(CRC)中的作用。104通过将人体肠道类器官暴露于基因毒性pks+大肠杆菌通过5个多月的反复腔内注射，他们鉴定出CRC中也存在明显的突变特征。本研究中产生的类器官数据表明，潜在的突变过程直接来自于过去肠道上皮暴露于携带pks致病性岛的细菌。除细菌外，通过胃肠道进入宿主的病毒也与肠道和肠外炎症有关。在这方面，现在已经确定GI途径在SARS-CoV-2感染中发挥着重要作用。周的研究等首次建立了蝙蝠肠道类器官，以更好地了解SARS-CoV-2的感染和传播途径。102他们可以证明SARS-CoV-2不仅可以有效地感染蝙蝠类器官，还可以有效地感染人类肠道类器官。此外，他们在人肠道类器官中观察到SARS-CoV-2的强劲复制，这表明人肠道可能是SARS-CoV-2的传播途径。与这些结果一致，另一项研究表明，SARS-CoV-2可有效感染胎儿、儿童和成人的胃类器官，进一步支持这种新型病毒的粪-口传播。105这些只是最近的研究的例子，这些研究可视化了微生物-类器官共培养的力量，以更好地了解肠道微生物如何导致肠道炎症。关于这些共培养的广谱将超出本综述的范围，但在专门的综述中有深入的描述。106

    使用人体肠道内容物的非靶向代谢组学和体内模型系统生成的粪便代谢物筛选已经广泛进行，GI类器官确实定义了可以对这些微生物产物做出反应的细胞类型。最近的一些例子(许多论文)包括琥珀酸促进凝灰岩细胞分化，二肽醛从sporogenes梭状芽胞杆菌可以增强内质网应激，以及影响肠上皮干细胞以刺激再生或负面影响潘氏细胞功能的次生胆汁酸。107 - 110这些筛选有可能发现基础生物学的许多新途径。挑战在于确定哪些影响会转化为体内的整个生物体。

    下一代肠类器官

    上皮类器官提供了一个非常有吸引力的平台，以研究原始上皮细胞的设置，非常类似于体内的情况。基于过去几年在不同临床前和临床学科的实验成功和广泛分布，已经开发了几种新的培养体系。因此，类器官可以集成到微流控设备(芯片上的器官系统)中，微工程系统不仅允许更复杂的流控培养系统。为了研究其与环境因素以及底层粘膜免疫系统的相互作用，人们尝试改变这些类器官的结构，如改变其形态(由内至外)或保持其平面2D培养。

    上皮极性及其负面影响:同一枚硬币的两面

    类器官在形成正常的根尖连接复合物和维持这种上皮极性方面的优势，在涉及具体的科学问题时也造成了劣势。嵌入在Matrigel中的类器官显示一个向内封闭的顶端(腔内)表面和一个面向类器官外部与细胞外基质相互作用的基底外侧表面。因此，添加到培养基中的因子主要与基底外侧表面相互作用。然而，许多应用需要接触到根尖/管腔表面，因为这代表了不断暴露于环境因素(如膳食营养素、细菌代谢物和肠道微生物)的粘膜表面。这可能与营养研究特别相关，以调查病毒和细菌病原体的入侵部位和细胞趋向性，并进行药物筛选和毒性试验。102 111 - 113为了解决这一问题，人们进行了多次尝试，包括反转极性或进入管腔一侧(图4，框2)。有限公司等开发了一种方案(类器官极性反转方法)来控制悬浮培养中的类器官极性，导致类器官种群的顶端表面向外向培养基(顶端向外的类器官)。114尖出类器官(图4一)可用于更好地概括宿主-微生物相互作用(例如，感染SARS-CoV-2或益生菌的作用)，但也可能用于评估治疗方法，因为许多治疗方法是口服的，因此必须通过上皮细胞的根尖表面进入人体。115 - 117除了改变极性外，将微生物、微生物代谢物或其他环境因素微注射到类器官腔内是一种广泛使用的实验设置104 118 119（图4 b)。在这个实验环境中，类器官保持囊状形态，允许耐氧性低的细菌存活，但同时防止细菌过度生长。虽然将微生物微量注射到胃/肠道类器官的腔内，可以在最生理条件下研究宿主-微生物的相互作用，但这一方案的标准化和可扩展性很难实现。威廉森最近的作品等开发了一种自动化的高通量计算机驱动的微注射系统，用于将货物输送到类器官腔内和高含量采样。120虽然这显然代表了研究胃肠道腔内生理学的下一代体外方法，但它也需要复杂的技术设备，而这些设备并不广泛可用。因此，最近有几次尝试通过生成最初生长在薄基质层上的3d衍生单分子层来研究根尖反应97 118 121（图4 c)。通过在转井上生长单层膜来产生气液界面(ALI;图4 d)。将二维单层的顶端表面暴露于气液界面，可以建立具有高度分化上皮细胞的长期自组织二维单层121．这些单层协议的一个巨大优势是上皮细胞对环境因素的均匀暴露以及增强的可扩展性。值得注意的是，除了宿主-微生物通信之外，该模型还可以重现体内发生的上皮改变的“稳态-损伤-再生”周期，因此也可用于研究伤口愈合和粘膜愈合。121成功解决腔内可达性问题的其他替代方案更加复杂，需要广泛的技术专长，主要包括其他学科的贡献。

    工程瀑样

    微工程和组织工程目前是一个非常引人注目的领域，可以克服令人兴奋的类器官技术的关键限制，并与提高的再现性、实验控制和更高的通量筛选相关。122 - 126这些修饰对临床翻译研究具有很高的价值。工程仿生平台将使研究人员能够模拟体内细胞的特征，而这些特征是通过既定的静态培养方法无法获得的。工程技术包括微制造、生物打印和激光切割。通过微工程支架植入人工边界，可能代表了与经典类器官培养相比的巨大优势，因为众所周知，形状引导的形态发生是发育过程中的一个重要步骤。127 - 129在这种情况下，已经进行了几次尝试，使用合成的图章来标记合成的基质或水凝胶，从而产生高度组织的管状脊骨，可以在其上播种类器官来源的细胞。123 127 130 131

    重要的是，这些模型系统允许暴露根尖表面，同时保持三维结构，因此为研究宿主-微生物相互作用提供了非常有吸引力的模型。控制细胞组装并克服其随机发展的其他即将到来的技术包括生物打印方法，开发用于预先建立其与微流体设备的兼容性，通常被称为芯片上的器官132（图4 e)。这些微流体细胞装置包含灌注室，其中活细胞以反映组织水平和器官水平生理的方式排列。133最初，它们被用来模拟信号分子的梯度，但随后它们被用于在类器官发育过程中更好地控制细胞命运模式。因此，当组织工程肠道连接到外部泵系统时，所产生的微流体微型肠道允许去除与体内情况相当的死亡细胞。这与延长存活数周有关，也可以与微生物相互作用，以模拟宿主-微生物相互作用，而不会导致微生物过度生长。130 134这可能是可能的，通过控制上层的氧气浓度，流过厌氧细菌。我们预计，芯片上的肠道将在未来促进许多临床前和临床研究，包括可重复性、实验控制和高通量读出。

    GI类器官用于疾病建模、药物发现和个性化医疗

    如上所述，类器官技术，包括经典的类器官模型和最近的改进，在医学研究和新治疗方法的开发中具有很大的应用前景(图5)。在过去的10年里，广泛的基于类器官的疾病模型已经开发出来。这包括复制炎症和代谢疾病的模型，135 - 137感染和癌症。138-140

    Applications of organoids from patients can be used for basic research to better understand organ development and to dissect the relevant intracellular pathways that control homeostasis and might be altered during organ dysfunction. These patient-derived organoids can be further used to preclinically screen for novel therapies and to predict response to drugs as well as for regenerative medicine (precision medicine). Another preclinical application includes disease modelling to better understand the mechanisms underlying GI diseases (including inflammatory, infectious, metabolic, inheritable genetic and neoplastic disorders) as well as the biobanking of patient-derived-organoids and -tumouroids.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    来自患者的类器官的应用可用于基础研究，以更好地了解器官发育和解剖相关的细胞内通路，这些通路控制内稳态，并可能在器官功能障碍期间被改变。这些患者来源的类器官可进一步用于临床前筛选新疗法，并预测对药物的反应以及再生医学(精准医学)。另一个临床前应用包括疾病建模，以更好地理解GI疾病(包括炎症、感染、代谢、遗传和肿瘤性疾病)的机制，以及患者来源的类器官和类肿瘤的生物库。

    疾病建模和药物发现

    2020年，Toshiro Sato团队利用类器官分析溃疡性结肠炎上皮细胞的体细胞突变，以破译慢性炎症微环境如何塑造遗传景观。141他们生成了76个克隆人类结肠类器官，包括55个来自溃疡性结肠炎患者的培养物，其中26个患有结肠炎相关瘤变，16个非ibd个体。这些类器官队列进行了全基因组测序，以捕获克隆水平的突变。他们在炎症上皮细胞中发现了一种独特的体细胞突变模式，包括与IL-17信号传导相关的多个基因的体细胞突变。这项研究的结果得到了同年发表在《自然》杂志上的另一项研究的支持，142证明类器官是人类胃肠道疾病基因组和功能研究的可靠疾病模型。Gerald Schwank团队通过捕获单个野生型和APC(腺瘤-息肉病-大肠杆菌)突变人类肠道类器官中的sgRNA整合，进行了池库CRISPR筛选。143通过优化条件，使类器官中的全基因组CRISPR筛选成为可能，他们确定并验证了介导转化生长因子β (TGFβ)抗性的肿瘤抑制基因。这项原理证明研究强调了该系统的强大功能，可以应用于各种分析，包括不同的类器官类型，以促进初级3D组织模型中的生物发现。来自人或小鼠胃窦或体腺的胃类器官(PSCs)已被建立，不仅有助于阐明胃发育过程，而且有助于研究几种人类胃疾病的发病机制。幽门螺杆菌感染与消化性溃疡风险增加10%-20%和胃癌风险增加1%-2%有关。与以前的体外培养系统相比，胃类器官现在允许研究细胞类型的特异性反应，包括胃上皮细胞，如粘液腺细胞或顶叶细胞，这些细胞不能通过经典方案培养。144 145这使得第一次区分和比较个体细胞群的基因特征幽门螺杆菌感染。例如，Sina Bartfeld可以证明，与位于胃腺的主要细胞系的类器官相比，主要由腺体的细胞系组成的人类胃类器官产生更高水平的活化B细胞(NF-κB)靶基因的核因子kappa轻链增强子。145除了Clevers实验室的初步工作之外，还有一些其他的研究可以证明幽门螺旋杆菌感染，如附着、定植、NF-κB激活、CagA-c-MET相互作用和宿主细胞增殖增加可以在胃类器官中得到总结。38 146 - 148Lo及其同事最近的另一项研究使用基于crispr的基因组工程来调查迄今为止未知的致癌后果的常见突变如何影响人类细胞。149通过利用CRISPR/ cas9介导的基因敲除，他们可以证明这种缺乏ARID1A,这是人类癌症中最常见的分子畸变之一，在人类野生型胃类器官中是不能容忍的，但在TP53缺失的情况下是可以容忍的。这项研究以一种非常聪明的实验方法展示了类器官的力量，可以更好地破译未知基因突变的功能。类器官可以进一步用于揭示损伤相关上皮再生的分子机制。121 150基于类器官的研究不仅有助于更好地捕捉损伤修复周期，而且进一步发现小分子表观遗传调节剂在类器官损伤时促进肠道上皮的再生，与体内相当。最近的另一项研究发现，类器官中缺乏gasdermin家族成员gasdermin B (GSDMB)的上皮表达与上皮恢复/修复中断有关。151Gasdermins主要通过其在孔隙形成过程中的功能在焦亡中发挥关键作用。Rana的作品等现在发现，与其他gasdermins相比，GSDMB并不本质上参与焦上，但似乎在IBD期间上皮屏障功能的恢复和炎症的解决中发挥作用。除了这些遗传研究，类器官可用于了解暴露后的细胞类型特异性反应，以确定治疗性。例如，临床前体外实验发现，JAK抑制剂通过抑制ifn诱导的上皮细胞死亡来部分发挥抗炎功能。152 153除了这种治疗方法，本研究还证明了皮质类固醇可以增强上皮屏障功能，这得到了另一项转化研究的支持。152 154类器官还可以进一步用于筛选针对病毒感染的药物。155例如，与当前大流行有关的治疗SARS-CoV-2病毒感染的药物最近在psc来源的肠类器官中进行了临床预评估。156具体而言，瑞德西韦可有效抑制类器官感染，恢复类器官活力。157另一项最近的研究使用肺和结肠类器官，并确定伊马替尼、霉酚酸和盐酸阿那卡因是阻止SARS-CoV-2进入的有效疗法。158除了临床前评估和药物鉴定外，人们对使用类器官作为益生菌临床前测试的新工具越来越感兴趣。159 160用益生菌预培养类器官大肠杆菌菌株Nissle对病原菌诱导的上皮细胞毒性有抑制作用大肠杆菌菌株。160

    癌症研究和精准医疗

    癌症是一个重大的健康问题，也是全球死亡的主要原因。靶向药物等新型治疗策略不仅为提高患者的整体生存期提供了更好的机会，而且为个性化癌症治疗提供了新的方法。精准医疗当然需要能够预测个别患者反应的体外模型系统。癌症干细胞是肿瘤内具有自我更新、分化能力的细胞亚群，因此也可以产生类器官，即所谓的患者来源的类器官(PDOs)或类肿瘤。2015年，Hans Clevers使用CRC患者的类器官生物库(包括来自肿瘤和邻近正常组织的类器官)进行了原理证明研究，并筛选了目前在临床或临床试验中使用的癌症治疗方法。161他可以证明，这项技术适用于检测与先前临床观察相匹配的基因-药物关联，从而可能填补个性化治疗设计的空白。深入的OMIC分析进一步表明，PDOs不仅再现了体细胞拷贝数的改变，而且还在CRC中发现了包括典型抑制基因突变和激活突变在内的突变谱。后来，健康和肿瘤pdo的个性化蛋白质组资料在翻译后水平上证实了这些结果。162一年后，Toshiro Sato小组扩大了这一初步研究，并发表了一个结直肠肿瘤类器官库，包括55个不同的肿瘤类器官克隆，包括罕见亚型和匹配的原发性和转移性类器官。163他可以证明，不依赖生态位的生长主要与腺瘤-癌的转变有关。在最近的一项研究中，作者从转移性胃肠道癌患者中建立了pdo生物库，这些患者之前参加过I期或II期临床试验。164这使得作者能够比较患者的临床反应与类器官药物反应。事实上，它们可以证明癌症类器官的药物反应如何与临床观察到的反应相匹配，从而加强它们作为药物筛选平台的价值。165基于这些初步研究的成功和在个性化医疗中的应用范围，随后又有几项针对各种不同肿瘤实体的额外研究。所有研究都令人印象深刻地表明，PDOs概括了其原发肿瘤的突变景观，并且可以从包括结直肠癌在内的各自GI癌症实体中产生，161 163 166-170胃癌,32 164 171-175食道癌,176 - 179胰腺癌,10 90 180 181胃肠胰腺神经内分泌肿瘤，182还有肝癌。183 - 185对于精准医学来说，特别有趣的是，在PDO培养过程中，癌症的分子亚型保持不变，这表明培养条件不会促进某些亚型的生长。一些临床研究可以进一步证明PDOs可以从针活检中获得，证明少量单细胞足以进行扩展的体外分析。184最后，有机会从GI组织中培养3D多细胞结构，可用于生长和比较来自人类患者的癌前细胞和肿瘤细胞。131 186

    先前的研究令人印象深刻地表明，从患者肿瘤材料中提取的pdo不仅扩展了我们对人类癌症的分子理解，而且在个性化医疗方面具有巨大潜力。187 188因此，包括结直肠癌、晚期直肠癌、转移性结直肠癌、食管癌、包括食管腺癌和食管鳞状细胞癌在内的胃癌、PDAC、胃肠胰腺神经内分泌肿瘤、包括肝细胞癌、胆管细胞癌在内的肝癌在内的各种胃肠道癌症在内的类器官生物库数量正在迅速增加。10 32 90 161 163-166 171 173 183 189-192这些生物库包括起源组织和相应类器官系的详细特征和分子分析，临床表型和患者记录的描述。由于PDOs概括了患者和疾病特异性的特征，因此已经报道了几种针对此类生物库的药物筛选方法。180在Gerald Schwank团队最近的一项研究中，他们使用来自胰腺癌(PDAC)患者的pdo来证明类器官可以用于精确肿瘤学，不仅可以进行药物筛选，还可以通过基因组编辑来识别新的药物再利用候选。180与之前的研究一致，他们观察到PDOs表型的高度多样性，这与原发性PDAC肿瘤的体内形态密切相关。为了在这些类器官系中实现高通量化合物筛选，他们建立了一个全自动药物筛选平台，并比较了以前药物筛选试验中使用的不同方法。与之前观察到的相似，他们强调不需要Matrigel圆顶来实现药物敏感性，最终使用了Matrigel补充的介质方案。这种液体覆盖培养系统具有更强的可扩展性，可以筛选更多的化合物，因此可能是一种易于关联且具有成本效益的传统基质穹窿培养的替代品。根据该方案，他们对1172种fda批准的化合物进行了自动药物再利用筛选，并确定了26种有效杀死PDAC类器官的化合物，包括目前批准用于其他癌症类型的19种化疗药物。虽然这只是一个例子，但其他几个研究已经使用PDO生物库进行药物筛选方法，实验设计略有变化。171 183 189

    再生医学和类器官移植

    类器官不仅是临床前药物筛选的新兴工具，而且在再生医学中作为可移植组织和器官治疗的来源具有巨大潜力。从患者来源的ASC或iPSCs生成的自体体外组织比传统的器官移植具有优势，后者在可用性方面受到限制，并且需要免疫抑制。包括基因工程在内的干细胞技术的最新进展，现在也提供了将类器官转化为其他细胞类型的机会。例如，1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，其特征是免疫系统破坏了产生胰岛素的胰腺β细胞，因此需要特别替换这种类型的细胞。有趣的是，在肠道类器官中抑制转录因子Foxo1促进了胰岛素阳性细胞的产生，这些细胞表达了成熟胰腺β细胞的所有标记，从而为移植研究和发育提供了丰富的细胞来源。193同样，在肝脏中创建复杂的结构，最终用于移植，将需要多种上皮细胞类型。这里的第一步是在胆管细胞命运中转分化含肝细胞的类器官。14这只是两个以gi为中心的例子，展示了可用于器官/细胞移植的广泛的不同类器官种群。早在2012年，asc来源的结肠类器官就被原位移植到小鼠结肠中，在那里它们能够再生受损的上皮细胞。194这些移植的供体细胞形成了功能和组织学上正常的隐窝，能够自我更新。同样，胎儿肠球有助于体内上皮的再生。12后来，人类肠道类器官也被移植并重新填充直肠上皮。有趣的是，这些细胞在几个月内保持了自我更新和多种分化能力。195与此相一致的是，Toshiro Sato小组的一项研究将人回肠类器官移植到小鼠结肠中，从而用小肠上皮细胞取代了原生的结肠上皮细胞。正如预期的那样，基于先前的发育研究，这些类器官保持了它们的区域特征，并产生了一个功能性小肠化结肠。196 197在一种更有意义的方法中，一项概念验证研究使用儿科患者的生物材料构建了自体空肠粘膜移植。198将小肠类器官移植到脱细胞人肠基质上(作为生物支架)可靠地重建移植物。这些植入物显示了空肠生理功能的几个方面，并在移植到肾囊后存活了2周。作为替代，类器官被植入肠系膜。199

    除了肠道类器官，之前的一些研究表明，人类肝脏类器官在受损的小鼠肝脏上功能性地定植。7日14Sampaziotis和Vallier的一项研究进一步证明，在免疫受损小鼠的肾包膜下移植后，人胆管类器官可自组织成胆管样管，表达胆道标志物。200当嵌入胶原管支架时，它们可以稳定地弥合小鼠胆道的手术缺陷。在转译方法中，他们进一步证实了这些胆管细胞类器官能够在人类肝脏移植后修复胆管。201总之，这些数据为使用GI类器官进行再生提供了原理证明，并为治疗短肠综合征等各种疾病提供了可行的策略196或其他肠道疾病。198

    目前的限制和未来的方向

    胃肠道上皮类器官及其相关平台能够模拟消化道不同区域的三维结构、细胞类型组成和功能的特定方面，同时保持简化和易于访问的细胞培养模型的优势。这使得类器官在基础组织/器官生物学以及疾病建模和临床应用方面都具有很高的吸引力。尽管这一领域的热情很高，而且似乎处于指数级增长阶段，但类器官仍然是一个潜在的革命性模型系统。未来发展仍面临挑战(图6)。最重要的挑战之一，特别是对于asc衍生的类器官，是无法轻松地模拟多器官病理。类器官可以令人印象深刻地模仿某些组织或器官的关键特征，但不能取代体内存在的细胞多样性，因此不能反映人体组织有机体的复杂性。因此，为解决这些限制，包括iPSC的共培养和混合文化进行了一些尝试。35 202 203比如武ishi等使用ipsc衍生的肝细胞、胆道上皮细胞和血管内皮细胞的混合物生物制造人类肝脏。204他们通过融合来自ipsc的前肠和后肠球体来改造人肝-胆-胰类器官。这促进了结构域分化为分离的器官，完成了发育相关的内陷和上皮分支。33 35这些组装体(通过空间组织多种细胞类型而产生的类器官)将有可能为组织功能提供新的见解，并将使我们能够研究肝脏、胰腺和胃肠道在还原系统中的通信。这里的工程解决方案将是这些系统的关键组成部分。跨领域的合作可能是克服这一障碍的关键因素。另一个限制是有时为类器官生长而购买的极其复杂的细胞外基质(ECM)的未定义效果。批次之间的差异以及商业可用基质之间的差异需要得到更好的控制。特别是对于转化方法，尚不清楚这些ecm和ecm的变异如何以及是否会影响临床前药物或遗传筛选，因此是生产临床级类器官的主要挑战。这一点尤其相关，因为目前类器官培养的金标准是从Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤中纯化的基底膜基质(BMM)。因此，已经做出了各种努力来取代这种BMM的GI类器官。这包括来自脱细胞肠道或肝脏组织的天然ecm，205 - 207透明质酸类弹性蛋白材料，208collagen-nanocellulose水凝胶,209藻酸盐,210以及用于ipsc衍生类器官的合成水凝胶。211对于所有这些不同的系统，随着时间的推移评估它们如何影响类器官培养，并包括“良好的生产规范”，以允许转化为临床，这将是极其重要的。另一个变化的来源是用于个别实验的介质。目前，我们还没有方法可以快速、灵敏地标准化每个实验的介质(实验室生产的或从供应商购买的)的效力(即Wnt信号)。这种缺乏严谨性将给比较不同实验室内部和来自不同实验室的实验带来挑战。人们可以想象，在未来，一种类似于为cDNA微阵列开发的严格方法，使它们可重复应用于类器官系统。另一个有趣的转化到临床的视角包括iPSC中的基因编辑。使用基因校正的类器官进行组织替换将为精准医疗开辟一条全新的道路。就在最近，基于crispr的腺嘌呤编辑器纠正了囊性纤维化肠道类器官生物库中的无意义突变。190另一项研究通过证明iPSCs中特定囊性纤维化相关突变的恢复可以恢复肠道类器官功能来支持这些结果。202该技术的广泛应用对该领域的发展至关重要。

    Current limitations and future perspective of GI organoids. Current limitations of GI organoids include their inability to model multiorgan pathologies and their limited cellular diversity. Assembloids (organoids derived from spatially organising multiple cell types) will partially address these limitations and allow us in the future to better understand cell-to-cell communication and organ-cross-talk. Finally the mechanistic impact of the EMC on organoids and the batch-to-batch variations are limiting factors for translational approaches. Several attempts have been made to replace the current ECM by natural or synthetic ECMs. Organoids were derived from the small intestine (intestinal organoids) or biliary system (biliary organoids) of Rosa26.tdTomatoxVillinCre reporter mice. Organoids were either cultures alone, or as assembloids (middle panel). Representative pictures of organoid cultures are derived from the authors (unpublished, scale bars: 50 µm). ECM, extracellular matrix.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    GI类器官的当前限制和未来展望。目前GI类器官的局限性包括它们不能模拟多器官病理和它们有限的细胞多样性。组装体(来源于空间组织多种细胞类型的类器官)将部分解决这些限制，并使我们在未来更好地理解细胞间的通信和器官间的交叉对话。最后，电磁兼容对类器官的机制影响和批与批之间的差异是转化方法的限制因素。人们已多次尝试用天然或合成的ECM取代现有的ECM。类器官分别来源于小肠(肠类器官)或胆道系统(胆类器官)的Rosa26.tdTomatoxVillinCre记者老鼠。类器官要么单独培养，要么作为组合体(中间图)。类器官培养的代表性图片来自作者(未发表，比例尺:50µm)。ECM，细胞外基质。

    尽管仍然存在挑战，但人类类器官领域的快速技术改进将为改善人类健康提供前所未有的途径。在过去的10年里，类器官已经从基本的3D细胞集群系统发展到具有扩展的实验室生命周期，改进了高度复杂的多学科转化模型系统，包括最近的进展，如正向遗传建模、微流体力学生理刺激以及微工程平台，以实现物理和生物参数的自动化和持续监测。因此，其他学科为不同模型系统开发的技术和实验方案现在可以应用于人类类器官系统，这将提高再现性，改善功能读数，并提供增强的实验控制。

    伦理语句

    患者发表同意书

    伦理批准

    不适用。

    致谢

    所有的图形都是用BioRender.com创建的。我们进一步感谢Miriam Bittel, Heidrun Dorner, Iris Stolzer, Barbara Ruder和Laura Schickedanz提供了具有代表性的类器官图片。

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    脚注

    • 推特@MIB_GuentherLab, @Winner_Lab@WinnerLab

    • 贡献者CG, TS, MFN和BW撰写了论文。

    • 资金支持来自Johannes und Frieda Marohn-Stiftung (CG, BW)、巴伐利亚科学和艺术部在ForInter网络框架下的德国研究基金会、DFG WI 3567/2-1、270949263/GRK2162 (BW)、TRR241 (A02, CG)、FOR 2886 (A02, CG)、TRR305 (B08, CG)和DFG GU 1431/5-1。该大学的跨学科临床研究中心(IZKF)提供了进一步的支持Erlangen-Nürnberg (Jochen-Kalden资助计划N5)， 5U01 DK062413 U24 DK062429 R01 DK122790 R01 CA257523 (TS)。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 出处和同行评审委托;外部同行评审。