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摘要
客观的准确区分克罗恩病(CD)和UC对于确保早期和适当的治疗干预很重要。我们试图识别能够在新发IBD儿童中区分CD和UC的蛋白质。
设计粘膜活检取自治疗干预前接受基线诊断性内窥镜检查的儿童。使用基于细胞培养(SILAC)的氨基酸超稳定同位素标记方法，比较了99例儿童对照和CD和UC患者的活组织检查的蛋白质组。应用其中一个子集(n=50)的多变量分析来识别新的生物标志物，并在第二个子集(n=49)中进行验证。
结果在发现队列中，一组5种蛋白质足以区分对照与ibd感染组织活检，AUC为1.0 (95% CI 0.99至1.0);第二组12种蛋白质将炎症性CD和UC分开，AUC为0.95 (95% CI为0.86至1.0)。将这两个小组应用于验证队列，结果准确分类了95.9%的患者(IBD来自对照组)和80%的患者(CD来自UC)。共鉴定出116个与疾病严重程度相关的蛋白质，其中4个是两组的组成部分，包括内脏脂肪素和金属硫蛋白-2。
结论这项研究已经确定了两组用于IBD诊断和IBD亚型分化的候选生物标志物，以指导儿科患者进行适当的治疗干预。
- 炎症性肠病
- 克罗恩氏病
- 溃疡性结肠炎
- Ibd基础研究
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本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
克罗恩病(CD)和UC的准确诊断很重要，因此可以开始适当的治疗，以减少疾病进展，与永久性肠道损伤相关的疾病并发症，避免不必要的药物不良事件。
通过临床症状、疾病部位、是否存在肉芽肿、遗传学和目前的血清学检测进行鉴别均有局限性。
蛋白质组学分析是评估生物系统定量和定性数据的有力工具。
新的发现是什么?
一项来自IBD患者初始队列的无偏倚蛋白质组学活组织检查筛查，确定了一组可用于区分CD患者与UC患者的蛋白质。
候选生物标志物表明，儿童CD中脂肪酸代谢升高，儿童UC中蛋白质代谢升高。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
将这些蛋白质生物标记物应用于临床，可以提高目前用于区分IBD亚型的方法的准确性，并在短时间内做到这一点。进一步了解儿科IBD的发病机制也可能实现。
简介
IBDs是一种慢性、复发和缓解的胃肠道炎症疾病，影响着全球400多万人。1在加拿大，有超过23万人患有IBD，每年还有1万例确诊病例。2IBD包括克罗恩病(CD)和UC，其临床表现和并发症不同，对治疗可能有不同的反应。3 - 5儿科患者占IBD人群的10%-25%，6，7通常表现出与成年IBD患者不同的特征，并且具有更强的侵袭性和更广泛的疾病，以及更长期的严重后果。4 - 8很少有儿童有所谓的经典症状，而是有一系列的表现特征，包括非典型症状，如身材矮小或体重减轻，导致识别和诊断延迟。9通常，乳糜泻的特点是粘膜和粘膜下病变，可发生在整个胃肠道的任何地方，本质上是透壁的。相反，UC从直肠近端延伸，伴有连续的，但通常是浅表炎症。然而，UC的非特异性胃受累、直肠相对保留和阑尾周围斑块受累10可增加诊断的混乱和疾病的错误分类。鉴别诊断对于诱导和维持适当的治疗是很重要的，这在CD和UC之间是不同的。在儿科人群中，纯肠内营养是一种有效的诱导治疗CD，但不是UC。11对于维持疗法，甲氨蝶呤是针对乳糜泻的，12但对加州大学来说，13而美沙拉嗪不是。14此外，与疾病相关的并发症也有很大不同。对于那些对治疗没有反应的不幸患者，手术选择是非常不同的，UC手术提供了UC疾病过程的结束，并有机会形成储层和重建肠道连续性。对于乳糜泻，由于胃肠道其他部位复发的可能性非常大，除非疾病并发症需要手术，否则一般不建议手术切除发炎粘膜的发炎部分。因此，无论是考虑治疗方案还是讨论结果，正确的诊断都是有效治疗IBD的重要因素。
全基因组关联研究已经确定了近170个与IBD相关的易感位点，包括许多在CD和UC中重叠的位点，15 - 17日然而，这些变异导致的疾病表现不到15%。17生物标记物已被用于补充目前的IBD诊断工具，如内镜、成像和组织学，以减少IBD的模糊诊断，协助亚型分化，并提供疾病的客观测量。先前的研究已经确定了血清或粪便中升高并可测量的蛋白质;3.然而，这些蛋白质被发现在儿童人群中更明显的乳糜泻或UC病例中表现最好。18，19血清检测的针对中性粒细胞或细菌成分的抗体往往具有低敏感性(真阳性率<50%;综述了20.)．其他生物标志物，即粪便钙保护蛋白，在临床上可用于从无粘膜炎症的人群(如IBS，健康对照组)中识别IBD患者，但不能区分IBD亚型。21此外，粪便中的钙保护蛋白不足以区分轻度、中度或重度疾病，19这对于决定适当的治疗干预是很重要的。考虑到目前遗传和蛋白质标记物的局限性，IBD在儿科人群中的非典型表现和进展，显然需要新的生物标记物和方法来快速准确地诊断CD和UC。
为了识别新的蛋白质生物标志物，蛋白质组学方法已应用于成年IBD患者的血清、细胞或组织分离物。22这些早期研究的结果表明蛋白质组学在生物标志物选择中的有用性，但由于缺乏初始队列和患者治疗方法的差异而受到限制23-28以及无法识别分化蛋白(使用MALDI/表面增强激光解吸/电离(SELDI))，25，26，29或者是低通量(二维凝胶)。24，27，30.在本研究中，我们通过采用定量、高通量蛋白质组学方法来评估和比较99例(39例对照组，30例CD, 30例UC)未接受治疗的儿童在诊断为IBD时的升结肠活组织检查，从而克服了这些局限性。我们首次对儿科活检进行了蛋白质组学分析，旨在识别候选生物标志物，以帮助准确的IBD亚诊断。
材料与方法
研究设计
我们进行了一项横断面研究，其设计在网上有图形概述补充图S1。蛋白质组数据方差<2.0的患者活组织检查，在发现和验证阶段使用性别和诊断的平衡分层方法随机分为相等的组(WinPepi, BixtonHealth.ca等)。该研究得到了安大略省东部儿童医院(CHEO)研究伦理委员会的批准。研究数据通过CHEO研究所托管的研究电子数据捕获(REDCap)收集和管理。REDCap是一个安全的，基于web的应用程序，旨在支持数据捕获的研究。31
研究人群
所有年龄在18岁以下并计划在2011年10月至2015年2月期间接受诊断性结肠镜检查的患者都被认为符合招募条件。排除标准，与已知影响肠道微生物组和粘膜基因表达的条件相关，包括(1)体重指数>年龄的第95百分位;(2)糖尿病(胰岛素和非胰岛素依赖型);(3)过去2个月内曾患传染性肠胃炎或(4)过去4周内曾使用抗生素、益生菌或免疫调节剂。经过全面的临床、微生物学、内窥镜、组织学和放射学评估，所有IBD病例均符合UC或CD的标准诊断标准。32疾病的表型基于内窥镜检查和放射学检查结果以及IBD蒙特利尔分类的巴黎修订。33使用小儿克罗恩病活动指数(PCDAI)测定CD或UC的临床疾病活动性34或儿童UC活动指数(PUCAI)，35分别。由于升结肠和回肠末端是乳糜泻最常见的部位，而结肠炎在UC患儿中占主导地位，36选择升结肠作为粘膜活检的部位，以消除肠道活检的混淆因素。因此，仅患有IBD且获得了受影响/炎症的升结肠(CoA)活检的患者被纳入了蛋白质组学研究。在可能的情况下，这些患者的活组织切片也取自非炎症的升结肠(CoN)。相比之下，对照组患者只有非炎症活检，他们的宏观和组织学黏膜正常，没有任何已知的慢性肠道疾病的诊断。
样品采集与处理
详细的方法在网上提供补充材料和方法。简单地说，冷冻的活组织切片用机械均质法裂解，离心后分离出蛋白质。样品蛋白与等量的同位素标记的参考蛋白裂解液相结合，以允许蛋白质的相对定量。蛋白质的胰蛋白酶消化是通过过滤辅助样品制备进行的，37并在Orbitrap Elite质谱仪(MS)上分析所得的肽。
统计分析和验证
所有MS原始文件都在MaxQuant V.1.5.1的单次运行中分析，针对人类Uniprot数据库(下载2014/07/11)。采用Perseus、Excel (Microsoft)、Prism (Graphpad)软件进行数据过滤和统计分析。对质谱数据进行质量评估(见在线)补充方法)，以及用稳健回归和离群值确定的离群值38被从研究中移除。
在≥95%的活检(Q95)中，通过≥2个独特肽定量的蛋白质被确定，与至少一个其他亚组(<50%的亚组活检)相比，由于在一个亚组(> - 70%的亚组活检)中过度代表性，因此被认为是亚组特异性的蛋白质。为了限制缺失数据的影响，只使用来自Q95+亚群特异性蛋白的数据进行主成分分析(PCA;Matlab)和候选生物标志物鉴定。
疾病分类的数学模型(对照与IBD CoA;CD CoA和UC CoA是在ROC曲线探索者和测试仪(rocet)中开发的。39使用来自患者子集(发现队列)的蛋白质组学数据，并使用来自剩余患者(验证队列)的数据证实模型。具体来说，队列分配后，确定发现队列的Q95和亚群特异性蛋白质，并在rocet的Explorer模块中使用偏最小二乘判别分析(PLSDA)、支持向量机(SVM)和随机森林(RF)对相关蛋白质组学数据进行评估。39最终，在所有三个模型中普遍识别的蛋白质被认为是候选生物标志物，然后根据各自的ROC曲线下面积(Area Under the ROC Curve, AUC)值进行排名。生物标记物面板是在rocet的Tester模块中通过PLSDA模型迭代分析开发的，该模型采用步进法，候选生物标记物由蛋白质特异性AUC值(从最高的开始)添加。根据AUC的平台点选择纳入小组的最小蛋白质数量，以平衡特异性和敏感性。通过将验证队列数据应用于发现训练的PLSDA模型，对生物标志物面板进行独立验证。
将发现队列中的PCDAI或PUCAI评分与队列Q95+亚群特异性蛋白中的所有蛋白进行比较，以确定Pearson相关性(Graphpad, Prism)。路径分析使用DAVID (david.ncifcrf.gov)和Panther (Pantherdb.org)进行，并使用iPATH2交互式路径资源管理器(paths .embl.de)使用Uniprot登录号进行可视化。按照制造商的方案，将活检液稀释至最终浓度为0.08%的十二烷基硫酸钠(SDS)，对内脂素(Ezno生命科学公司，纽约，美国)和金属硫蛋白-2 (MT2)进行酶联免疫吸附测定(elisa)。
结果
描述性的特点
我们获得了100名接受诊断性结肠镜检查的儿童的升结肠活检补充表S1)。IBD患者(n=61)内镜检查时的平均年龄为13.6±0.4岁(范围4.8-17.8岁)，对照组(n=39)为14.3±0.5岁(范围6.1-17.6岁)，两组间具有可比性。质量评估后，一个受试者被认为是异常值，因此从生物信息学分析中移除。其余99例纳入患者的特征总结见表1(个人详情请参阅网上补充表S1)。对照组和UC患者的性别分布没有差异。被诊断患有乳糜泻的受试者更可能是男性而不是女性，这是儿科人群中乳糜泻的特征。40大多数CD患者(90%)有活动性炎症性结肠或回结肠疾病;86.7%的UC患者表现为全结肠炎。虽然CoA活检来自所有60例IBD患者，但由于疾病的广泛性质，CoN样本仅来自23/30 CD和2/30 UC患者。为了达到统计学意义，只分析了CD CoN活检。
完整蛋白质组数据集的评估
在15个月的时间内处理了124例活组织切片，并通过高效液相色谱电喷雾电离质谱/质谱(HPLC-ESI-MSMS)分析，以识别和量化不同疾病条件下表达差异的蛋白质。在线提供了MS数据质量的详细评估补充结果．一个受影响的(CoA) CD活检被确定为异常值(见在线)补充图S2A)，因此患者的CoA和CoN活检都从进一步的分析中移除。其余样本随时间显示一致的MS剖面(见在线补充图S2B-E)。
在分析的122例活检中，3644个蛋白质被≥2个独特肽识别，其中949个位于Q95中;另外225种蛋白质是亚群特异性的补充表S2)。对照和受影响(CoA) IBD蛋白质组通过PCA使用来自这1174个蛋白质的蛋白质组数据进行区分，而非炎症(CoN) CD蛋白质组更类似于对照组(图1)．即使当蛋白质被注释为参与免疫反应时，也获得了类似的分离补充表s S2和S3)被从数据集中删除(见在线补充图S3A)。与之前的研究一致，基于血液的参数不足以通过PCA将IBD与对照患者隔离补充图S3B)。
(A) Q95+亚群特异性蛋白的主成分分析(PCA)显示IBD炎性升结肠患者蛋白质组的分离(UC，红色;克罗恩病(CD，蓝色)来自对照(黑色)和非炎症性CD升结肠(CoN)(灰色)，基于Q95+亚群特异性蛋白。
生物标志物模型的建立
对照与受影响的IBD
对照与CoA IBD中Q95+亚群特异性蛋白(CoA CD和CoA UC联合;在网上看到的补充表S2)通过SVM, PLSDA和RF得到106个常见的候选生物标志物(见在线补充表S4)。通过PLSDA模型的逐步分析，AUC的峰值和稳定，用五种蛋白质观察特异性和敏感性(见在线补充图S5A)。这个由五种蛋白质组成的面板(表2)，其相对表达式载于图2A，在AUC为1.0 (95% CI 0.99至1.0)的情况下，足以将IBD患者与对照组区分开来，分类准确率为96% (图2值得注意的是，CD CoN活检中所有5种蛋白的相对表达均显著不同于对照和CD CoA，其中CoN表现为中间表达(见在线)补充图S6A)。
偏最小二乘判别分析(PLSDA)模型使用来自发现队列的数据进行训练，然后使用来自验证队列的数据进行测试。它们被用来分类对照组和IBD(炎症性升结肠活检)患者。(A) 5个候选生物标记物的相对表达水平(面板1)，以区分对照和IBD患者。(B)第1组接受发现队列(蓝色)和验证队列(粉红色)的工作特征(ROC)曲线和(C)使用第1组PLSDA模型进行分类的相关预测概述，其中左侧为0.5的患者可归为对照组，右侧为0.5的患者可归为IBD;来自发现组和验证组的个体患者样本的真实诊断分别以开放或封闭符号表示。(D)在发现和验证队列中，使用五种生物标志物区分IBD(紫色)与对照(黑色)人群的主成分分析。通过Student t检验，****p<0.0001，有统计学意义。
CD vs UC
从15个CD和15个UC发现队列蛋白质组中评估的蛋白质(见在线补充表S2)， 252常见于SVM, PLSDA和RF(见在线补充表S5)。通过PLSDA模型的逐步分析，在12种蛋白质上观察到特异性和敏感性的平台补充图S5B)，因此被确定为最佳分类所需的最小蛋白质数量。12种蛋白质的相对表达情况如下(图3值得注意的是，通过t检验，线粒体蛋白质三功能酶羟酰辅酶A脱氢酶/3-酮酰辅酶A巯基酶/烯酰辅酶A水合酶β亚基(HADHB)和三羧酸转运蛋白(SLC25A1)在CD和UC之间没有显著差异，尽管它们有助于该小组的特异性和敏感性(图3B). 12种蛋白质的面板(表3)导致总体AUC为0.95 (95% CI 0.86至1.0)(图3B)，敏感性和特异性分别为1.0 (95% CI 0.78 ~ 1.0)和0.933 (95% CI 0.68 ~ 1.0)， (表4)，只有一名病人分类错误(图3C)。正如对照和IBD面板蛋白所观察到的那样，在CD CoN活组织检查中，区分CD和UC的12种蛋白的相对表达在对照和CD CoA之间(见在线)补充图S7A)。
偏最小二乘判别分析(PLSDA)模型使用来自发现队列的数据进行训练，然后使用来自验证队列的数据进行测试，以从炎症升结肠活检中对克罗恩病(CD)和UC患者进行分类。(A)区分CD患者和UC患者的12个候选生物标志物的相对表达水平(图2)。(B)第2组接受发现队列(蓝色)和验证队列(粉红色)的工作特征(ROC)曲线和(C)使用第2组PLSDA模型进行分类的相关预测概述，其中左侧为0.5的患者将被分类为CD，右侧为0.5的患者将被分类为UC;来自发现组和验证组的个体患者样本的真实诊断分别以开放或封闭符号表示。(D)在发现和验证队列中，使用12个生物标志物区分CD(蓝色)和UC(红色)人群的主成分分析。采用Student's t检验，*p<0.05， **p<0.005，有统计学意义。
应用和性能评估的面板，以一个独立的验证队列
如上所述(见在线补充图S1)，生物标志物组PLSDA模型使用来自验证队列的蛋白质组学数据进行独立评估。ROC曲线(图2B)，应用于验证队列分类的第1组蛋白质的AUC为0.99 (95% CI 0.99至1.0)，49例患者中有47例(95.9%)被准确分类为对照组或IBD;相关预测概述(图2C)显示。使用5个panel 1蛋白的PCA显示对照和IBD CoA群体的良好分离(图2D，见在线补充图S6B)。相似地，图2中的12个蛋白质将CD CoA与UC CoA区分开来，AUC为0.86 (95% CI 0.72至1.0)(图3B、见网上补充图S7B)， 30例患者中有24例(80%)准确分类(图3C). 4例被误诊的CD患者均为回肠结肠疾病(Paris L3)，而2例UC患者为Paris E2和E4。值得注意的是，所有患有限制性结肠CD (Paris L2)的患者都被正确分类，这表明尽管这些患有CD和UC的患者之间存在共同的疾病定位，但生物标志物小组能够准确地区分患者。使用图2中的12个蛋白质进行的PCA显示CD和UC群体的良好分离(图3D).尽管与发现组相比，验证队列的敏感性和特异性降低(表4)，这些结果表明了生物标志物面板在IBD患者诊断和亚诊断中的效用。
候选生物标记物具有生物学相关性
通过通路分析来评估106个IBD和252个鉴别诊断候选生物标志物的功能作用。大多数将IBD与对照分离的蛋白质参与代谢过程，并主要在催化中发挥作用，特别是氧化还原酶活性(图4A、网上见补充表S6)。在IBD中发现的不同的典型途径与代谢有关(图4B;在网上看到的补充表s S6及S7)．特别是，CD中升高的蛋白质与脂肪酸代谢有关，而UC中升高的蛋白质在能量和氨基酸代谢中起作用(图4B)。
(A) 106个候选生物标记蛋白的生物学过程，有助于IBD从对照中分离。(B)不同IBD亚型的代谢途径;克罗恩病中上调的蛋白质(蓝线)与脂肪酸代谢和氧化磷酸化有关，而UC候选生物标志物中氨基酸和能量代谢升高(红线)。有一些重叠的路径显示(暗紫色线)。氨基酸代谢用单字母代码表示丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、精氨酸(R)、脯氨酸(P)、半胱氨酸(C)和蛋氨酸(M)。
与严重程度相关
在发现队列中的944个Q95+亚群特异性蛋白中，118个蛋白(12.5%)与PCDAI或PUCAI显著相关(图5一个;在网上看到的补充表S8)。PCDAI与83种蛋白质显著相关补充表S8)，其中10%是蛋白质泛素化途径的组成部分。相比之下，与PUCAI相关的43个蛋白质中有10%是雷帕霉素信号通路哺乳动物靶标的组成部分。15个CD相关蛋白和9个uc相关蛋白由HNF4A调节，HNF4A在儿科人群中被确定与CD相关41是UC易感性位点。42在118个显示与严重程度相关的蛋白质中，39个蛋白质被确定为生物标志物候选，其中4个位于生物标志物组中。在图1中，内脏脂肪素和无机磷酸酶的相对表达量均与乳糜泻严重程度显著相关(图5B, C)。同样，面板2蛋白MT2的相对表达与乳糜泻严重程度相关(图5D)，而异质核核糖核蛋白H3 (HNRNP H3)与UC严重程度呈负相关(图5E).之前的一项研究发现，成人IBD活检中MT2与炎症分级之间存在相关性;43其他三种蛋白质与疾病严重程度的相关性是一个新发现。
(A)通过对儿童克罗恩病活性指数(PCDAI)或儿童UC活性指数(PUCAI)评分与Q95蛋白+亚群特异性蛋白进行Pearson相关性分析，得出克罗恩病(CD)(蓝色)或UC(红色)患者中与疾病严重程度相关的蛋白数量的维恩图。(B - E)显示了(B和C) IBD与控制组、(D和E) CD与UC组中与严重程度评分显著相关的蛋白质相对表达的散点图。
内脏脂肪素和MT2的elisa检测结果与蛋白质组学数据一致
为了将我们的研究结果转化为临床环境，我们通过ELISA从验证队列患者活检样本中测量了两个候选生物标志物的绝对数量(每个组一个)。24份样本中有23份(95.8%)的内脏脂肪素含量在检测限内。蛋白质组学测定发现队列中内脏脂肪素的相对数量(图1C)与验证队列ELISA数据一致(图6A)，在IBD患者中显著增加。值得注意的是，通过配对分析，在CD CoN和CoA活检之间，内脏脂肪素的数量没有显著差异补充图S6C)。在ELISA检测的所有验证队列样本中，MT2均被量化，CD患者的MT2明显高于UC患者(图6B).与发现队列蛋白质组学数据一致，验证队列的ELISA结果显示，中重度CD患者MT2的绝对量与PCDAI之间存在相关性(PCDAI>30) (图6C).由于轻度乳糜泻患者数量有限，我们无法确定与MT2水平有任何关联。与来自CD患者的配对CoA样本相比，CoN样本中的绝对MT2水平没有显著差异(见在线)补充图S7C)。
(A)在验证队列的一个子集中，由酶联免疫吸附试验(ELISA)确定的每毫克活检蛋白内脂素含量。(B)在验证队列的一个子集中，ELISA测定每毫克活检总蛋白中金属硫蛋白-2 (MT2)的含量。(C)在克罗恩病(CD)验证队列的一个子集中，elisa测定的MT2量与相应的患者儿童克罗恩病活动指数(PCDAI)评分之间的相关性。对照组、乳糜泻患者和UC患者各8例。
讨论
IBD亚型的准确分类仍然是一个重大的临床挑战，特别是在临床特征不太明显且可能随时间变化的儿科人群中。44，45在这里，我们评估了99名儿科患者在诊断时和治疗干预前的活组织检查的蛋白质组，以发现和验证潜在的蛋白质生物标志物。
我们量化了超过3500种蛋白质，并确定了5种足以区分IBD和对照组患者的蛋白质，以及12种区分CD和UC的蛋白质，准确率为>80% (表4)．在我们的研究中，所有候选生物标记物在≥95%的患者活检中被量化，这与在有限数量的患者(范围为2%-85%)中确定的测量炎症或微生物成分抗体的疾病标记物(例如，核周抗中性粒细胞细胞质抗体(pANCA)，抗酿酒酵母抗体(ASCA)， CBir1)形成对比。46本模型的性能(表4)大于通常用于难以诊断病例的血清学小组，尽管在儿科队列中敏感性为0.67，特异性为0.76。18
目前血清和粪便生物标志物诊断IBD的选择性较低，临床应用有限。标准的血清学测试可以提供一般炎症的信息，但分别有21%和54%的轻度乳糜泻或UC的儿科患者，以及高达4%的中重度疾病测试与正常的血红蛋白、白蛋白、血小板和红细胞沉降率一样，47即使添加c反应蛋白(CRP)，改善也有限。48CRP和血红蛋白在区分IBD与非炎症性疾病方面具有实用价值21但不能区分IBD与其他炎症状态，也不能区分IBD亚型。49，50粪便钙保护蛋白在鉴别粘膜炎症和类似症状的情况方面表现良好，但本质上是非炎症性的，如IBS，但选择性适中。51在我们的研究中，活检相关的钙保护蛋白水平在两组之间没有显著差异。这可能反映了用于测量的样本收集的差异(组织与粪便)。
本文确定的候选生物标志物有助于多种生物过程，主要是代谢(图4)．图1和图2中的候选生物标记物都是脂肪酸代谢的组成部分，并且对IBD发病机制的贡献此前已得到确认。52在我们的研究中，我们发现与对照组患者相比，IBD患儿FABP5蛋白水平下降(表2)．先前在合并的成人IBD结肠标本中发现FABP在IBD患者中比对照组有更高的RNA表达，53而另一项研究发现炎症UC黏膜中L-FABP的RNA表达减少。54值得注意的是，我们发现与UC儿科患者相比，CD中脂肪酸代谢相关的蛋白质升高(图4)．与UC患者相比，CD患者白三烯A-4水解酶、三羧酸转运蛋白、三功能酶和delta(3,5)-delta(2,4)-二烯酰辅酶a异构酶均升高。白三烯A-4水解酶参与促炎介质白三烯B4的产生，后者先前被发现在活动性IBD患者的结肠中升高。55
能量代谢在IBD中也被改变，其中包括候选生物标志物无机焦磷酸酶，内脏脂肪素和udp -葡萄糖6-脱氢酶。保尔森等27显示UC患者炎症性结肠活检中无机焦磷酸酶升高，这与我们在儿科IBD活检中无机焦磷酸酶水平升高的发现一致。Waluga等56发现CD和UC患者血清中内脏脂肪素水平升高，CD患者治疗后内脏脂肪素水平降低。在我们的研究中，我们发现IBD患者活检中内脏脂肪素的升高，以及CD儿童活检中内脏脂肪素水平与PCDAI评分之间的相关性(图5B).虽然Waluga的研究没有发现内脏脂肪素水平与IBD活动的临床指标之间的相关性，56细胞外水平被发现与结直肠肿瘤的炎症指数相关。57与无机焦磷酸酶和内脏脂肪素不同，udp -葡萄糖6-脱氢酶以前没有与IBD相关。然而，该酶作用于内脏脂肪素活性下游的NAD+，是CD和UC患者结肠炎相关癌症风险的预测生物标志物。58
9种生物标志物面板蛋白不是代谢途径的组成部分，但在金属、蛋白质和RNA的结合和运输中发挥作用。细胞溶胶氨基肽酶，在我们的研究中发现，与UC相比，CD中细胞溶胶氨基肽酶升高(表3)，之前已被无标签蛋白质组学确定，与UC患者和对照组患者相比，CD患者中表达更高。23有趣的是，在一组成年UC患者中，该蛋白的血清水平并没有升高，但作者指出，应该对结肠样本进行进一步的检测。59在多项研究中观察到，IBD中金属硫蛋白的相对表达似乎取决于研究特异性因素，包括分离部位和治疗干预。60与我们观察到的相对MT2水平与PCDAI (图5D和6C)，在成人IBD活检中显示炎症等级与金属硫蛋白之间的相关性。43此外，在小鼠模型中，金属硫蛋白的细胞外抗体阻塞导致结肠炎的减少，43提示该候选生物标志物对疾病发病机制的贡献。血清转铁蛋白水平和转铁蛋白受体的循环形式是儿科IBD患者贫血的指标。61因此，与UC患者相比，CD患者中转铁蛋白受体蛋白-1水平升高，而UC患者中血清转铁蛋白水平高于CD患者(图3有趣的是，血清转铁蛋白在对英夫利昔单抗治疗无反应的成年CD患者中被发现升高。62亮氨酸PPR基序含蛋白、Sec61a1、葡萄球菌核酸酶结构域含蛋白、HNRNP H3和β-2微球蛋白此前未被证实与IBD有关。在正在进行的蛋白质组学分析中，将评估这些和其他非生物标记蛋白对IBD发病机制的贡献的进一步特征。虽然本文提出的生物标志物研究仅限于Q95(以确保识别出广泛适用的生物标志物)，但在未来的研究中，我们将评估所有与对照组不同或在一开始就不同于IBD亚型的蛋白质，以及在治疗干预后在同一患者中发生变化的蛋白质。
总的来说，我们已经从therapy-naïve患者的初始疾病样本中的炎症组织中确定了候选生物标志物。在第1组和第2组中鉴定的蛋白质在≥95%的儿科队列中被量化，表明在初始内窥镜检查时可用于诊断。虽然先前有一些面板1和2蛋白与IBD有关，但在本研究中，我们展示了这些蛋白一起作为IBD的生物标志物的效用，重要的是，对于CD和UC的分化。该小组能够以80%的准确率对患者人群进行分类。在这一阶段，鉴定出的蛋白质反映了相对变化;需要进一步的工作将这些发现转化为临床环境，特别是开发蛋白质绝对量化的方法和开发适当的多变量疾病分类预测模型。ELISA对内脏脂肪素和MT2的评价以及MS数据的验证，增强了将这一知识相对容易地应用于临床的可能性。我们的IBD和对照组为亚急性和慢性疾病患者。我们还没有将这些分析应用于那些患有急性自限性感染性结肠炎或其他可能在肠道其他地方发现的炎症疾病，如腹腔疾病。然而，在本文中，我们已经确定了能够在开始时对亚急性到慢性疾病表现的儿科患者进行亚诊断的生物标志物。 The use of an inception cohort is an important distinction of this study, and increases the applicability of these findings from studies that have searched for disease biomarkers from patients undergoing treatment. The application of these panels of proteins for use as biomarkers could enable for differential diagnosis of IBD subtypes to permit for appropriate therapeutics.
致谢
作者要感谢A. Mack的贡献，使这项研究可行。
参考文献
脚注
贡献者AES、C-KC、WM、DRM、AS、DF参与研究设计。RS、EIB和DRM进行患者登记、患者诊断、样本分离和临床数据收集;AES、SAD和C-KC进行实验工作;AES、SAD、DRM、EIB、ZN、XZ、MW、DF均参与结果解释。AES和DF起草了手稿。所有作者都已阅读并参与了最终论文的关键修订。
资金本研究部分由加拿大政府通过加拿大基因组和安大略省基因组研究所(OGI-067)， CIHR资助号GPH-129340, CIHR资助号MOP-114872和安大略省经济发展和创新部(REG1-4450)支持。作者还感谢IBD基金会、加拿大克罗恩病和结肠炎(CCC)、东安大略省研究所儿童医院和渥太华大学医学院的资助。EIB获得了加拿大儿童健康临床科学家项目的职业发展奖，以及CIHR、CCC和加拿大胃肠病学协会的新研究者奖的支持。DF是加拿大蛋白质组学和系统生物学研究主席。REDCap由临床和转化科学奖(CTSA)拨款(UL1 TR000448)和Siteman综合癌症中心和NCI癌症中心支持拨款P30 CA091842支持。
相互竞争的利益没有宣布。
病人的同意获得的。
伦理批准伦理批准由安大略省东部儿童医院的研究伦理委员会提供。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。
数据共享声明蛋白质组学数据将通过ProteomeXchange提供。